一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法。
背景技术：
：芽孢杆菌作为一类重要的生防菌，可以产生各种抑菌抗菌物质拮抗植物病原菌，具有防治植物病害的潜力，也是生物防治的主要来源。其中枯草芽孢杆菌是一种自然界广泛存在、对人畜无毒无害、不污染环境、对植物病害有抑制作用的非致病性芽孢杆菌。目前，许多科研人员对枯草芽孢杆菌以及其它芽孢杆菌的病原拮抗作用及其抗菌物质的研究非常广泛。芽孢杆菌能够产生多种抑菌物质防治病害，包括细菌素、细胞壁降解酶类、抗菌蛋白、脂肤类抗生素、聚酮类化合物和多肤类化合物等。其中抗菌蛋白是具有抗真菌活性的大分子量蛋白类物质，其氨基酸残基通常在50个以上，分子量大于5kda。研究芽孢杆菌类生防细菌产生的抗菌蛋白，一方面可以进行发酵生产，形成生物农药用于防治植物病害，替代或减少化学农药使用；另一方面枯草芽孢杆菌已经被证实可以抑制大肠癌细胞的增殖，引起细胞周期阻滞和促进细胞凋亡，并有望在将来成为一种预防肠道肿瘤发生的益生菌。某些枯草芽孢杆菌产生的果聚糖还能促进肿瘤细胞中的乙酸、丙氨酸、乳酸和磷酸的增长，通过细胞内乳酸积累来改变肿瘤细胞的生物能途径和细胞内稳态，从而表现出抗肿瘤的活性。还有研究表明枯草芽孢杆菌za400具有很高的纤溶酶活性并可在大肠杆菌的表达系统中克隆表达，表明它可能被应用于血栓治疗中。尽管目前枯草芽孢杆菌在应用上还存在许多问题，如产业化应用尚不成熟，商品化的药品未完全推广，并且其许多特性和作用机制尚不明确。但是，随着人们对枯草芽孢杆菌的研究逐渐深入，对其了解愈发清晰，相信在不久的将来，枯草芽孢杆菌的应用定不止于此。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于针对上述
背景技术：
中提到的研究困境，提供一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，用于高效生产枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白。本发明采用以下技术方案：一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，包括以下步骤：先获取枯草芽孢杆菌株，再将菌株接种到种子培养基中培养，得到种子液，然后将种子液接种到发酵培养基中发酵，在发酵过程中按对数生长期和稳定期进行分段调控发酵体系的温度、溶氧量、ph值以及摇床转速，最终后处理获得枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产物。作为本方面进一步改进，控制菌种接种量为2～6％，优选4％。作为本方面进一步改进，接种到种子培养基中的培养具体步骤为：将枯草芽孢杆菌株接种于斜面，于36～38℃恒温培养箱中培养，然后将斜面培养基上活化后的菌株制备成菌悬液，再接种于种子培养基中，于36～38℃、200～220r/min的摇床上震荡培养12～16小时得种子液。作为本方面进一步改进，按照质量百分比计，所述种子培养基包括葡萄糖1.0％，蛋白胨1.0％，nacl1.0％，kh2po40.15％，mgso4·7h2o0.15％，及余量的水；ph值为7.0。(此处相当于水为100份，各种物质的占比为质量比，其余的为水，下同。)作为本方面进一步改进，所述发酵具体步骤为：将种子液按照体积比为(4：100)～(8：100)比例接种到发酵培养基中，进行枯草芽孢杆菌的抗菌蛋白发酵。作为本方面进一步改进，按照质量百分比计，所述发酵培养基包括葡萄糖1.0％，蛋白胨1.5％，酵母浸粉1.5％，kh2po40.1％，nacl0.5％，mgso4·7h2o0.15％，及余量的水；初始ph值为7.0，0.1mpa高压灭菌15min。作为本方面进一步改进，对数生长期内发酵体系温度为36～38℃，溶氧量设定为60％～80％，ph值设定为6.9～7.1，摇床转速设定为180r/min～240r/min。作为本方面进一步改进，稳定期内发酵体系温度调为34～36℃，溶氧量调整为40％～50％，ph值调整为6.6～6.8，摇床转速调整为220r/min～250r/min。作为本方面进一步改进，用乳酸和naoh调节发酵体系的ph值。作为本方面进一步改进，所述枯草芽孢杆菌为bncc18998枯草芽孢杆菌。通过与现有技术相比，本发明的优点是：本发明通过对枯草芽孢杆菌发酵过程菌种生长及产枯草芽孢杆菌抗菌蛋白规律的深入研究，提出了提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，包括获取菌种和枯草芽孢杆菌抗菌蛋白发酵，其中，枯草芽孢杆菌抗菌蛋白发酵过程为将培养12～16小时后的菌种培养液按照体积比为4：100～8：100的比例接种到发酵培养基中制成发酵体系开始枯草芽孢杆菌抗菌蛋白发酵；在枯草芽孢杆菌抗菌蛋白的发酵过程中按时间分段调控发酵体系的温度、溶氧、ph值以及摇床转速，通过以上参数的调整可使发酵前期菌种能够快速稳定的生长，发酵中后期菌种能够高效稳定的产枯草芽孢杆菌抗菌蛋白，降低其它副产物的生成。