本发明属于基于ch3-hs疏水结构域液相表征特性锚定dna甲基化特异位点的电化学分析，尤其涉及一种dna甲基化特异位点的电化学分析方法。
背景技术：
：：目前，业内常用的现有技术是这样的：dna甲基化是表观遗传最基本的修饰方式，由于其对细胞分化、胚胎发育、遗传性疾病和肿瘤发生等基因表达和沉默的调控作用，dna甲基化已成为继限制性片断多态性、dna点突变之后最具价值的第三代遗传标记。国内外研究已相继将肺癌cdkn2a、肝癌arid2、结肠癌cdkn2a、白血病hoxa10等基因甲基化鉴定为肿瘤发生的早期标志，且发现了多发性硬化症、地中海贫血等遗传性疾病，和包括i型糖尿病等在内的自身免疫性疾病特征性的靶基因甲基化。随着表观遗传全基因组甲基化图谱(epigenomicsroadmapprogram)的绘制完成，更多甲基化标记将应用到基因表观紊乱和恶性肿瘤的早期诊断中。dna甲基化分析已成为遗传性疾病、自身免疫性疾病等基因表观紊乱疾病临床诊断和肿瘤早期预警的新手段，dna甲基化临床适宜检测技术研究已成为实验医学与表观遗传学交叉研究的前沿领域。dna序列特定碱基携带甲基ch3-是dna甲基化的分子本质，检测某一序列是否存在甲基化，并未实现甲基化dna序列结构的最终解析，dna甲基化分析的终极目标是甲基化碱基的位点定位。目前，已发展了多种dna甲基化的检测方法，根据检测前对基因组dna的处理主要分为3大类:限制性酶切、亲和富集和亚硫酸氢盐转换。然而，这三种方法仍然存在一定的局限性。克隆测序其测试结果受到转换是否完全和测序深度的影响，同时文库构建过程复杂，长时间酸处理，易导致靶序列降解；另一方面，检测后庞大的数据处理和对检测设备的特殊要求导致其难以在临床实验室推广应用。msre分析由于限制性内切酶对碱基序列识别的特异性，导致其只能对re识别序列进行分析，检测范围受到re识别限制。更主要的是，其结果判读是通过酶切后甲基化与非甲基化的酶切片段的电泳区带差异进行判断，这即导致该技术只能解析某一段待测序列是否存在甲基化，而不能准确判断甲基化的确切位点。而甲基化芯片技术通过标记的捕获探针与甲基化靶序列结合后的标记信号差异，分析待测序列是否存在甲基化。其检测结果只能检测一段已知序列是否存在甲基化，也不能明确甲基化的特异位点。因此，建立操作简单、准确性好，灵敏度高的甲基化检测方法已成为临床诊断等领域愈加迫切的需求。电化学方法因快速、简便、灵敏、易于实现微型化等优点，利用其研究dna甲基化具有独特的优势。本项目根据甲基化dna在液相条件下形成以甲基ch3-为内核的“疏水球”这一物化特性，实现对甲基化碱基位点的定位分析。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)克隆测序其测试结果受到转换是否完全和测序深度的影响，同时文库构建过程复杂，长时间酸处理，易导致靶序列降解；检测后庞大的数据处理和对检测设备的特殊要求导致其难以在临床实验室推广应用。(2)msre分析由于限制性内切酶对碱基序列识别的特异性，导致其只能对re识别序列进行分析，检测范围受到re识别限制，导致该技术只能解析某一段待测序列是否存在甲基化，不能准确判断甲基化的确切位点。(3)甲基化芯片技术的检测结果只能检测一段已知序列是否存在甲基化，不能明确甲基化的特异位点。解决上述技术问题的难度和意义：随着功能基因组学研究的深入，为精确解析甲基化导致基因表观紊乱的分子本质，甲基化特异位点分析已成为必然。目前，应用于全基因组甲基化检测的bisulfite-seq技术，由于深度测序要求和庞大数据分析而限制了其在临床实验室的推广应用，mrse甲基化敏感性限制性内切酶技术，存在引物设计受到限制性内切酶识别序列限制，检测结果受酶切是否完全影响。同时，mrse并不能精确判定甲基化位点。另一方面，随着基因组甲基化图谱的绘制完成，对于大量的临床标本，往往只需对基因组中调控表观遗传特性改变的特定区域进行甲基化分析即可满足临床需求，例如cpg岛、启动子区，或已知的差异甲基化位点(differentiallymethylatedsites，dms)等。