本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种nt-bnp单克隆抗体的制备方法。
背景技术：
心力衰竭是指由于心脏的收缩功能和或舒张功能发生障碍不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。n端脑钠肽前体(nt-bnp)是脑钠肽前体原的蛋白酶裂解产物。脑钠肽前体原在转化酶依赖反应中形成两个多肽，bnp和n端脑钠肽前体。这两种多肽浓度在不同的心脏病患者中都有升高。心衰患者血液中这两种多肽的浓度与疾病的严重程度成正比，而心衰患者血浆nt-bnp浓度可达到几十个ng/ml，是检测心脏病患者的一项重要指标。
近年来针对nt-bnp的检测试剂盒得到了广泛的应用，多数基于抗原抗体反应，再配合相关显色试剂，因此检测较快且结果判别容易。现有技术中nt-bnp检测试剂盒的质量很大程度上由抗体性能所决定，一种敏感性强、结合速度快的抗体将有助于提升试剂盒的准确性和检测速度。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种nt-bnp单克隆抗体的制备方法，制备的nt-bnp单克隆抗体具有效价高，特异性强的特点。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种nt-bnp单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)免疫：初次免疫将弗氏完全佐剂皮下多点接种balb/c小鼠,初次免疫21天后再同样注射一次，初次免疫30天后小鼠尾静脉注射nt-bnp蛋白；
(2)脾细胞的制备：取已经免疫的balb/c小鼠，眼球采血，分离血清，将分离后的血清作为阳性血清，通过颈脱位处死小鼠，将小鼠消毒，在无菌的条件下，取出小鼠脾脏，取出脾细胞，放入含有10ml不完全培养基的平皿，用吸管吹打数次，制成脾细胞悬液，离心机离心，不完全培养基洗涤2次，将脾细胞重悬于10ml不完全培养基中，以不完全培养基调整脾细胞浓度为1×107个/ml；
(3)骨髓瘤细胞的制备：融合前10天复苏骨髓瘤细胞，放入37℃水中融化，融化后离心机离心，弃上清，用含10％胎牛血清的dmem培养基重悬，转入细胞瓶中，37℃、5％co2培养箱中培养,融合当天取对数生长期的骨髓瘤细胞，收集于50ml离心管中，用不完全培养基离心洗涤2次，将骨髓瘤细胞重新悬浮于不完全培养基中，用不完全培养基将骨髓瘤细胞稀释为1×106个/ml，培养箱中培养备用；
(4)饲养细胞的制备：细胞融合前2天，通过颈脱位处死未免疫的km雌性小鼠，酒精消毒，在无菌的条件下，取小鼠腹腔细胞，即饲养细胞，用hat培养基将饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为2*105个/ml，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml,放置37℃、5％co2培养箱中培养备用；
(5)细胞融合：将脾细胞与骨髓瘤细胞混合于融合管中，加入不完全培养基,充分混匀，离心机离心,弃上清，置于40℃水浴中预热，45s内加入1ml预热至40℃的融合剂进行融合，90s内加预热至37℃的不完全培养基，37℃静置10min,离心机离心,弃去上清，加入5mlhat培养基，重悬融合细胞，然后补加含饲养细胞的hat培养基至100ml,混匀，分装到已含有0.1ml饲养细胞的96孔板中，每孔加0.1ml融合细胞,然后将96孔板放置37℃、5％co2培养箱中培养,5天时用hat培养基半换液，10天时用ht培养基半换液，14天时用rpmi-1640培养基全换液，待杂交瘤细胞长至孔底面积1/10时吸出上清供抗体检测；
(6)筛选：将nt-bnp蛋白用包被液稀释至10ug/ml,以50ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2h，弃去孔内液体，洗涤液洗涤3次，每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2h，弃去孔内液体，洗涤液洗涤3次，每孔加50ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设阳性、阴性和空白对照，37℃孵育1h,洗涤液洗涤1次，拍干，每孔加底物液50ul,37℃反应20min,以2mol/l硫酸终止反应，在酶标仪上读取od值，若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照明确显色，则可用肉眼直接观察结果，显色为阳性孔；
(7)克隆：制备饲养细胞，用含20％血清的ht培养基稀释杂交瘤细胞悬液，使每毫升ht培养基中含10个杂交瘤细胞，按每毫升ht培养基加入1*105饲养细胞的比例在上述杂交瘤细胞悬液中加入饲养细胞，将加入饲养细胞的杂交瘤细胞分装至96孔板中，每孔量为0.1ml,每孔的杂交瘤细胞为1个，37℃、7.5％湿润培养7天，取上清进行抗体检测，取阳性孔的杂交瘤细胞扩大培养，并冻存，得到nt-bnp单克隆抗体杂交瘤细胞株。
