基于LAMP检测多肉植物茎腐病菌的引物组合及其应用的制作方法

本发明属于园艺作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及多肉植物茎腐病菌的环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，lamp）检测的引物组合及其应用，可用于多肉植物茎腐病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于多肉植物茎腐病的早期诊断和监测鉴定。

背景技术

多肉植物是指植物营养器官肥大的高等植物，通常具根、茎、叶三种营养器官和花、果实、种子三种繁殖器官。在园艺上，又称肉质植物或多肉花卉，但以多肉植物这个名称最为常用。多肉植物作为盆栽在世界各地广受欢迎，目前常见的种类大多属于景天科和仙人掌科。

茎腐病的病原为尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)，是危害多肉植物的主要性真菌病害，属半知菌亚门真菌，也是一类世界性分布的真菌，分布极广，普遍存在于土壤及动植物有机体上，甚至存在于严寒的北极和干旱炎热的沙漠，属于兼寄生或腐生生物。它不仅可以在土壤中越冬和越夏，还会在不同的观赏植物上表现为不同的专化型；其专一性地引起观赏植物维管束病害，破坏植物的输导组织，并在植物生长发育代谢过程中产生毒素来危害作物，造成植物萎蔫死亡，影响产量和品质，该病是目前观赏花卉生产中防治比较困难的重要病害之一。多肉植物一遇此病会大量猝倒，萎缩死亡，植株茎部会开始出现褐色病斑，接着内部腐烂，直至全株猝倒死亡。由于多肉植物茎腐病是一种土传病害，防治上主要以预防为主，防治是否及时，直接影响了对土传病害的防治效果。因此生产上迫切需要建立一种快速、准确的检测多肉植物茎腐病菌的方法，为病害的早期诊断与防治、监测、预测预报提供支持和服务，对发展多肉植物生产、增加花农收入、减少环境污染和维持农业可持续发展，都具有重大的生产意义。

当前，病原菌的检测方法较多，传统真菌菌种鉴定方法主要以形态学为依据，将菌种鉴定到纲、目、科、属、种。真菌的形态特征复杂，且有些菌类形态特征和生理生化特征随着环境的变化而不稳定，因此，在传统的真菌分类中常引起分类系统的不一致。同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能直观的在病害潜伏期和初发期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。

随着生物化学、遗传学以及分子生物学的发展，为病原菌的分类鉴定提供了技术条件。如血清学免疫学技术、常规pcr、巢式pcr和实时荧光定量pcr等技术为病原菌的分类鉴定提供了灵敏度高、快速的检测技术。但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处，如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性，pcr快速检测技术主要包括常规pcr、巢式pcr（nest-pcr）和实时荧光定量pcr等，pcr技术检测时间较长，需要依赖贵重、精密的pcr仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备及相应的高新技术人员，因而提高了检测成本，并限制了其应用范围，不利于基层生产上推广应用，限制了这些先进方法的推广应用。

环介导等温扩增技术（lamp）是由日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术，该技术可在60℃~65℃恒温条件下，利用高活性的链置换dna聚合酶(bstdnapolymerase)对目的dna片段进行特异性扩增。在1小时内，能够将少量拷贝数的目的基因扩增至10⁹~10¹⁰个拷贝数。由于lamp扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低，lamp反应产物不仅可以通过浊度仪、real-timepcr仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过sybrgreenⅰ、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后，肉眼识别，大大降低了对实验人员的伤害，并且增加了在田间的应用价值。目前lamp在植物病原菌检测中的应用逐年增多，而关于多肉植物茎腐病菌的lamp检测国内外均未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中对多肉植物茎腐病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌传播、流行问题，而pcr分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了基于环介导等温扩增技术（lamp）检测多肉植物茎腐病菌的引物组合及其应用，对多肉植物茎腐病菌进行lamp检测，具有检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果等优点。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

1.多肉植物茎腐病菌lamp检测特异性引物组合的设计：通过测定多肉植物茎腐病菌（fusariumoxysporum）和其它镰刀菌（fusariumspp）的translationelongationfactor1-alphagene(ef-1alpha)基因序列，对镰刀菌属及其它病原菌不同种间ef-1alpha基因序列进行比对分析，利用在线lamp引物设计软件primersoftwareexplorerv4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html,eikenchemicalco.,japan)设计一套多肉植物茎腐病菌特异性lamp引物组合，由1对外侧引物f3/b3和1对内侧引物fip/bip组成，f3/b3和fip/bip引物序列如下：

f3:5'-cagtattctggcgggcatg-3'，

b3:5'-acctgatccgaggtcaacat-3';

