鼠抗人CMTM6蛋白单克隆抗体制备及用途的制作方法

本发明涉及免疫学领域，特别涉及一种鼠抗人cmtm6蛋白的单克隆抗体，以及该抗体的免疫组化与治疗用途。

背景技术：

趋化素样因子超家族(chemokine-likefactormarveltransmembranedomaincontainingsuperfamily，cmtm)是由北京大学人类疾病基因研究中心在国际上最初发现报道的一个人类基因超家族，共有8个成员。其中cmtm6-8在3号染色体上成基因簇形式存在，它们的蛋白质产物具有序列同源性和潜在的四次跨膜结构。此前研究表明cmtm家族成员在免疫系统、男性生殖系统发挥重要作用，并参与肿瘤的发生发展。2017年下半年，两篇独立的研究论文相继在《自然》(nature)杂志上发表，共同报道cmtm6/cmtm4能够与pd-l1特异性结合，从而增强pd-l1蛋白的稳定性，增强肿瘤细胞抑制机体免疫杀伤作用的能力。其中cmtm6起主导作用，而cmtm4为后备作用，在cmtm6不表达时起效。研究表明，cmtm6和pd-l1在细胞膜和核内体(endosome)上共定位，从而cmtm6能够阻断pd-l1遭受降解。与此同时，敲除cmtm6会降低pd-l1表达。分别使用敲除cmtm6基因和携带正常cmtm6基因的鼠黑色素瘤细胞移植小鼠，结果带有敲除cmtm6组较正常cmtm6组存活率显著增高，说明抑制cmtm6与pd-l1的结合具有抗肿瘤的作用，是极有前途的肿瘤免疫治疗新靶标。因此，研制出一种特异性高、表现稳定的cmtm6抗体，用于检测肿瘤表面及胞浆内cmtm6的表达，对于后续是否使用cmtm6抑制剂进行免疫治疗具有重要意义。

目前，国际上针对pd-1/pd-l1免疫逃逸通路的研究和应用方兴未艾，但应用pd-1/pd-l1抑制剂治疗时有效率低是一个最大的瓶颈。以目前已经进入肺癌一线治疗的默克公司的keytruda为例，其有效率只有44.8％。其它类似产品的有效率相对更低。这是由于不同患者其肿瘤实施免疫逃逸的机理和途径不同，即使同样通过pd-1/pd-l1免疫检查点系统，其参与和影响因素也很多。近年来国际上一直在尽全力挖掘与pd-1/pd-l1系统相关的调节因素，以此通过替代pd-1/pd-l1抑制剂或联合使用的方式来提高对肿瘤的免疫治疗作用。cmtm6就是这样一个理想的靶点。但由于此发现仅报道半年多，国际范围内目前还没有可以用于临床诊断的cmtm6抗体问世，部分用于科研的抗体因特异性、稳定性等原因尚未进入临检应用，因此亟待研发新的性能优异的抗cmtm6单克隆抗体，填补国内外本行业的空白。本发明成功研制出一种特异性高、表现稳定且效价高的鼠抗人cmtm6蛋白的单克隆抗体，可用于不同免疫细胞和肿瘤细胞cmtm6的表达水平研究，疾病发生、进展、预后相关的病理生理研究以及cmtm6/pd-l1系统调节机体免疫功能的机理研究，具有一定的医学基础研究价值。本发明采用免疫组织化学方法(ihc)检测肿瘤细胞表面cmtm6的表达，主要包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌，为是否使用cmtm6抑制剂进行免疫治疗及肿瘤的预后判断提供科学参考，有效改善治疗效果、降低治疗费用，具有重要的应用价值。另外本发明抗体目前已经通过体外实验证实，应用该抗体可以拮抗pd-l1抑制免疫应答的作用，提升免疫应答效应因子的分泌量，增强免疫功能，在人源化转化后，将成为理想的免疫治疗药物。

技术实现要素：

基于以上所述的现有技术现状，本发明的目的为提供一种特异性好、表现稳定且效价高的抗cmtm6蛋白的单克隆抗体，并建立基于所述cmtm6单克隆抗体的免疫组织化学技术。同时，评估所述cmtm6单克隆抗体作为免疫治疗药物的意义。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述cmtm6单克隆抗体的制备方法如下：