进一步的，本发明工艺所述种子培养基成分包括葡萄糖1.0％，蛋白胨1.0％，nacl1.0％，kh2po40.15％，mgso4·7h2o0.15％，所述种子培养基的ph值为7.0，在此营养成分(按照质量百分比计)比下，制备的发酵所用种子液中菌种的生长繁殖更快，菌种的活力达到最高。进一步的，本发明工艺根据产枯草芽孢杆菌抗菌蛋白菌种的生长及产素规律，提出了分段控制发酵过程参数，有效的为菌种前期生长及后期产素提供了良好的条件，很大程度上提高了枯草芽孢杆菌抗菌蛋白的生产水平，并且枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量稳定，发酵培养基营养配方主要原料廉价易得，节省成本，适合工业规模化生产。进一步的，本发明工艺菌种发酵培养基的成分为葡萄糖1.0％，蛋白胨1.5％，酵母浸粉1.5％，kh2po40.1％，nacl0.5％，mgso4·7h2o0.15％；初始ph值7.0，0.1mpa高压灭菌15min。在此营养成分(按照质量百分比计)比下，枯草芽孢杆菌代谢分泌枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白的活力更强，产量更高。附图说明图1为采用本方法发酵的产物枯草芽孢杆菌抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌生长造成影响的示意图一；图2为采用本方法发酵的产物枯草芽孢杆菌抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌生长造成影响的示意图二。具体实施方式本发明一种提高枯草芽孢杆菌抗菌蛋白产量的发酵方法，包括步骤为：先获取菌种，然后将获取的菌种接种到发酵培养基中进行发酵获得枯草芽孢杆菌抗菌蛋白，根据菌体发酵开始后前6～16小时的对数生长期和菌体发酵开始16小时后至发酵结束的稳定期生长状况按照发酵时间进行分段调整：在枯草芽孢杆菌抗菌蛋白发酵过程前调控菌种接种量，发酵过程中调控体系的温度、溶氧量、ph值、摇床转速，通过以上参数的调整可使发酵前期菌种能够快速稳定的生长，发酵中后期菌种能够高效稳定的产抗菌蛋白，降低其它副产物的生成。具体的发酵方法为：s1、购买枯草芽孢杆菌菌种，其编号为bncc189983，于北纳创联生物技术有限公司(bncc)生物所保存。s2、将发酵菌种bncc189983枯草芽孢杆菌接种到营养成分(按照质量百分比计)为葡萄糖1.0％，蛋白胨1.0％，nacl1.0％，kh2po40.15％，mgso4·7h2o0.15％，余量的水，种子培养基中培养12～16小时得种子液，培养温度为37℃，培养基初始ph值为7.0。s3、将产枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白的菌种种子液按照体积比为4：100～8：100比例接种到发酵培养基中进行枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白发酵。其中所述发酵培养基营养成分为(按照质量百分比计)葡萄糖1.0％，蛋白胨1.5％，酵母浸粉1.5％，kh2po40.1％，nacl0.5％，mgso4·7h2o0.15％；初始ph值7.0，0.1mpa高压灭菌15min。发酵过程中调控体系的温度、溶氧量、ph值、摇床转速具体为：(1)在发酵开始后的前6～16小时内发酵体系中溶氧量设定为60％～80％，发酵开始后16小时至发酵结束发酵体系中溶氧量调整为40％～50％。(2)在发酵开始后的前6～16小时内发酵体系中ph值设定为6.9～7.1，发酵开始后16小时至发酵结束发酵体系中ph值调整为6.6～6.8，(用乳酸和5mol/lnaoh调节发酵体系的ph值)。(3)在发酵开始后的前6～16小时内摇床转速设定为180～220r/min，发酵开始后16小时至发酵结束摇床转速调整为220～240r/min。(4)在发酵开始后的前6～16小时内发酵体系温度调整为36～38℃，发酵开始后16小时至发酵结束发酵体系温度调为34～36℃。s4、发酵结束后将发酵液采用旋转蒸发仪在0.1mpa，45℃的条件下浓缩，80％乙醇沉淀，透析除盐24小时，sephadexg-50凝胶纯化，冷冻干燥20小时，得粉末状枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白产物。s5、称量抗菌蛋白的质量，通过抑菌性实验验证抗菌蛋白的抗菌活性。以下结合具体实施例对本发明的方法进行说明：实施例1s1、购买枯草芽孢杆菌菌种，其编号为bncc189983，为北纳创联生物技术有限公司(bncc)生物所保存。将枯草芽孢杆菌株接种于斜面，于37℃恒温培养箱中培养，然后将斜面培养基上活化后的菌株制备成浓度为5000000个/ml的菌悬液，按照的4％接种量接种于新鲜的种子培养基中，于36℃，180r/min的摇床上震荡培养。s2、将发酵菌种bncc189983枯草芽孢杆菌接种到营养成分(按照质量百分比计)为葡萄糖1.0％，蛋白胨1.0％，nacl1.0％，kh2po40.15％，mgso4·7h2o0.15％，余量的水的种子培养基中培养12小时得种子液，培养温度为36℃，培养基初始ph值为7.0。