fip:5'-tggggaacgcgaattaacgcggagcgtcatttcaaccctca-3'，

bip:5'-gtcacgtcgagcttccatagcgagaagttggggtttaacggc-3'。

2.多肉植物茎腐病菌lamp检测方法的建立，包括以下步骤：

（1）提取待测样品基因组dna。

用于检测病原菌纯培养物时，采用ctab法进行提取基因组dna，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5ml离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µl2%ctab（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（其包含：2%ctab；100mmol·l^-1tris-hcl,ph8.0；20mmol·l^-1edta,ph8.0；1.4mol·l^-1nacl）和90µlsds（十二烷基苯磺酸钠）【注：ctab，sds需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（dna释放至缓冲液中），12000r·min^-1离心15min；取上清液700µl，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（各成分体积比25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min^-1离心9min；取上清液500µl，加入1/10体积3mol·l^-1naac和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min^-1离心5min；弃去上清液，加入700µl冰70%乙醇进行洗涤（稍离心，倾掉上清液），在超净工作台上晾干至无酒精味，加入60µl无菌双蒸水（ddw）进行溶解，得到dna溶液，用紫外分光光度计检测dna浓度并稀释至100ng·µl^-1待用。

用于检测植物组织中多肉植物茎腐病菌时，采用naoh快速裂解法提取dna，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µl0.5mol·l^-1naoh，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5ml离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5µl加入495µl0.1mol·l^-1tris-hcl（ph=8.0）混合均匀，取1.0µl作为pcr模板进行扩增。

（2）lamp反应体系的建立：以步骤（1）提取的dna为模板，利用外侧引物f3/b3和内侧引物fip/bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括20mmtris-hcl、10mm(nh4)2so4、8.0mmmgso4、50mmkcl、0.8mm甜菜碱（betaine）、1.75mmol·l^-1dntps、8ubstdna聚合酶、1.6μmol·l^-1的fip和bip、0.2μmol·l^-1的f3和b3，1μl模板dna（50-100ng），无菌双蒸水补充至25μl，在pcr管盖上加入2μl的1000×sybrgreenⅰ。

（3）lamp反应条件：65℃温育60min，85℃灭活10min，冰上终止反应。

（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，瞬时离心，将sybrgreenⅰ离心到pcr管的底部，观察颜色变化，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在多肉植物茎腐病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在多肉植物茎腐病菌。采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0μllamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带判断为阳性，存在多肉植物茎腐病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在多肉植物茎腐病菌。

本发明的显著优点

本发明的有益效果：本发明建立了多肉植物茎腐病菌的快速、简便、特异性强、灵敏度高的lamp检测技术方法，可用于带菌植株组织和土壤中多肉植物茎腐病菌的检测，或用于多肉植物茎腐病的发病前期、初期检测，对于确定病害防治的最佳时期具有十分重要的意义。

本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、特异性强、结果可靠：靶标基因的选择是lamp检测的重要因素之一。普通pcr常用的靶标基因有核糖体基因转录间隔区(internaltranscribedspace,its)，然而许多学者认为该靶标不能够很明确的区分镰刀属真菌及尖孢镰孢菌不同专化型。发明人发现ef-1alpha基因序列在fusarium种内及尖孢镰孢菌不同专化型不同菌株间具有一定的保守性，种间存在丰富的变化，是相比rdna‐its、β‐tubulin序列更好的分子检测靶标。本发明分析了多肉植物茎腐病菌ef-1alpha基因和其他镰孢菌在序列上的差异，选取6个特定区域，设计了4条特异性的lamp引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，具有很强的特异性。本发明在所设计的lamp引物基础上建立了多肉植物茎腐病菌lamp检测方法，只有多肉植物茎腐病菌能检测出来，其它病原菌均未检测出，多次试验结果均一致，说明本发明lamp检测方法特异性强，结果可靠。

2、灵敏度高：本发明对多肉植物茎腐病菌的检测灵敏度在dna水平上可达到10fg·μl^-1，具有很高的灵敏性。

3、实用性好：在保持pcr技术优点的基础上，lamp方法不需要热循环设备，节省了升降温环节所用的时间，更加省时，可以在60min内完成扩增反应。同时，由于lamp技术使用4~6条引物，与pcr技术相比具有相当或更高的灵敏度，进一步增强了反应的特异性。同时在恒温扩增过程中加入了钙黄绿素（calcein）或sybrgreenⅰ，在反应结束后不用打开盖子就能直接观测结果，使检测过程更加快捷方便，因此该方法特别适合在基层单位或者花卉公司中应用。

4、操作简便快速：本发明提供的检测多肉植物茎腐病菌的lamp方法克服了现有技术中多肉植物茎腐病菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差及pcr检测技术需要热循环仪等贵重设备，无法快速检测多肉植物茎腐病菌的问题。本发明检测方法在65℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到多肉植物茎腐病菌，不需要复杂仪器，只需一个恒温设备即可，能较好满足对多肉植物茎腐病菌的现场检测，有较高的应用价值，在基层和现场检测中有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明多肉植物茎腐病菌的lamp特异性检测结果。图1-a为lamp扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图1-b为lamp扩增后的荧光染料可视化显色结果，其中：m为dl2000dnamarker，1为多肉植物茎腐病菌，显示绿色荧光，2为阴性对照。