(8)大规模制取单抗：成年balb/c小鼠腹腔接种液体石蜡，10天后小鼠腹腔接种用磷酸缓冲液稀释的nt-bnp单克隆抗体杂交瘤细胞,5天后，采集小鼠腹水，测抗体效价，冻干保存。
所述弗氏完全佐剂的制备方法为：将石蜡油20ml、甘露糖醇单油酸酯10g混合，混合后121℃灭菌20min，得到混悬液，将混悬液倒入研钵中，在混悬液中加入40ml浓度为5mg/ml的nt-bnp蛋白溶液，充分研磨，得到混合液，将200mg的卡介苗加热杀菌，加热温度为85℃，加热时间为1h,得到灭菌卡介苗，在混合液中加入灭菌卡介苗，充分研磨成为乳浊液。
进一步的，所述不完全培养基的制备方法如下：将96ml的rpmi-1640培养基原液、1ml的100*l-谷氨酸、1ml的青、链霉素双抗溶液、2ml的7.5％nahco3溶液、1ml的hepes溶液混合均匀，并调整ph为7.2，0.22um膜过滤除菌。
进一步的，所述洗涤液为ph7.2的磷酸缓冲液。
进一步的，所述包被液为ph9.6的碳酸盐缓冲液或ph8.0的tris-hcl缓冲液。
进一步的，所述封闭液含5％bsa的磷酸缓冲液。
进一步的，所述底物液为opd底物使用液。
进一步的，所述阳性对照为免疫鼠血清，阴性对照为骨髓瘤细胞培养上清液；
进一步的，所述融合剂为50％peg，50％peg的制备方法为：称取peg100020-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃水浴融化，0.6ml分装于青霉素小瓶中，盖紧，8磅高压蒸汽15分钟，-20℃存放备用，临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许7.5％nahco3调整ph至8.0，即得50％peg。
本发明具有有益效果：本发明制备的nt-bnp单克隆抗体特异性高、灵敏度高，主要用于制备检测nt-bnp的试剂盒，进而可以检测出nt-bnp在人体血浆内的浓度，帮助医生进行心脏疾病的诊断，增强了检验的特异性，增强了检验结果的准确性，提高了检测速度。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种nt-bnp单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)免疫：将弗氏完全佐剂皮下多点接种6周龄balb/c小鼠5只，接种剂量为0.2ml/只,21天后再同样注射一次，10天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选择滴度高的小鼠做融合试验，30天后小鼠尾静脉注射nt-bnp蛋白0.2ml/只；采用尾静脉注射抗原，使抗原对脾细胞作用更迅速而充分；
(2)脾细胞的制备：取已经免疫的balb/c小鼠，眼球采血，将血液在37℃放置0.5h，4℃放置1h，3000rpm离心5min，分离后的血清作为阳性血清，通过颈脱位处死小鼠，75％酒精浸泡5min后，在无菌的条件下，取出小鼠脾脏，将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中，用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏，使脾细胞进入平皿的不完全培养基中，用吸管吹打数次，制成脾细胞悬液，离心机1000r/min离心5min，用不完全培养基离心洗涤2次，然后将细胞重悬于10ml不完全培养基中混匀，取上述悬液，加台酚蓝染液作活细胞计数，以不完全培养基调整细胞浓度为1×107个/ml，获得10ml免疫脾细胞悬液。
(3)骨髓瘤细胞的制备：快速取出液氮罐中的骨髓瘤细胞，放入37℃水中，不停摇动冻存管，使其尽快融化，1000rpm/min离心5min后弃上清，用含10％胎牛血清的dmem培养基重悬，转入细胞瓶中，37℃、5％co2培养箱中培养,融合前10天复苏骨髓瘤细胞，融合当天取细胞形态均一、边界清晰、生长状态良好的骨髓瘤细胞，用弯头滴管将细胞轻轻吹下，收集于50ml离心管中，1000r/min离心5min,弃去上清，加入30ml不完全培养基，再次离心洗涤一次，然后将骨髓瘤细胞重新悬浮于不完全培养基中，混匀，细胞计数板计数，将细胞稀释为106个/ml，获得20ml骨髓瘤细胞悬液，放置37℃、5％co2培养箱中融合备用；
(4)饲养细胞的制备：细胞融合前2天，通过颈脱位处死未免疫的8周龄km雌性小鼠，75％酒精浸泡5min后，在无菌的条件下，用消毒剪掀起腹部皮肤，暴露腹膜，75％酒精棉擦拭腹膜，注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，针头留置在腹腔内，另一只手持75％酒精棉轻轻按摩腹部1min后，注射器吸出注入的培养液，1000r/min离心5min,弃上清，用5mlhat培养基将沉淀饲养细胞悬浮，调整饲养细胞浓度为2*105个/ml，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml,放置37℃、5％co2培养箱中培养备用；