s3、将产枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白的菌种种子液按照体积比为4：100比例接种到发酵培养基中进行枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白发酵。其中所述发酵培养基营养成分(按照质量百分比计)为葡萄糖1.0％，蛋白胨1.5％，酵母浸粉1.5％，kh2po40.1％，nacl0.5％，mgso4·7h2o0.15％；初始ph值7.0，0.1mpa高压灭菌15min。(1)在发酵开始后的前6～16小时内发酵体系中溶氧量设定为60％，发酵开始后16小时至发酵结束发酵体系中溶氧量调整为40％。(2)在发酵开始后的前6～16小时内发酵体系中ph值设定为6.9，发酵开始后16小时至发酵结束发酵体系中ph值调整为6.6。(3)在发酵开始后的前6～16小时内摇床转速设定为180r/min，发酵开始后16小时至发酵结束摇床转速调整为220r/min。(4)在发酵开始后的前6～16小时内发酵体系温度调整为36℃，发酵开始后16小时至发酵结束发酵体系温度调为34℃。s4、54小时发酵结束后将发酵液采用旋转蒸发仪在0.1mpa，45℃的条件下浓缩，80％乙醇沉淀，透析除盐24小时，sephadexg-50凝胶纯化，冷冻干燥20小时，得粉末状枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白产物。s5、称量抗菌蛋白的质量，计算枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白产量为14.26g/l，通过抑菌性实验验证抗菌蛋白的抗菌活性。实施例2s1、购买枯草芽孢杆菌菌种，其编号为bncc189983，为北纳创联生物技术有限公司(bncc)生物所保存。将枯草芽孢杆菌株接种于斜面，于37℃恒温培养箱中培养，然后将斜面培养基上活化后的菌株制备成浓度为5000000个/ml的菌悬液，按照的4％接种量接种于新鲜的种子培养基中，于37℃，200r/min的摇床上震荡培养。s2、将发酵菌种bncc189983枯草芽孢杆菌接种到营养成分(按照质量百分比计)为葡萄糖1.0％，蛋白胨1.0％，nacl1.0％，kh2po40.15％，mgso4·7h2o0.15％，余量的水的种子培养基中培养14小时得种子液，培养温度为37℃，培养基初始ph值为7.0。s3、将产枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白的菌种种子液按照体积比为6：100比例接种到发酵培养基中进行枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白发酵。其中所述发酵培养基营养成分(按照质量百分比计)为葡萄糖1.0％，蛋白胨1.5％，酵母浸粉1.5％，kh2po40.1％，nacl0.5％，mgso4·7h2o0.15％，余量的水；初始ph7.0，0.1mpa高压灭菌15min。(1)在发酵开始后的前6～16小时内发酵体系中溶氧量设定为70％，发酵开始后16小时至发酵结束发酵体系中溶氧量调整为45％。(2)在发酵开始后的前6～16小时内发酵体系中ph值设定为7.0，发酵开始后16小时至发酵结束发酵体系中ph值调整为6.7。(3)在发酵开始后的前6～16小时内摇床转速设定为200r/min，发酵开始后16小时至发酵结束摇床转速调整为230r/min。(4)在发酵开始后的前6～16小时内发酵体系温度调整为37℃，发酵开始后16小时至发酵结束发酵体系温度调为35℃。s4、56小时发酵结束后将发酵液采用旋转蒸发仪在0.1mpa，45℃的条件下浓缩，80％乙醇沉淀，透析除盐24小时，sephadexg-50凝胶纯化，冷冻干燥20小时，得粉末状枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白产物。s5、称量抗菌蛋白的质量，计算枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白产物产量为15.51g/l，通过抑菌性实验验证抗菌蛋白的抗菌活性。实施例3s1、购买枯草芽孢杆菌菌种，其编号为bncc189983，为北纳创联生物技术有限公司(bncc)生物所保存。将枯草芽孢杆菌株接种于斜面，于37℃恒温培养箱中培养，然后将斜面培养基上活化后的菌株制备成浓度为5000000个/ml的菌悬液，按照的4％接种量接种于新鲜的种子培养基中，于38℃，220r/min的摇床上震荡培养。s2、将发酵菌种bncc189983枯草芽孢杆菌接种到营养成分(按照质量百分比计)为葡萄糖1.0％，蛋白胨1.0％，nacl1.0％，kh2po40.15％，mgso4·7h2o0.15％，余量的水的种子培养基中培养16小时得种子液，培养温度为37℃，培养基初始ph值为7.0。