化合物lithocarpinols及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用与流程

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及化合物lithocarpinola和lithocarpinolb及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

癌症正严重威胁着人类的健康。目前，我国每年死于癌症的人数为250万人左右，全球每年死于癌症的人数约为1000万，而且这个数字还在逐年增长。预计到2030年，全球每年新增的癌症病例将达到2140万，死亡人数将超过1100万。当前，抗肿瘤药物的市场份额也在不断扩大，抗癌药物占医药市场份额高达30％。然而，目前抗癌药物大多存在特异性差、毒副作用强和价格昂贵等缺陷，使得癌症患者常因药物昂贵而放弃治疗或副作用大而意外致死。因此，提高抗癌药物特异性从而降低毒副作用将造福癌症患者，对人类健康和社会发展有着十分重要的现实意义。

海洋微生物资源远比陆地微生物资源丰富，并且尚未被人类充分发掘和利用，具有巨大的研究和开发潜能。深海来源的微生物因为高压、高盐、缺氧、低温、寡营养等独特的生境，进而进化出独特的代谢途径，因此成为结构新颖独特天然药物的重要来源。深海来源的真菌比其他海洋微生物具有代谢产物丰富、产量大、结构类型多样及活性显著等优点，已成为海洋药物研发的热点。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供具有抗肿瘤活性的化合物lithocarpinola和lithocarpinolb的制备方法。

所述的化合物lithocarpinola和lithocarpinolb是从海洋真菌phomopsislithocarpusfs508的发酵培养物中分离制备得到的。

优选，具体包括以下步骤：

(1)制备海洋真菌phomopsislithocarpusfs508的固体发酵培养物，用乙酸乙酯萃取该固体发酵培养物，将乙酸乙酯萃取液经浓缩后得浸膏，将浸膏用甲醇水溶液分散，再用石油醚萃取，萃取剩下的甲醇水溶液部分蒸馏浓缩得到粗提物；

(2)将粗提物过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以体积比为10:1,7:1,9:2,2:1,1:1,0:1和二氯甲烷-甲醇以体积比为5:1,0:1分别作为洗脱剂，梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比2:1洗脱获得的且经tlc薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝5:1v/v展开得rf＝0.2-0.4的组分fr.6，将组分fr.6再经凝胶柱层析sephadexlh-20，以二氯甲烷-甲醇体积比1:1作为洗脱剂洗脱，收集tlc薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝2:1v/v展开得rf＝0.5-0.8的组分fr.6.2，将组分fr.6.2再经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯的体积比为6:1,3:1,2:1,1:1,1:2,0:1进行梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比6:1洗脱的组分fr.6.2.1，将组分fr.6.2.1经全制备hplc在ymc-ods柱，流动相为体积比85:15的甲醇/水，流速为8ml/min的色谱条件下进行分离，于保留时间为8.0min收集洗脱组分，得到组分fr.6.2.1.1，将fr.6.2.1.1经进一步的半制备hplc，得到化合物lithocarpinola；于保留时间为8.9min收集洗脱组分，得到组分fr.6.2.1.2，将fr.6.2.1.2经进一步的半制备hplc，得到化合物lithocarpinolb。

所述的步骤(1)制备海洋真菌phomopsislithocarpusfs508的固体发酵培养物具体步骤为：挑取fs508的菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按0.1ml/g的接种量接种于大米培养基中，28℃条件下培养30天，制得fs508的固体发酵培养物，所述的马铃薯葡萄糖液体培养基，每升是通过以下方法配制的：用500ml的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、维生素b110mg，用水补足至1000ml，灭菌制得；所述的大米培养基是通过以下方法配制的：将480g大米与600ml质量体积比为0.5％的粗海盐水溶液混合灭菌制得。