图2为本发明多肉植物茎腐病菌的lamp特异性验证。图2-a为lamp扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图2-b为lamp扩增后的荧光染料可视化显色结果，其中：m为dl2000dnamarker，1-8泳道分别为：多肉植物茎腐病菌、多肉炭疽病菌、多肉黑斑病菌、番茄叶霉菌、兰花黑斑病菌、豇豆疫霉菌、恶疫霉菌和无菌双蒸水（ddw），其中1显示绿色荧光。

图3为本发明多肉植物茎腐病菌lamp检测灵敏性。图3-a为lamp扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，图3-b为lamp扩增后的荧光染料显色结果，其中：m为2000dnamarker，1-8模板dna浓度分别为10ng·μl^-1、1ng·μl^-1、100pg·μl^-1、10pg·μl^-1、1pg·μl^-1、100fg·μl^-1、10fg·μl^-1、1fg·μl^-1，1-7显示绿色荧光。

图4为发病组织中多肉植物茎腐病菌的lamp检测。图4-a为lamp扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：m为2000dnamarker，1-5泳道分别为：多肉植物根部发病组织、多肉植物茎部发病组织、多肉植物根部健康组织、多肉植物茎部健康组织、无菌双蒸水（ddw）；图4-b为lamp扩增后的荧光染料显色结果，1-5分别为：多肉植物根部发病组织、多肉植物根部健康组织、无菌双蒸水（ddw）、多肉植物茎部健康组织、多肉植物茎部发病组织，其中1、5显示绿色荧光。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例1：多肉植物茎腐病菌环介导等温扩增（lamp）检测特异性引物组合的设计及引物特异性验证

1.供试菌株基因组dna的提取

用于检测病原菌纯培养物时，采用ctab法进行提取基因组dna，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5ml离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µl2%ctab（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（其含有2%ctab；100mmol·l^-1tris-hcl,ph8.0；20mmol·l^-1edta，ph8.0；1.4mol·l^-1nacl）和90µlsds（十二烷基苯磺酸钠）【注：ctab，sds需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（dna释放至缓冲液中），12000r·min^-1离心15min；取上清液700µl，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（各成分体积比为25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min^-1离心9min；取上清液500µl，加入1/10体积3mol·l^-1naac和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min^-1离心5min；弃去上清液，加入700µl冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干至无酒精味，加入60µl无菌水（ddw）进行溶解，得到dna溶液，用紫外分光光度计检测dna浓度并稀释至100ng·µl^-1待用。

2.多肉植物茎腐病菌环介导等温扩增（lamp）特异引物组合的设计通

过测定多肉植物茎腐病菌（fusariumoxysporum）和其它镰刀菌（fusariumspp）的translationelongationfactor1-alphagene(ef-1alpha)基因序列，对镰刀属及其它病原菌不同种间ef-1alpha基因序列进行比对分析，利用在线lamp引物设计软件primersoftwareexplorerv4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html;eikenchemicalco.,japan)设计一套多肉植物茎腐病菌特异性lamp引物组，由1对外侧引物f3/b3和1对内侧引物fip/bip组成，f3/b3和fip/bip引物序列如下：

f3:5'-cagtattctggcgggcatg-3'，

b3:5'-acctgatccgaggtcaacat-3'；

fip:5'-tggggaacgcgaattaacgcggagcgtcatttcaaccctca-3'，

bip:5'-gtcacgtcgagcttccatagcgagaagttggggtttaacggc-3'。

3.多肉植物茎腐病菌lamp检测方法的建立及引物特异性验证

以多肉植物茎腐病菌、多肉炭疽病菌、多肉黑斑病菌、番茄叶霉菌、兰花黑斑病菌、豇豆疫霉菌和恶疫霉菌等供试菌株的dna为模板，阴性对照无菌双蒸水（ddw），利用外侧引物f3/b3和内侧引物fip/bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，20mmtris-hcl、10mm(nh4)2so4、8.0mmmgso4、50mmkcl、0.8mm甜菜碱（betaine）、1.75mmol·l^-1dntps、8ubstdna聚合酶、1.6μmol·l^-1的fip和bip、0.2μmol·l^-1的f3和b3，1μl模板dna（50-100ng），无菌双蒸水补充至25μl，在pcr管盖上加入2μl的1000×sybrgreenⅰ；lamp反应条件：65℃温育60min，85℃灭活10min，冰上终止反应。反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，瞬时离心，将sybrgreenⅰ离心到pcr管的底部，观察颜色变化。显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在多肉植物茎腐病菌；橙色或橘黄色判断为阴性，不存在多肉植物茎腐病菌。采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0μllamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在多肉植物茎腐病菌；没有出现条带则判断为阴性，不存在多肉植物茎腐病菌。