本项目正是瞄准dna甲基化碱基定位分析这一表观遗传和实验医学的交叉前沿问题，原创性地提出构建基于甲基化dna在甲基化碱基结构域，形成ch3-为内核的“疏水球”的这一物化特征为基础的电化学传感分析技术，解决临床检测对甲基化碱基定位这一迫切技术需求。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种dna甲基化特异位点的电化学分析方法。本发明是这样实现的，一种dna甲基化特异位点的电化学分析方法流程为：步骤一：特异性位点甲基化dna序列与非甲基化dna序列的设计合成；步骤二:电极自组装；步骤三：dna电化学核酸传感电极表征；步骤四：dna电化学传感液相杂交条件优化；步骤五：电化学传感液相响应机制解析。进一步，所述采用primerpremier及dnasis软件，分别设计dna探针及其互补的不同位点甲基化单链ssdna序列与非甲基化单链ssdna比对序列；设计相同碱基序列不同位点甲基化的双链dsdna，用于双链dsdna不同位点甲基化检测；设计相同碱基的多位点甲基化单链ssdna和dsdna，用于多位点甲基化分析；将dna序列5’端巯基化(5’-sh-dna)处理。进一步，所述按本实验室常规方法进行电极打磨，硝酸、丙酮和超纯水中超声洗涤，干燥备用。在已处理好的金电极表面自组装l-半胱氨酸，将用柠檬酸三钠还原法制备的纳米金通过au-nh键合于l-cys/金电极表面，制得nano-au/l-cys/金电极。将nano-au/l-cys/金电极放入5’-sh-dna探针溶液中，4℃反应12hrs，由于纳米金颗粒具有较大表面积、表面活性高、吸附能力强的特点，大量的5’-sh-dna探针通过au-s牢固地与nano-au键合，然后将电极置于巯基乙醇溶液中，封闭电极可能存在的非特异性结合位点，最终制得5’-sh-dna/nano-au/l-cys/金电极。进一步，所述采用原子力显微镜、透射电子显微镜、对处理好的金电极和dna/金电极电化学核酸传感器表面进行表征，观察电极表面膜的纳米粒均度和分散度等精细结构。进一步，所述①反应介质离子浓度对dna与靶分子dna的杂交效率及其峰电流与电阻抗背景干扰：pbs缓冲液nacl浓度0mm～200mm。②反应介质ph条件对dna与靶分子dna的杂交效率及其峰电流与电阻抗背景干扰：pbs缓冲液ph5.0～8.5。③杂交时间对dna与靶分子dna的杂交效率及dna链内互补分析：0min～180min。④5-甲基胞嘧啶抗体浓度对甲基化检测的影响：0ng/ml～40μg/ml，优化出最佳反应条件。进一步，所述分别向反应体系加入从1pm到5μm五倍比梯度稀释的相应定量甲基化和非甲基化dna靶序列，分别与dna探针进行杂交反应。分别加入抗5-甲基胞嘧啶抗体及hrp标记的二抗，记录反应过程中电信号的变化。综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明基化dna在液相条件下形成以甲基ch3-为内核的“疏水球”这一物化特性，实现对甲基化碱基位点的定位分析。为了准确定位dna甲基化位点，我们制备了一系列已知甲基化位置的靶序列(dnas2，dnas3,dnas4,dnas5,dnas6,table1)，结果显示，距离电极最近端的甲基化靶序列s2的dpv峰电流最小，随着甲基化位置逐渐远离电极表面，dpv峰电流逐渐增大。这是由于不同位点甲基化的靶序列dna与捕获探针结合后，导致ch3疏水球距离电极表面的空间位相差异。同时，结合上抗体修饰的石墨烯后，进一步增大了这个空间位相差异的效应，从而导致对电极膜表面反应介质的空间位阻和挤占的差异，从而引起峰电流响应信号显著差异(图6)。附图说明图1是本发明实施例提供的dna甲基化特异位点的电化学分析方法流程图。图2是本发明实施例提供的离子浓度的优化示意图。图3是本发明实施例提供的杂交时间的优化示意图。图4是本发明实施例提供的ph值的优化示意图。图5是本发明实施例提供的抗体浓度的优化示意图。图6是本发明实施例提供的不同甲基化位点的dpv检测结果示意图；图中：a-f分别代表距离电极不同位点的dna甲基化示意图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。如图1所示，本发明实施例提供的dna甲基化特异位点的电化学分析方法流程为：s101：特异性位点甲基化dna序列与非甲基化dna序列的设计合成。