(5)细胞融合：将1*108脾细胞与2*107骨髓瘤细胞混合于50ml融合管中，加入不完全培养基至30ml,充分混匀，1000r/min离心5min,弃上清，轻击融合管管底，使沉淀细胞松散，置于40℃水浴中预热，用1ml吸管在预热45s时加入1ml预热至40℃的50％peg,轻轻搅拌，用10ml吸管在90s内加20-30ml温度为37℃的不完全培养基，37℃静置10min,2000r/min离心10min,弃去上清，加入5mlhat培养基，重悬融合细胞，然后补加含饲养细胞的hat培养基至100ml,混匀，分装已含有0.1ml饲养细胞的96孔板，每孔加0.1ml融合细胞,然后将96孔板放置37℃、5％co2培养箱中培养,5天时用hat培养基换出1/2培养基，10天时用ht培养基换出hat培养基，14天时用rpmi-1640培养基换出ht培养基，待杂交瘤细胞长至孔底面积1/10时吸出上清供抗体检测；
(6)筛选：将nt-bnp蛋白用包被液稀释至10ug/ml,以50ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2h，弃去孔内液体，洗涤液洗涤3次，每次3分钟，拍干，每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2h，弃去孔内液体，洗涤液洗涤3次，每孔加50ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设阳性、阴性和空白对照，阳性对照为免疫鼠血清，阴性对照为骨髓瘤细胞培养上清，37℃孵育1h,洗涤液洗涤1次，拍干，每孔加底物液50ul,37℃反应20min,以2mol/l硫酸终止反应，在酶标仪上读取od值，若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照明确显色，则可用肉眼直接观察结果，显色为阳性孔；
(7)克隆：制备饲养细胞，用含20％血清的ht培养基稀释杂交瘤细胞悬液，使每毫升ht培养基中含10个杂交瘤细胞，按每毫升ht培养基加入1*105饲养细胞的比例在上述杂交瘤细胞悬液中加入饲养细胞，将加入饲养细胞的杂交瘤细胞分装至96孔板中，每孔量为0.1ml,每孔的杂交瘤细胞为1个，37℃、7.5％湿润培养7-10天，在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清进行抗体检测，取抗体检测阳性孔的杂交瘤细胞扩大培养，并冻存，得到nt-bnp单克隆抗体杂交瘤细胞株。
(8)大规模制取单抗：成年balb/c小鼠腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.5ml,10天后腹腔接种用pbs或无血清培养基稀释的nt-bnp单克隆抗体杂交瘤细胞，每只小鼠5*105/0.2ml,间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水，每只小鼠可采5-10ml腹水，将腹水2000r/min离心5min,收集上清，测抗体效价，冻干保存。
所述弗氏完全佐剂的制备方法为：将石蜡油20ml、甘露糖醇单油酸酯10g混合，混合后121℃灭菌20min，得到混悬液，将混悬液倒入研钵中，在混悬液中加入40ml浓度为5mg/ml的nt-bnp蛋白溶液，充分研磨，得到混合液，将200mg的卡介苗加热杀菌，加热温度为85℃，加热时间为1h,得到灭菌卡介苗，在混合液中加入灭菌卡介苗，充分研磨成为乳浊液。
所述不完全培养基的制备方法如下：将96ml的rpmi-1640培养基原液、1ml的100*l-谷氨酸、1ml的青、链霉素双抗溶液、2ml的7.5％nahco3溶液、1ml的hepes溶液混合均匀，并调整ph为7.2，0.22um膜过滤除菌。
进一步的，所述洗涤液为ph7.2的磷酸缓冲液。
进一步的，所述包被液为ph9.6的碳酸盐缓冲液或ph8.0的tris-hcl缓冲液。
进一步的，所述封闭液含5％bsa的磷酸缓冲液。
进一步的，所述底物液为opd底物使用液。
进一步的，所述50％peg的制备方法为：称取peg100020-50g于三角瓶中，盖紧，60-80℃水浴融化，0.6ml分装于青霉素小瓶中，盖紧，8磅高压蒸汽15分钟，-20℃存放备用，临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许7.5％nahco3调整ph至8.0，即得50％peg。
本发明提供的单克隆抗体制备方法所用试验动物、生物制剂、试剂、仪器均可由市场购得。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。