利用微流控细胞培养检测人免疫细胞抗肿瘤能力的方法与流程

本发明属于，涉及微流控技术，尤其是一种利用“微流控-人体环境”模拟技术检测人体免疫细胞抗肿瘤能力的方法。

背景技术：

癌症是目前影响人类健康的恶性肿瘤，其治愈困难且致死率高，且其发展早期基本不会被发现，因此对人类肿瘤细胞的状态及免疫细胞的抗肿瘤能力的检测至关重要。肿瘤标志物是指在肿瘤的发生和发展过程中，患者体内产生的反映肿瘤存在和生长的一类物质，目前肿瘤标志物水平的检测对肿瘤辅助诊断及判断肿瘤预后、转归、评价疗效也都表现出了重要的意义，而关于人体白细胞只能检测其各个亚群的数量，却不能得出其活性的强弱。因而这些检测手段并不能体现机体免疫细胞的抗肿瘤活性，不能对肿瘤的预防起到积极的作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种利用“微流控-人体环境”模拟技术检测人体免疫细胞抗肿瘤能力的方法，该检测方法可有效检测出人体免疫细胞对各种肿瘤细胞的作用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种利用微流控细胞培养检测人免疫细胞抗肿瘤能力的方法，首先培养肿瘤细胞，再将人体新分离出的白细胞与肿瘤细胞混合，通过微流控细胞芯片提供细胞生存所需要的培养条件，而后置于光学显微镜下观察两种细胞的相互作用，得出人体免疫细胞的抗肿瘤能力。

而且，所述的肿瘤细胞包括人乳腺癌细胞、人肺癌细胞、人结直肠癌细胞、人胃癌细胞、人甲状腺癌细胞、人肝癌细胞、人食管癌细胞、人白血病细胞。

而且，所述的培养肿瘤细胞的方法是将生长状态良好的肿瘤细胞放入肿瘤细胞培养基中，置于36～38℃、5％co2的恒温培养箱中过夜。

而且，所述的肿瘤细胞培养基为rpmi-1640完全培养基或dmem培养基或mem培养基或f12培养基。

而且，所述的白细胞的分离方法是取新鲜的血液，利用红细胞裂解液除去红细胞，生理盐水洗涤，最后用白细胞培养基重悬，使细胞密度为1×10⁶～3×10⁶个/ml，得到白细胞悬液。

而且，所述的白细胞培养基与肿瘤细胞培养基相同。

具体步骤如下：

(1)生长状态良好的肿瘤细胞导入培养板的细胞培养区域中，然后添加培养基到相应的孔中，将此培养板置于37℃、5％co2的恒温培养箱中过夜；

(2)取新鲜的血液，利用红细胞裂解液除去红细胞，生理盐水洗涤，最后用培养基重悬，得到白细胞悬液；

(3)将白细胞导入肿瘤细胞培养基中，使白细胞和肿瘤细胞混合均匀，然后将培养板连到微流控细胞芯片主机上，由该机器提供细胞事宜的培养环境；

(4)对培养板中的细胞培养区域在倒置荧光显微镜下进行连续拍照，观察不同时间白细胞和肿瘤细胞的状态。

(5)根据白细胞攻击肿瘤细胞的速度和数量，得出相应的人白细胞抗肿瘤能力的强弱。

本发明的优点和积极效果是：

本发明针对现有的肿瘤相关检测手段中缺少对人体白细胞抗肿瘤能力的检测等不足，高效综合利用了现代先进的仿人体环境技术及实时检测技术，对肿瘤细胞和白细胞共培养，从而检测出免疫细胞的抗肿瘤能力，可在肿瘤的预防和治疗过程中起到重要的作用。

附图说明

图1为人乳腺癌细胞mcf-7正常培养随时间变化比较图；

图2为1号志愿者白细胞与人乳腺癌细胞mcf-7共培养随时间变化比较图；

图3为2号志愿者白细胞与人乳腺癌细胞mcf-7共培养随时间变化比较图；

图4为3号志愿者白细胞与人乳腺癌细胞mcf-7共培养随时间变化比较图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1

