一种分离纯化高纯度猪圆环全病毒疫苗的层析方法与流程

本发明涉及疫苗分离纯化领域，具体涉及一种分离纯化高纯度猪圆环全病毒疫苗的层析方法。

背景技术

猪圆环病毒有两个血清型pcv-1和pcv-2，其中pcv-1为非致病性的病毒，pcv-2为致病性的病毒，是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。近年来，随着动物疫苗在疾病预防中的地位日益重要，很多企业把研究力量投入到新的疫苗生产工艺上，对疫苗质量要求也日益提高。猪圆环疫苗评价指标中，除抗原含量外，应激反应是另一重要指标。猪圆环全病毒疫苗多采用微载体悬浮培养的方式来获得高滴度病毒，灭活后得到全病毒疫苗。现有分离纯化猪圆环全病毒的生产工艺为凝胶过滤层析，根据病毒颗粒与杂质分子量的差异，采用4ff或6ff等凝胶过滤介质进行组分分离，从而达到分离猪圆环全病毒目的。凝胶过滤介质的层析工艺回收率约为80％，缺点是纯化前需将抗原进行20倍以上的浓缩且浓缩过程中抗原损失约为20％；层析填料用量大，上样量不能超过层析介质体积的10％，纯化效率非常低，纯化成本较高。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效低成本的分离纯化高纯度猪圆环全病毒疫苗的层析方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种分离纯化高纯度猪圆环全病毒疫苗的层析方法，包括以下步骤：

s1:将悬浮培养的猪圆环全病毒收获液离心，取上清经孔径为0.45μm的滤膜过滤，调节滤液ph，得到待纯化样品液；

s2:将待纯化样品液经阴离子交换层析，得到高纯度猪圆环全病毒疫苗。

进一步，所述步骤s1中滤液的ph为6～9。

进一步，所述阴离子交换层析为强阴离子交换层析。

进一步，所述强阴离子交换层析使用的填料为qfocurose6ff、qfocurose6xl、qfocurosehpr或qfocurosehpl。

进一步，所述离子交换层析的具体步骤为：

s21:采用10～15倍柱体积的ph为6～9的50mm的磷酸盐缓冲液,以1～2ml/min的流速平衡层析柱；

s22：以步骤s1提取的待纯化样品液作为上样样品，其中样品电导为5～15ms/cm，上样完成后用ph为6～9的50mm的磷酸盐缓冲液清洗，流速为1～2ml/min，所收集的流穿液即为高纯度猪圆环全病毒疫苗；

s23：用含有1mnacl的ph为6～9的磷酸盐缓冲液以1～2ml/min的流速洗脱，所收集的洗脱液即为杂质蛋白、色素和内毒素等。

本发明的优点：本发明的分离纯化高纯度猪圆环全病毒疫苗的层析方法根据猪圆环全病毒和杂质的分子量大小、等电点等较大差异将猪圆环全病毒中的杂质蛋白、色素和内毒素等杂质吸附于大孔径阴离子层析介质，猪圆环全病毒通过上柱直接流穿，一步纯化得到猪圆环全病毒。本发明的层析方法上样量为传统凝胶过滤层析的数百倍，纯化效率提高了数百倍，降低了层析介质的使用量和层析设备的规格，节省了大量生产成本；本发明的层析方法对上游悬浮培养工艺稳定性要求低，直接通过调整样品中的电导和ph在一定范围内保持下游纯化工艺稳定性；本发明的层析方法工艺简单稳定，易于快速放大生产。

附图说明

图1为本发明实施例1的纯化图谱图；

图2为本发明实施例2的纯化图谱图；

图3为本发明实施例3的纯化图谱图；

图4为本发明实施例4的纯化图谱图；

图5为本发明实施例5的纯化图谱图。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

将悬浮培养的猪圆环全病毒收获液在25℃，11500rpm离心20min，取上清经孔径为0.45μm的滤膜过滤，用0.2m的hcl调节ph值至6.0得到待纯化的样品液。选择5ml的qfocurose6ff离子交换预装柱，配制ph为6的50mm的磷酸缓冲液作为平衡缓冲液和清洗缓冲液，配制ph为6的含有1mnacl的磷酸缓冲液做洗脱缓冲液。

用10～15倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，直到其ph值和电导值无变化，取100ml待纯化的样品液作为上样样品上样，并用清洗缓冲液进行清洗，收集的流穿液即为高纯度猪圆环全病毒疫苗。然后用10～15倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集的洗脱液即为杂质蛋白、色素和内毒素等，全程流速为1ml/min。

