一种新型的抗人IgG1-Fc抗体试剂及其制备方法与流程

本发明涉及抗原检测技术领域，具体而言，涉及一种新型的抗人igg1-fc抗体试剂及其制备方法。

背景技术：

生命科学领域使用的抗体试剂分为单克隆抗体试剂和多克隆抗体试剂。

单克隆抗体试剂和多克隆抗体试剂的制备均已被业内技术人员所熟知。

单克隆抗体试剂的制备的其中一种经典的方法是：首先通过抗原免疫动物，然后将免疫后动物的b细胞与瘤细胞融合，通过形成杂交瘤细胞，进一步筛选得到阳性单克隆杂交瘤细胞株，使用阳性杂交瘤细胞制备腹水，通过腹水纯化获得大量单抗；或者分析阳性杂交瘤细胞株抗体基因序列，获得抗体序列后构建抗体表达载体，转染细胞，培养后收集细胞培养上清，经纯化获得大量单克隆抗体。阳性抗体序列获得的方式不限于来自于杂交瘤，也可以通过抗体展示技术及单细胞测序技术等获得。

多克隆抗体试剂的制备相对于单克隆抗体试剂的制备较简单一些，通过免疫动物后，采集血清，血清即可作为多克隆抗体试剂来使用，或者从血清中将抗体分离出来，制备成多克隆抗体试剂。

单克隆抗体试剂的缺点包括但不限于如下：识别抗原表位单一，灵敏度不如多克隆抗体，且抗原表位容易受实验过程中理化性质的影响，常导致抗原表位改变，使单克隆抗体试剂无法识别或敏感程度降低。

多克隆抗体试剂的缺点包括但不限于如下：特异性差，常有非特异反应和交叉反应。组成成分复杂，标准化生产较难，生产批次间存在差异等。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新型的抗人igg1-fc抗体试剂。

本发明的另一目的在于提供一种分离的核酸。

本发明的另一目的在于提供一种载体。

本发明的另一目的在于提供一种重组细胞或重组菌。

本发明的另一目的在于提供一种制备新型的抗人igg1-fc抗体试剂的方法。

本发明的另一目的在于提供一种检测试剂盒。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种新型的抗人igg1-fc抗体试剂，其包括：

多种抗体；在所述多种抗体中，任意两种抗体具有不同的可变区和相同的恒定区，或任意两种抗体具有不同的可变区和不同的恒定区，不同的抗体结合人igg1-fc抗原的不同抗原表位。

本发明提供的抗人igg1-fc抗体试剂其包括了可结合人igg1-fc抗原的不同抗原表位的多种抗体，采用本发明的抗体试剂可以避免igg1-fc抗原在不同位置的突变导致检测无响应的结果，提高检测结果成功率及准确性，避免产生假阴性结果。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，人igg1-fc抗原的不同抗原表位包括人igg1-fc-ch2位置和人igg1-fc-ch3位置。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述多种抗体分别是抗人igg1-fc-ch2抗原表位的第1抗体和抗人igg1-fc-ch3抗原表位的第2抗体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在所述多种抗体中，任意两种抗体的可变区具有不同的cdr区。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在所述多种抗体中，任意两种抗体的可变区具有相同的fr区。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在所述多种抗体中，任意两种抗体的可变区具有不同的fr区。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述抗体为包括完整结构的抗体及基因工程抗体例如scfv、fab、fab’、f(ab)’2等。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述多种抗体中的每种抗体标记有标记物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述标记物选自荧光标记物、酶标记物和放射性核素标记物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述荧光标记物选自alexa350、alexa405、alexa430、alexa488、alexa555、alexa647、amca、氨基吖啶、bodipy630/650、bodipy650/665、bodipy-fl、bodipy-r6g、bodipy-tmr、bodipy-trx、5-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素、5-羧基-2’,4’,5’,7’-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、cascadeblue、cy2、cy3、cy5、cy7、6-fam、丹磺酰氯、荧光素、hex、6-joe、nbd(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)、oregongreen488、oregongreen500、oregongreen514、pa18042790cificblue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、lajolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyaninb、藻蓝蛋白c、藻蓝蛋白r、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白r、reg、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、rox、tamra、tet、trit(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红；

优选的，所述酶标记物选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶；

优选的，所述放射性核素标记物选自¹¹⁰in、¹¹¹in、¹⁷⁷lu、¹⁸f、⁵²fe、⁶²cu、⁶⁴cu、⁶⁷cu、⁶⁷ga、⁶⁸ga、⁸⁶y、⁹⁰y、⁸⁹zr、⁹⁴mtc、⁹⁴tc、⁹⁹mtc、¹²⁰i、¹²³i、¹²⁴i、¹²⁵i、¹³¹i、^154-158gd、³²p、¹¹c、¹³n、¹⁵o、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、⁵¹mn、⁵²mmn、⁵⁵co、⁷²as、⁷⁵br、⁷⁶br、⁸²mrb和⁸³sr。