将人乳腺癌细胞mcf-7细胞消化，调密度至1×10⁶个/ml，加20μl到m04s培养板中，置于37℃、5％co2恒温培养箱中预培养过夜，使其呈贴壁生长状态。将不同志愿者的白细胞分离，且用rpmi1640培养基重悬，然后导入预培养好的m04s细胞培养区域中，同时在培养基添加孔加入适量的培养基，以提供白细胞和肿瘤细胞运动所需的能量。将此培养板连入微流控细胞芯片设备，置于倒置荧光显微镜下，设置好相关的参数后进行连拍，然后通过对结果进行分析得出不同的志愿者的白细胞抗肿瘤能力的强弱。

根据实验结果，对各组实验每50min选出一张照片进行比较，共16张，具体结果如下：

图1为人乳腺癌细胞mcf-7正常培养随时间变化比较图，从图1可以看出，mcf-7细胞在rpmi1640完全培养基中生长状态良好，细胞呈椭圆形贴壁生长，在有丝分裂过程中会有一段时间变圆，分裂完成后又继续贴壁生长，细胞处于对数生长期，在750min时，细胞数量几乎增加了一倍。

图2为1号志愿者白细胞与人乳腺癌细胞mcf-7共培养随时间变化比较图，从图2可以看出，1号白细胞遇到肿瘤细胞后，迅速对其进行吸附和攻击，共培养350min时，已经有部分肿瘤细胞发生了凋亡，细胞膜出现褶皱，随着时间的增加，凋亡的肿瘤细胞数量也随着增加，在共培养750min时，已经大部分肿瘤细胞都出现了凋亡现象，几乎未见可正常贴壁生长增殖的mcf-7细胞，说明该白细胞对mcf-7肿瘤细胞具有较强的杀伤作用。

图3为2号志愿者白细胞与人乳腺癌细胞mcf-7共培养随时间变化比较图，由图3可以看出，2号白细胞遇到肿瘤细胞后，并不能有效地对其进行吸附和攻击，共培养50min时，可见大量的白细胞与肿瘤细胞相遇，随着时间的延长，大部分白细胞因不能吸附肿瘤细胞而离开，只有少量的白细胞对肿瘤细胞进行攻击，但是即使到了共培养750min时，mcf-7肿瘤细胞几乎未见明显的凋亡现象，而视野中的白细胞几乎消失不见，结果表明2号白细胞对mcf-7肿瘤细胞的识别和杀伤作用较弱，并不能有效地对该肿瘤细胞发挥细胞毒作用。

图4为3号志愿者白细胞与人乳腺癌细胞mcf-7共培养随时间变化比较图，由图4可以看出，3号白细胞与2号白细胞活性类似，当遇到肿瘤细胞后，并不能有效地对其进行吸附和发动攻击。共培养50min时，视野中可见大量的白细胞和适量的肿瘤细胞，说明白细胞和肿瘤细胞的添加量没有问题。共培养750min时，mcf-7肿瘤细胞同样仍未见明显的凋亡现象，而视野中的白细胞几乎消失不见，结果表明3号白细胞对mcf-7肿瘤细胞的识别和杀伤作用较弱，并不能有效地诱导该肿瘤细胞发生凋亡。

检测结果表明，与不加白细胞的人乳腺癌细胞mcf-7细胞相比，1号白细胞对该肿瘤细胞的抑制作用最强，可有效识别攻击并诱导其发生凋亡，而2号和3号白细胞活性相近，对mcf-7有较弱的抑制增殖作用，不能诱导其发生凋亡。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：

技术总结
本发明涉及一种利用微流控细胞培养检测人免疫细胞抗肿瘤能力的方法，首先培养肿瘤细胞，再将人体新分离出的白细胞与肿瘤细胞混合，通过微流控细胞芯片提供细胞生存所需要的培养条件，而后置于光学显微镜下观察两种细胞的相互作用，得出人体免疫细胞的抗肿瘤能力。本发明针对现有的肿瘤相关检测手段中缺少对人体白细胞抗肿瘤能力的检测等不足，高效综合利用了现代先进的仿人体环境技术及实时检测技术，可在肿瘤的预防和治疗过程中起到重要的作用。

技术研发人员：刘安军;张宏亮
受保护的技术使用者：庆云堂生物科技（北京）有限公司
技术研发日：2018.09.04
技术公布日：2019.02.01