4.引物特异性验证结果

lamp扩增结果表明，供试的多肉植物茎腐病菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现lamp特征的梯形带，其余镰刀菌和真菌显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带（附图1和图2），说明所设计的多肉植物茎腐病菌外侧引物f3/b3和内侧引物fip/bip可以将多肉植物茎腐病菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性，可用于多肉植物茎腐病菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：多肉植物茎腐病菌环介导等温扩增（lamp）检测灵敏度测定

1.不同浓度基因组dna的制备

用无菌超纯水（ddw）对多肉植物茎腐病菌基因组dna进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。

检测方法灵敏度测定及结果观察

以不同浓度的多肉植物茎腐病菌基因组dna为模板，利用外侧引物f3/b3和内侧引物fip/bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括20mmtris-hcl、10mm(nh4)2so4、8.0mmmgso4、50mmkcl、0.8mm甜菜碱（betaine）、1.75mmol·l^-1dntps、8ubstdna聚合酶、1.6μmol·l^-1的fip和bip、0.2μmol·l^-1的f3和b3，1μl模板dna（不同稀释浓度模板10ng·μl^-1、1ng·μl^-1、100pg·μl^-1、10pg·μl^-1、1pg·μl^-1、100fg·μl^-1、10fg·μl^-1、1fg·μl^-1），无菌双蒸水（ddw）补充至25μl，在pcr管盖上加入2μl的1000×sybrgreenⅰ。65℃温育60min，85℃灭活10min，冰上终止反应。反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，瞬时离心，将sybrgreenⅰ离心到pcr管的底部，观察颜色变化。显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在多肉植物茎腐病菌，橙色或橘黄色判断为阴性，不存在多肉植物茎腐病菌；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0μllamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在多肉植物茎腐病菌，没有出现条带则判断为阴性，不存在多肉植物茎腐病菌。

3.lamp扩增灵敏度检测结果

lamp扩增灵敏度检测结果表明，10ng·μl^-1、1ng·μl^-1、100pg·μl^-1、10pg·μl^-1、1pg·μl^-1、100fg·μl^-1、10fg·μl^-1浓度的多肉植物茎腐病菌基因组dna显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现lamp特征的梯形带，1fg·μl^-1浓度显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带，说明所设计的多肉植物茎腐病菌外侧引物f3/b3和内侧引物fip/bip通过lamp扩增，对多肉植物茎腐病菌的检测灵敏度可达10fg·μl^-1（附图3）。

实施例3：发病组织中多肉植物茎腐病菌的lamp检测

样品采集：从福建漳州龙海九湖镇等地采集多肉植物茎腐病发病症状典型的根部、茎部（离地表2-6cm处）及健康植株根部和茎部带回实验室备用。

植物组织dna的提取：采用naoh快速裂解法提取dna，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µl0.5mol·l^-1naoh，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5ml离心管中，12,000rpm离心6min，取上清液5µl加入495µl0.1mol·l^-1tris-hcl（ph=8.0）混合均匀，取1.0µl作为pcr模板进行扩增。

扩增检测及观察：以上述提取的dna为模板，利用外侧引物f3/b3和内侧引物fip/bip进行lamp扩增，lamp检测反应体系为25μl，包括20mmtris-hcl、10mm(nh4)2so4、8.0mmmgso4、50mmkcl、0.8mm甜菜碱（betaine）、1.75mmol·l^-1dntps、8ubstdna聚合酶、1.6μmol·l^-1的fip和bip、0.2μmol·l^-1的f3和b3，1μl模板dna（50-100ng），无菌双蒸水（ddw）补充至25μl，在pcr管盖上加入2μl的1000×sybrgreenⅰ。65℃温育60min，85℃灭活10min，冰上终止反应。反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定。采用荧光染料目测观察法，待lamp反应结束后，瞬时离心，将sybrgreenⅰ离心到pcr管的底部，观察颜色变化。显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在多肉植物茎腐病菌，橙色或橘黄色判断为阴性，不存在多肉植物茎腐病菌；采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0μllamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条带判断为阳性，存在多肉植物茎腐病菌，没有出现条带则判断为阴性，不存在多肉植物茎腐病菌。

检测结果：检测结果（附图4）表明，多肉植物茎腐病发病的根、茎部通过lamp扩增，显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现lamp特征的梯形带，说明存在多肉植物茎腐病菌，而健康根、茎部及阴性对照显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带，说明不存在多肉植物茎腐病菌，该套技术能用于植物组织中多肉植物茎腐病菌的快速分子检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>基于lamp检测多肉植物茎腐病菌的引物组合及其应用

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