另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码上述的新型的抗人igg1-fc抗体试剂中的任意一种抗体。

另一方面，本发明提供了一种载体，其含有上述的分离的核酸。

另一方面，本发明提供了一种重组细胞或重组菌，含有上述的载体。

另一方面，本发明提供了一种制备新型的抗人igg1-fc抗体试剂的方法，其包括：分别培养上述重组细胞或重组菌或利用人igg1-fc抗原的不同抗原表位制备抗血清或杂交瘤细胞制备腹水，从产物中分离、纯化分别得到多种抗体；

将得到多种抗体组合，得到所述新型的抗人igg1-fc抗体试剂。

其中，上述重组细胞或重组菌可分别表达出多种不同的抗体，在该多种抗体中，任意两种抗体具有不同的可变区和具有相同的恒定区，不同的抗体结合人igg1-fc抗原的不同的抗原表位。

另一方面，本发明提供了一种检测试剂盒，其含有上述的新型的抗人igg1-fc抗体试剂。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中的pcag-migk-lc载体结构示意图。

图2为实施例1中的pcag-migg1-hc载体结构示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种新型抗人igg1-fc的二抗试剂

1小鼠抗人igg1-fc单抗制备

1.1抗原免疫

1.1.1抗原乳化：

取浓度为500μg/ml人igg溶液与等体积的弗式完全佐剂或弗式不完全佐剂乳化至乳浊液。

1.1.2抗原免疫：

取5只6周龄balb/c小鼠，皮下注射乳化好的抗原200μl，注射4个位点，每个位点50μl，即每只小鼠免疫50μg。

初次免疫使用弗氏完全佐剂乳化，第二次，第三次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化，免疫间隔2周。

1.1.3冲击免疫：

第三次免疫完成1个月后，开始进行冲击免疫，取200μl浓度为500mg/ml的抗原腹腔注射。

1.2脾细胞与sp2/0融合

1.2.1脾细胞分离：

冲击免疫后第4天，小鼠脱颈处死，取小鼠脾脏置于70μm筛网中研磨分离脾细胞。使用30ml无血清基础培养基清洗3遍脾细胞，400g离心10min，弃上清，最后使用20ml无血清基础培养基重悬细胞，0.4％的台盼蓝溶液稀释后用血球计数板计数。

1.2.2sp2/0细胞处理：

sp2/0细胞经0.05％胰酶消化处理，收集，300g离心5min弃上清，使用30ml无血清基础培养基清洗3遍sp2/0细胞，最后使用20ml无血清基础培养基重悬细胞，0.4％的台盼蓝溶液稀释后用血球计数板计数。

1.2.3细胞融合：

总脾细胞数与sp2/0按3:1的比例融合，吸取相应的sp2/0细胞与脾细胞混合，400g离心10min，弃上清。

轻拍管底，打散细胞，使用1ml枪缓慢加入1mlpeg(37℃预热)，持续1min，无搅动。加完后用枪头轻轻搅动1min。缓慢加入4ml无血清基础培养基(37℃预热)，轻轻搅动4min。

缓慢加入10ml无血清基础培养基(37℃预热)，37℃静置水浴15min。

缓慢加入30ml无血清基完全培养基(37℃预热)，400g离心7min，弃上清，再加入30ml完全培养基(37℃预热)，400g离心7min，弃上清，确保peg移除。

使用含hat的完全培养基重悬细胞，铺种96孔板，每孔200μl体积。

培养板置于37℃、5％co2条件下培养。

培养板分别在第4天和第6天进行半换液，第8天进行全换液，第10天进行杂交瘤鉴定及亚克隆。

1.3抗higg1-fc-ch2和higg1-fc-ch3杂交瘤鉴定

1).分装50ul共5×10⁵的cho-hcd47细胞于1.5mlep管中。

2).50ulpbs稀释后的hsirp(1-373)-higg1-ch2，hsirp(1-373)-higg1-ch3溶液分别与上述细胞悬液混合，4℃，静置15min。