由上述方法制得的化合物lithocarpinola和lithocarpinolb，其结构式如式(ii)所示：

本发明的第二个目的是提供化合物lithocarpinola和/或lithocarpinolb在制备抗肿瘤药物中的应用，优选，所述的抗肿瘤药物为抗肝癌、乳腺癌、神经胶质瘤或非小细胞肺癌药物。

本发明通过实验发现，化合物lithocarpinola和lithocarpinolb对肝癌细胞hepg-2、乳腺癌细胞mcf-7、神经胶质瘤细胞sf-268和非小细胞肺癌细胞a549的ic50值范围为9.4～35.9μm，见下表1。阳性对照物顺铂对以上四种肿瘤细胞株的ic50值分别为2.4、3.2、3.3和1.6μm。此结果表明：本发明的化合物lithocarpinola和lithocarpinolb具有比较显著的抗肿瘤活性。

表1化合物lithocarpinola和lithocarpinolb的对癌细胞的抑制效果

本发明的第三个目的是提供一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物包含化合物lithocarpinola和lithocarpinolb中的至少一种作为活性成分，优选，所述的抗肿瘤药物为抗肝癌、乳腺癌、神经胶质瘤或非小细胞肺癌药物。

本发明的第四个目的是提供海洋真菌phomopsislithocarpusfs508在制备上述化合物lithocarpinola和lithocarpinolb中的应用。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

本发明从海洋真菌phomopsislithocarpusfs508中分离制备得到化合物lithocarpinola和lithocarpinolb，该化合物lithocarpinola和lithocarpinolb具有比较显著的抗肿瘤活性，可以用于制备抗肿瘤药物，为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用海洋微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。

本发明的海洋真菌phomopsislithocarpusfs508于2018年8月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为gdmccno.60433。

附图说明

图1是化合物1(lithocarpinola)和化合物2(lithocarpinolb)的晶体结构；

图2是化合物1(lithocarpinola)的¹h-nmr谱；

图3是化合物1(lithocarpinola)的¹³c-nmr谱；

图4是化合物1(lithocarpinola)的cosy谱；

图5是化合物1(lithocarpinola)的hsqc谱；

图6是化合物1(lithocarpinola)的hmbc谱；

图7是化合物1(lithocarpinola)的noesy谱；

图8是化合物1(lithocarpinola)的hr-esims谱；

图9是化合物1的红外谱图；

图10是化合物1的紫外谱图；

图11是化合物2(lithocarpinolb)的¹h-nmr谱；

图12是化合物2(lithocarpinolb)的¹³c-nmr谱；

图13是化合物2(lithocarpinolb)的cosy谱；

图14是化合物2(lithocarpinolb)的hsqc谱；

图15是化合物2(lithocarpinolb)的hmbc谱；

图16是化合物2(lithocarpinolb)的noesy谱；

图17是化合物2(lithocarpinolb)的hr-esims谱；

图18是化合物2的红外谱图；

图19是化合物2的紫外谱图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

1、海洋真菌phomopsislithocarpusfs508的分离纯化和鉴定

本发明的海洋真菌phomopsislithocarpusfs508是2016年5月，从印度洋深海沉积物(16°50.508'n,111°53.335'e，水深3606米)中分离得到的，经its序列分析鉴定，genbank基因登录号为：mg686131，经blast比对，同源分析，鉴定该菌株属于phomopsis属真菌，命名为phomopsislithocarpusfs508，其于2018年8月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为gdmccno.60433。

2、phomopsislithocarpusfs508的固体发酵

将活化的深海真菌fs508菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养基(每升培养基是通过以下方法配制的：用500ml的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、kh2po43g、mgso41.5g、维生素b110mg，用水补足至1000ml，灭菌制得)中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按0.1ml/g大米培养基的接种量接种于大米培养基(该培养基是通过以下方法配制的：将480g大米与600ml质量体积比为0.5％mg/ml的粗海盐水溶液混合，121℃高压灭菌20min，冷却，制得)中，28℃条件下培养30天，制得fs508的固体发酵培养物。