(1)免疫源的制备：根据cmtm6基因(nm_017801)序列信息，订购合成n末端带bsa序列(提高多肽的免疫原性)的人类cmtm6多肽片段(加拿大应用生物材料有限公司，appliedbiologicalmaterialsinc.)，用于免疫实验动物和elisa筛选阳性克隆。

(2)采用上述合成的cmtm6多肽免疫balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，使用cmtm6多肽预铺的96孔板采用elisa法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗cmtm6特异性抗体的杂交瘤细胞株；制备小鼠腹水，通过proteina柱层析纯化cmtm6单抗。分别通过westernblot(结果见图1)和免疫组化实验(结果见图2)验证该单抗的特异性和灵敏度。

同时，本发明提供一种上述单克隆抗体在制备用于检测cmtm6蛋白的免疫组化工具中的应用。

所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于检测恶性肿瘤的免疫组化用途。由于cmtm6是通过调节pd-l1蛋白水平进而促进肿瘤细胞逃逸免疫监控的重要因子之一，因此检测cmtm6在肿瘤细胞表面的表达对于恶性肿瘤的辅助诊断、治疗方案选择和预后具有重要的参考价值。

以使用leica的免疫组化自动染色机bondmax为例，应用该cmtm6单克隆抗体进行免疫组化染色的条件为：

(1)使用机器自带的ihcprotocolf，将过氧化物酶封闭步骤由使用一抗前移至dab显色前；

(2)抗体使用终浓度为0.5μg/ml，室温孵育30min；

(3)抗原修复使用ph9.0的抗原修复液(er2)，100℃加热孵育30min。

使用其他ihc自动染色机或进行手工染色时，请参照上述条件进行。

本发明所述的特异性单抗，可与cmtm6蛋白特异结合，同时建立了基于该单克隆抗体的免疫组织化学技术，可用于恶性肿瘤的辅助诊断、治疗方案选择和预后，恶性肿瘤主要包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌等。

本发明还评估了所述cmtm6单抗作为免疫治疗药物的意义。通过混合淋巴细胞培养实验，证实应用本发明cmtm6抗体可提高免疫细胞因子干扰素γ分泌，并与抗体使用剂量相关。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为本发明单克隆抗体的westernblot结果：m泳道为marker，1泳道为转染cmtm6基因的293t细胞裂解液经本发明cmtm6抗体检测的结果，2泳道为未转染cmtm6基因的293t细胞裂解液经本发明cmtm6抗体检测的结果，3泳道为转染cmtm6基因的293t细胞经β-actin抗体检测的对照结果，4泳道为未转染cmtm6基因的293t细胞裂解液经β-actin抗体检测的对照结果。

图2为以本发明鼠抗人cmtm6单克隆抗体和兔抗人pd-l1单克隆抗体(genomemeinc，bc，canada)为一抗，免疫组化法分别检测同一例非小细胞肺癌组织连续切片中cmtm6(a)和pd-l1(b)蛋白的表达染色图。

图3为应用本发明抗体进行混合淋巴细胞培养的实验结果。在t淋巴细胞激活后开始加入本发明抗体(antibody)或仅抗体稀释液(nc)，继续培养5天后使用elisa方法(bdbioscience，ca，usa)测定细胞分泌的干扰素γ，a图为使用不同浓度本发明抗体诱导干扰素γ的分泌结果，b图为加入本发明抗体或仅抗体稀释液后干扰素γ的分泌结果。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1抗cmtm6单克隆抗体的制备

一、免疫源的制备：根据cmtm6基因(nm_017801)序列信息，订购合成n末端带bsa序列的人类cmtm6多肽，用于免疫实验动物和elisa筛选阳性克隆。

二、动物免疫：上述经过纯化的cmtm6多肽以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄balb/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以elisa法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用balb/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取上述免疫的小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；免疫小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1∶5-1∶10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入hat培养基悬浮混匀，mc定容到50ml，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％co2恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用上述合成的cmtm6多肽进行elisa测试，标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定elisa值，挑取od280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至elisa测定96孔板全板结果为阳性。4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经pbs洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×10⁶/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，proteina柱层析法进行腹水纯化，纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在-20℃。