s3、将产枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白的菌种种子液按照体积比为8：100比例接种到发酵培养基中进行枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白发酵。其中所述发酵培养基营养成分(按照质量百分比计)为葡萄糖1.0％，蛋白胨1.5％，酵母浸粉1.5％，kh2po40.1％，nacl0.5％，mgso4·7h2o0.15％，余量的水；初始ph值7.0，0.1mpa高压灭菌15min。(1)在发酵开始后的前6～16小时内发酵体系中溶氧量设定为80％，发酵开始后16小时至发酵结束发酵体系中溶氧量调整为50％。(2)在发酵开始后的前6～16小时内发酵体系中ph值设定为7.1，发酵开始后16小时至发酵结束发酵体系中ph值调整为6.8。(3)在发酵开始后的前6～16小时内摇床转速设定为240r/min，发酵开始后16小时至发酵结束摇床转速调整为240r/min。(4)在发酵开始后的前6～16小时内发酵体系温度调整为38℃，发酵开始后16小时至发酵结束发酵体系温度调为36℃。s4、58小时发酵结束后将发酵液采用旋转蒸发仪在0.1mpa，45℃的条件下浓缩，80％乙醇沉淀，透析除盐24小时，sephadexg-50凝胶纯化，冷冻干燥20小时，得粉末状枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白产物。s5、称量抗菌蛋白的质量，计算枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白产量为13.96g/l，通过抑菌性实验验证抗菌蛋白的抗菌活性。根据以上三个实施例，得出下表1：表1本发酵方法产量与传统发酵方法产量比较本次测量方法是将发酵结束的发酵液采用旋转蒸发仪在0.1mpa，45℃的条件下浓缩，80％乙醇沉淀，透析除盐24小时，sephadexg-50凝胶纯化，冷冻干燥20小时，得粉末状枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白产物，称量并计算产量。比较可得，本发酵方法可有效地提高枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白的产量。表2本发酵产物抗菌蛋白的抗菌效果本次测量采用金黄色葡萄球菌作为实验对象，以lb培养基作为实验培养基，以打孔法测量抗菌蛋白的抑菌直径。lb培养基由蛋白胨，酵母膏，nacl组成。其优点在于：蛋白胨是经过胰酶处理过的蛋白，处理后，大分子的蛋白分子量变小，细菌更容易利用；此外，还含有嘌呤，提供生长因子。蛋白胨为细菌的生长提供氮源。其次，培养基中的酵母膏酵母提取物主要成分是氨基酸，小肽，核甘酸，b族维生素，主要为细菌提供维生素和微量元素，是细菌生长所必须的。氯化钠在培养基中的作用是维持渗透压，兼能可提供无机盐。表3不同ph值条件下抗菌蛋白的抑菌直径比较ph值抑菌圈直径(mm)38.36415.42517.55619.007(ck)20.17818..43915.591013.27.116.48将发酵产物抗菌蛋白溶液用乳酸和5mol/l氢氧化钠分别调至ph值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，置4摄氏度过夜，用乳酸和氢氧化钠将各ph值调回中性后以金黄色葡萄球菌为指示菌，利用打孔法检测产物抑菌活性。实验结果如表3所示，ph值在4～10之间，其活性基本保持稳定；为7时，其抑菌活性最高，为6～8时其抑菌活性较高。枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白的最适范围为6.5～7.5。枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白对酸碱的耐受范围较宽。表4不同蛋白酶处理后抗菌蛋白的活性比较抑菌圈直径(mm)空白对照20.17胃蛋白酶7.42胰蛋白酶18.47碱性蛋白酶17.65胰凝乳蛋白酶9.12将实施例2发酵生成的枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白分别用胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶在各自最适酶促条件下处理后，以金黄色葡萄球菌为指示菌，利用打孔法检测产物抑菌活性。以未经处理的抗菌蛋白作为对照，按照表格显示表明枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白对胰蛋白酶、碱性蛋白酶具有很好的耐受性，对胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶部分敏感。如图1、图2所示，枯草芽孢杆菌bncc189983抗菌蛋白对金葡菌生长影响图(抑菌圈大小可表示抑菌活性强弱)。以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。当前第1页12