3).离心弃上清，1mlpbs清洗细胞，离心弃上清。

4).取50ul待测杂交瘤上清分别重悬上述细胞沉淀，4℃，静置15min。

5).离心弃上清，1mlpbs清洗细胞，离心弃上清。

6).加入50ul稀释后的anti-mouseigg-fitc重悬细胞，4℃，静置15min。

7).离心弃上清，pbs重悬细胞，facs分析。

结果如下：

分别选择抗hsirp(1-373)-higg1-ch2和hsirp(1-373)-higg1-ch3的阳性杂交瘤，即所得抗体为抗higg1-fc-ch2和higg1-fc-ch3的特异性杂交瘤，抗higg1-fc-ch2的单抗命名为mab1，抗higg1-fc-ch3的单抗命名为mab2，对mab1和mab2进行序列分析。

1.4抗体序列获取

1.4.1rna提取

使用南京诺唯赞生物科技有限公司rnaisolatertotalrnaextractionreagent(货号：r401-01)试剂提取mab1和mab2杂交瘤细胞的总rna，实验步骤参考试剂说明书。

1.4.2反转录

使用takara公司reversetranscriptasem-mlv(rnaseh-)(货号：2641a)试剂分别对mab1和mab2的总rna进行反转录，实验步骤参考试剂说明书。

1.4.3扩增目的序列。

1.4.4测序及序列分析

将mab1和mab2的pcr产物测序。

1.4.5抗体表达载体构建

将获得的轻重链序列通过无缝连接的方式分别克隆至相应的表达载体上，轻链v区基因均克隆到经nheⅰ和xhoⅰ线性化的pcag-migk-lc载体(结构参考图1)上，重链v区基因均克隆到经xhoⅰ和nheⅰ线性化的pcag-migg1-hc载体(结构参考图2)上。

1.4.6序列验证

分别将mab1和mab2轻重链表达载体共转293t细胞，收集上清验证抗体活性，facs检测步骤同1.3。

2抗体表达及纯化

分别将mab1和mab2轻重链表达质粒转染真核细胞，通过proteina/g纯化获得大量抗体。

3抗体标记

对mab1和mab2抗体进行fitc荧光素标记。

4抗体组合

将mab1-fitc和mab2-fitc通过合适比例配制混合成新型多抗试剂，此组合抗体命名为mab1/2-fitc。

5验证实验

实验一：mab1-fitc和mab2-fitc分别检测higg1-fc均得出阳性信号。

步骤如下：

1).分装50ul共5×105的cho-hcd47细胞于1.5mlep管中。

2).50ulpbs稀释后的hsirp(1-373)-higg1-fc溶液与上述细胞悬液混合，4℃，静置15min。

3).离心弃上清，1mlpbs清洗细胞，离心弃上清。

4).取50ul稀释的mab1-fitc和mab2-fitc溶液分别重悬上述细胞沉淀，4℃，静置15minn。

5).离心弃上清，pbs重悬细胞，facs分析。

实验二：mab1-fitc和mab2-fitc分别检测突变后的higg1-fc，其中一种为阳性结果，另一种则为阴性结果。

步骤如下：

1).分装50ul共5×105的cho-hcd47细胞于1.5mlep管中。

2).50ulpbs稀释后的hsirp(1-373)-higg1-fc()溶液与上述细胞悬液混合，4℃，静置15min。

3).离心弃上清，1mlpbs清洗细胞，离心弃上清。

4).取50ul稀释的mab1-fitc和mab2-fitc溶液分别重悬上述细胞沉淀，4℃，静置15minn。

5).离心弃上清，pbs重悬细胞，facs分析。

实验三：组合后抗体mab1/2-fitc检测突变后的igg1-fc得出阳性信号。

步骤如下：

1).分装50ul共5×105的cho-hcd47细胞于1.5mlep管中。

2).50ulpbs稀释后的hsirp(1-373)-higg1-fc()溶液与上述细胞悬液混合，4℃，静置15min。

3).离心弃上清，1mlpbs清洗细胞，离心弃上清。

4).取50ul稀释的mab1/2-fitc溶液分别重悬上述细胞沉淀，4℃，静置15minn。

5).离心弃上清，pbs重悬细胞，facs分析。

结果显示本发明的新型抗体组合避免了由于被检测物质出现某抗原表位改变而导致的假阴性结果，从而保证了实验的成功率及准确性。

鉴定人igg类抗体实验中，由于fc段为介导抗体功能的位置，特定的实验需要进行特定的突变来到达改变抗体功能的目的，由此带来抗原表位的改变，可能导致原本能够结合人igg的二抗失去了结合能力，应用本发明的新型抗体组合有效的避免了检测无响应的结果，例如：突变发生在ch3上，则抗人iggfc-ch2的抗体不受影响，若突变发生在ch2上，则抗人iggfc-ch3的抗体结合不受影响，从而保证了实验的成功率及准确性，不会产生假阴性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。