以本发明单克隆抗体为一抗，对经过cmtm6基因转染的293thek细胞系的蛋白裂解液进行杂交、显色，其结果如图1所示，由图可见：应用本发明抗体，未转染细胞未见明显信号，而转染了cmtm6基因的样本呈现单一谱带，信号较强，大小为21kd，分子量与cmtm6相符。

实施例2以本发明单克隆抗体为一抗的免疫组化实验

1、分别取24种不同类型的癌组织取样制作组织芯片，使用leicarm2235型组织切片机进行切片，切片厚度为4μm；

2、使用leicabondmax免疫组化自动染色机对本发明抗体进行免疫组化染色测试，使用机器自带的脱蜡与水化条件，具体步骤为：60℃孵育30min，应用脱蜡溶液(leica)洗3遍。抗原修复采用抗原修复液2(er2，leica)，100℃孵育30min。一抗使用本发明抗体及另一pd-l1市售抗体，采用抗体稀释液(leica)稀释到终浓度为0.5μg/ml，150μl。抗体室温孵育30min。使用配套的二抗(leica)150μl，室温孵育8min。使用多聚物检测液(leica)150μl，室温孵育8min。使用内源性过氧化物酶封闭液150μl室温孵育5min。使用dab显色液(leica)150μl，室温孵育10min。苏木素复染，室温孵育5min；

3、脱水和透明：去离子水清洗1min，95％乙醇1min，100％乙醇2minx2次，二甲苯2minx3次，中性树胶封片；

4、镜检，结果：部分肿瘤显示阳性染色，包括肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌、膀胱癌等，部分肿瘤显示阴性无cmtm6染色，包括脑癌、乳腺癌、肝癌等。其中非小细胞肺癌组织染色如图2所示，可见cmtm6染色(图2a)呈现明显细胞膜染色。染色模式正确，信号较强，未见明显非特异染色。并且与pd-l1(图2b)染色呈现共定位特征。

实施例3本发明单克隆抗体的混合淋巴细胞培养实验

1、获取两名供者的外周血液，采用ficoll-paqueplus(ge，pittsburgh，pa，usa)分离外周血单核细胞。方法简要介绍如下：

1)、取2ml新鲜抗凝血液，加2ml平衡盐溶液(配方参照ge产品说明书)稀释，混匀。

2)、充分混匀ficoll-paqueplus液后，用注射器抽取3ml/样本。加入洁净的离心管。

3)、将之前稀释的血液样本缓慢地加在ficoll-paqueplus上，注意不要将ficoll-paque与血液混合。

4)、在18-20℃，离心400g，20分钟。

5)、缓慢吸取、弃除上层溶液(血浆)，小心回收中间层的淋巴细胞用于后续实验。

2、取一名供者的单核细胞，加入500u/ml的白介素4(il-4)和250u/ml的粒-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)，培养5天后，进一步加入肿瘤坏死因子(tnf)继续培养2天，制备树突状细胞。培养条件：使用rpmi1640培养液，10％fbs，37℃、5％co2恒温培养箱中进行培养。

3、取另一名供者的单核细胞采用easysep^tmhumancd4+tcellisolationkit(stemcelltechnologies，inc，vancouver，bc，canada)分选cd4阳性t细胞。方法参照试剂盒使用说明；

4、将步骤2获得的树突状细胞与步骤3获得的cd4阳性t细胞混合培养，同时加入不同浓度本发明抗体(0.1nm，1nm，10nm和100nm)或抗体稀释液(阴性对照)；

5、培养5天后，取细胞培养液采用elisa方法(humanifn-γelisaset，bdbioscience，sanjose，ca，usa)测定其中干扰素γ的含量/浓度，结果如图3所示，可见本发明抗体可以诱导干扰素γ的分泌，并呈现剂量效应(图3a)，加入本发明抗体组较阴性对照组干扰素γ浓度显著升高(图3b)。

实施例4本发明单克隆抗体的特异性检测

应用本发明抗体采用elisa检测无关抗原预铺的96孔板(her-2)，结果为阴性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。