3、化合物lithocarpinola和lithocarpinolb的制备

(1)往fs508的固体发酵培养物中加入乙酸乙酯，浸泡提取24小时，重复提取3次，提取液经浓缩后得浸膏(99.8g)；浸膏经体积分数为80％的甲醇水溶液分散，再用石油醚萃取四次，除去脂溶性成分，将萃取剩下的甲醇水溶液部分蒸馏浓缩得到粗提物。

(2)将步骤(1)得到的粗提物过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以体积比为10:1,7:1,9:2,2:1,1:1,0:1和二氯甲烷-甲醇以体积比为5:1,0:1分别作为洗脱剂，梯度洗脱，收集流分经tlc板合并相同主点得到14个组分，分别为fr.1-fr.14，将组分fr.6(fr.6为石油醚：乙酸乙酯＝2:1v/v洗脱获得的流分经进一步tlc薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝5:1v/v展开得rf＝0.2-0.4的组分)再经凝胶柱层析sephadexlh-20，以二氯甲烷-甲醇体积比1:1作为洗脱剂洗脱，经tlc板合并主点得到3个亚组分，分别为fr.6.1-fr.6.3；其中，得到的亚组分fr.6.2(fr.6.2为tlc薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝2:1v/v展开得rf＝0.5-0.8的组分)的重量为2.2g，将亚组分fr.6.2再经硅胶柱(200-300目)层析，以石油醚-乙酸乙酯的体积比为6:1,3:1,2:1,1:1,1:2,0:1梯度洗脱得到5个组分，分别为fr.6.2.1-fr.6.2.5；其中，得到的组分fr.6.2.1(fr.6.2.1为石油醚：乙酸乙酯＝6:1v/v洗脱得到的组分)的重量为1.2g，将组分fr.6.2.1经全制备hplc在ymc-ods柱，流动相为体积比85:15的甲醇/水，流速为8ml/min的色谱条件下得到四个组分，分别为fr.6.2.1.1-fr.6.2.1.4；组分fr.6.2.1.1(保留时间为8.0分钟)经进一步的半制备hplc，在ymc-packods/aq柱，流动相为体积比82:18的乙腈/水，流速为3ml/min，保留时间为9.3min的色谱条件下得到化合物1(化合物lithocarpinola，12.6mg)；组分fr.6.2.1.2(保留时间为8.9分钟)经进一步的半制备hplc，在ymc-packods/aq柱，流动相为体积比82:18的乙腈/水，流速为3ml/min，保留时间为9.4min的色谱条件下得到化合物2(化合物lithocarpinolb，10.1mg)。

4、化合物lithocarpinola和lithocarpinolb的结构鉴定

¹hnmr、¹³cnmr、hmbc核磁共振谱图用brukeradvance-600核磁共振光谱仪测定，以四甲基硅烷(tms)为内标；esi-ms数据用vgautospec-3000型质谱仪测定；紫外光谱用岛津uv-2600分光光度计测定，其结构鉴定如下：

如图2-19所示，图2是化合物1(lithocarpinola)的¹h-nmr谱；图3是化合物1(lithocarpinola)的¹³c-nmr谱；图4是化合物1(lithocarpinola)的cosy谱；图5是化合物1(lithocarpinola)的hsqc谱；图6是化合物1(lithocarpinola)的hmbc谱；图7是化合物1(lithocarpinola)的noesy谱；图8是化合物1(lithocarpinola)的hr-esims谱；图9是化合物1的红外谱图；图10是化合物1的紫外谱图。

图11是化合物2(lithocarpinolb)的¹h-nmr谱；图12是化合物2(lithocarpinolb)的¹³c-nmr谱；图13是化合物2(lithocarpinolb)的cosy谱；图14是化合物2(lithocarpinolb)的hsqc谱；图15是化合物2(lithocarpinolb)的hmbc谱；图16是化合物2(lithocarpinolb)的noesy谱；图17是化合物2(lithocarpinolb)的hr-esims谱；图18是化合物2的红外谱图；图19是化合物2的紫外谱图。