用aktapure检测得到纯化图谱。

分别取待纯化的样品液和纯化得到的高纯度猪圆环全病毒疫苗检测蛋白浓度，计算蛋白去除率；并用elisa法检测猪圆环全病毒的浓度，计算该层析方法的回收率。

实施例2

将悬浮培养的猪圆环全病毒收获液在25℃，11500rpm离心20min，取上清经孔径为0.45μm的滤膜过滤，用0.2m的hcl调节ph值至6.0得到待纯化的样品液。选择5ml的qfocurose6xl离子交换预装柱，配制ph为6的50mm的磷酸缓冲液作为平衡缓冲液和清洗缓冲液，配制ph为6的含有1mnacl的磷酸缓冲液做洗脱缓冲液。

用10～15倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，直到其ph值和电导值无变化，取100ml待纯化的样品液作为上样样品上样，并用清洗缓冲液进行清洗，收集的流穿液即为高纯度猪圆环全病毒疫苗。然后用10～15倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集的洗脱液即为杂质蛋白、色素和内毒素等，全程流速为1ml/min。

用aktapure检测得到纯化图谱。

分别取待纯化的样品液和纯化得到的高纯度猪圆环全病毒疫苗检测蛋白浓度，计算蛋白去除率；并用elisa法检测猪圆环全病毒的浓度，计算该层析方法的回收率。

实施例3

将悬浮培养的猪圆环全病毒收获液在25℃，11500rpm离心20min，取上清经孔径为0.45μm的滤膜过滤，用0.2m的hcl调节ph值至6.0得到待纯化的样品液。选择5ml的qfocurosehpr离子交换预装柱，配制ph为6的50mm的磷酸缓冲液作为平衡缓冲液和清洗缓冲液，配制ph为6的含有1mnacl的磷酸缓冲液做洗脱缓冲液。

用10～15倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，直到其ph值和电导值无变化，取100ml待纯化的样品液作为上样样品上样，并用清洗缓冲液进行清洗，收集的流穿液即为高纯度猪圆环全病毒疫苗。然后用10～15倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集的洗脱液即为杂质蛋白、色素和内毒素等，全程流速为1ml/min。

用aktapure检测得到纯化图谱。

分别取待纯化的样品液和纯化得到的高纯度猪圆环全病毒疫苗检测蛋白浓度，计算蛋白去除率；并用elisa法检测猪圆环全病毒的浓度，计算该层析方法的回收率。

实施例4

将悬浮培养的猪圆环全病毒收获液在25℃，11500rpm离心20min，取上清经孔径为0.45μm的滤膜过滤，用0.2m的hcl调节ph值至6.0得到待纯化的样品液。选择5ml的qfocurosehpl离子交换预装柱，配制ph为6的50mm的磷酸缓冲液作为平衡缓冲液和清洗缓冲液，配制ph为6的含有1mnacl的磷酸缓冲液做洗脱缓冲液。

用10～15倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，直到其ph值和电导值无变化，取100ml待纯化的样品液作为上样样品上样，并用清洗缓冲液进行清洗，收集的流穿液即为高纯度猪圆环全病毒疫苗。然后用10～15倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集的洗脱液即为杂质蛋白、色素和内毒素等，全程流速为1ml/min。

用aktapure检测得到纯化图谱。

分别取待纯化的样品液和纯化得到的高纯度猪圆环全病毒疫苗检测蛋白浓度，计算蛋白去除率；并用elisa法检测猪圆环全病毒的浓度，计算该层析方法的回收率。

实施例5

将悬浮培养的猪圆环全病毒收获液在25℃，11500rpm离心20min，取上清经孔径为0.45μm的滤膜过滤，用0.2m的hcl调节ph值至7.0得到待纯化的样品液。选择5ml的qfocurosehpl离子交换预装柱，配制ph为7的50mm的磷酸缓冲液作为平衡缓冲液和清洗缓冲液，配制ph为7的含有1mnacl的磷酸缓冲液做洗脱缓冲液。

用10～15倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，直到其ph值和电导值无变化，取100ml待纯化的样品液作为上样样品上样，并用清洗缓冲液进行清洗，收集的流穿液即为高纯度猪圆环全病毒疫苗。然后用10～15倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集的洗脱液即为杂质蛋白、色素和内毒素等，全程流速为1ml/min。

用aktapure检测得到纯化图谱。

分别取待纯化的样品液和纯化得到的高纯度猪圆环全病毒疫苗检测蛋白浓度，计算蛋白去除率；并用elisa法检测猪圆环全病毒的浓度，计算该层析方法的回收率。

检测结果

表1为实施例1-5的蛋白去除率以及猪圆环全病毒疫苗的回收率。

用本发明的层析方法病毒回收率高于传统浓缩并凝胶过滤层析方法的70％的回收率，蛋白去除率90％以上，并且上样量可以达到传统方法的数百倍。

图1-图5分别为实施例1-实施例5的纯化图谱，洗脱液出现e1和e2两个杂质洗脱峰。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。