s102：电极自组装。s103：dna电化学核酸传感电极表征。s104：dna电化学传感液相杂交条件优化。s105：电化学传感液相响应机制解析。所述采用primerpremier及dnasis软件，分别设计dna探针及其互补的不同位点甲基化单链ssdna序列与非甲基化单链ssdna比对序列；设计相同碱基序列不同位点甲基化的双链dsdna，用于双链dsdna不同位点甲基化检测；设计相同碱基的多位点甲基化单链ssdna和dsdna，用于多位点甲基化分析；将dna序列5’端巯基化(5’-sh-dna)处理。在本发明的优选实施例中，步骤s101中的序列为：seqidno：1～seqidno：7。seqidno：1为s1；seqidno：2为s2；seqidno：3为s3；seqidno：4为s4；seqidno：5为s5；seqidno：6为s6；seqidno：7为s7。表1所述按本实验室常规方法进行电极打磨，硝酸、丙酮和超纯水中超声洗涤，干燥备用。在已处理好的金电极表面自组装l-半胱氨酸，将用柠檬酸三钠还原法制备的纳米金通过au-nh键合于l-cys/金电极表面，制得nano-au/l-cys/金电极。将nano-au/l-cys/金电极放入5’-sh-dna探针溶液中，4℃反应12h，由于纳米金颗粒具有较大表面积、表面活性高、吸附能力强的特点，大量的5’-sh-dna探针通过au-s牢固地与nano-au键合，然后将电极置于巯基乙醇溶液中，封闭电极可能存在的非特异性结合位点，最终制得5’-sh-dna/nano-au/l-cys/金电极。所述采用原子力显微镜、透射电子显微镜、对处理好的金电极和dna/金电极电化学核酸传感器表面进行表征，观察电极表面膜的纳米粒均度和分散度等精细结构。所述①反应介质离子浓度对dna与靶分子dna的杂交效率及其峰电流与电阻抗背景干扰：pbs缓冲液nacl浓度0mm～200mm。②反应介质ph条件对dna与靶分子dna的杂交效率及其峰电流与电阻抗背景干扰：pbs缓冲液ph5.0～8.5。③杂交时间对dna与靶分子dna的杂交效率及dna链内互补分析：0min～180min。④抗体浓度对传感器性能的影响：0ng/ml～40μg/ml梯度稀释，优化出最佳反应条件。所述分别向反应体系加入从1pm到5μm五倍比梯度稀释的相应定量甲基化和非甲基化dna靶序列，分别与dna探针进行杂交反应。分别加入抗5-甲基胞嘧啶抗体及hrp标记的二抗，记录反应过程中电信号的变化。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>中国人民解放军陆军军医大学<120>一种dna甲基化特异位点的化学分析方法<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1agcgccgcggcgcccacccagcgcgc26<210>2<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2agcgccgcggcgcccacccagcgcgc26<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3agcgccgcggcgcccacccagcgcgc26<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4agcgccgcggcgcccacccagcgcgc26<210>5<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5agcgccgcggcgcccacccagcgcgc26<210>6<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6agcgccgcggcgcccacccagcgcgc26<210>7<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7agcgccgcggcgcccacccagcgcgc26当前第1页12当前第1页12