化合物1为白色固体；根据其esims准分子离子峰，确定化合物1的分子量为424；根据hresims[m-h]^-m/z423.1815，c25h27o6，计算值为423.1813，确定化合物的分子式为c25h28o6，不饱和度为12；¹³c-nmr谱显示有25个碳信号(表2)，包括4个甲基，2个亚甲基，7个甲基以及12个季碳(包括一个羰基碳)，进一步通过分析化合物1的二维谱确定了其平面结构。

化合物2为白色固体；根据其esims准分子离子峰，确定化合物1的分子量为424；根据hresims[m+na]⁺m/z447.1777，c25h28nao6，计算值为447.1778，确定化合物的分子式为c25h28o6，不饱和度为12；通过分析其1d和2d谱图发现化合物2的谱图与化合物1的谱图具有极大的相似度，化合物2应具有化合物1相同的母核结构，通过仔细分析化合物2的hmbc和cosy相关谱图推测出化合物2为化合物1的差向异构体。当尝试对化合物1和化合物2进行单晶培养时，一直得不到合适的晶型，但是当将其1:1混合，用甲醇做溶剂时，获得了两者的混晶，晶体结构见图1所示，确定了其相对构型。进一步通过ecd计算，从而确定了化合物1和2的绝对构型分别为8r,12s,9's和8s,12r,9's。

表2化合物1和2的核磁数据(cd3cood3,600mhz/150mhz,δinppm,jinhz)

经过上述方法分离的目标化合物1和2分别命名为化合物lithocarpinola和lithocarpinolb，其结构式如式(ii)所示：

实施例2

采用srb法(skehanp,storengr,dominics.newcolorimetriccytotoxicityassayforanticancer-drugscreening[j].jnatlcanceinst,1990,82:1107–1112.)测试化合物lithocarpinola和lithocarpinolb的抗肿瘤活性。

1、试验用试剂：将本发明制备的化合物lithocarpinola和lithocarpinolb用二甲基亚砜(dmso)溶解得浓度为10mg/ml的母液，再用rpmi-1640培养基稀释至所需浓度。阳性对照为顺铂水溶液。

本实验所用肿瘤细胞株为肝癌细胞hepg-2、乳腺癌细胞mcf-7、神经胶质瘤细胞sf-268和非小细胞肺癌细胞a549。

2、实验方法：取对数生长期的hepg-2、mcf-7、sf-268和a549细胞，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95％后，用新鲜rpmi-1640培养基调整细胞浓度为3×10⁴个/ml，细胞接种于96孔板，每孔加入180μl的细胞悬液，并设3个空白孔调零，于37℃、5％co2培养箱培养24h。待细胞贴壁后，每孔加入20μl一定浓度的上述化合物lithocarpinola和lithocarpinolb的溶液，阴性对照加20μlrpmi-1640培养基，以顺铂作阳性对照。置于37℃、5％co2培养箱中培养72h后，加入50μl体积分数为50％的冷三氯醋酸水溶液固定细胞，4℃放置1h后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由体积分数1％冰醋酸水溶液配制的磺酰罗丹明b(sulforhodamineb，srb)4mg/ml溶液100μl/孔，室温中染色30min，去上清，用1％冰醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入200μl/孔，浓度为10mmol/ml的tris溶液，用酶标仪测定570nm处的吸光值(a)，用以下公式计算药物对细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率(％)＝(1-a样品组/a对照组)×100％。

3、实验结果：本发明制备的化合物lithocarpinola和lithocarpinolb对四株肿瘤细胞的细胞毒性如表1所示。此结果表明：本发明的化合物lithocarpinola和lithocarpinolb具有比较显著的抗肿瘤活性，因此，本发明为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用深海微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。

表1化合物lithocarpinola和lithocarpinolb的对癌细胞的抑制效果

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。