齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于植物基因工程和生物
技术领域：
，具体涉及齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用。
背景技术：
：姜状三七(panaxzingiberensisc.y.wuetk.m.feng)为五加科人参属多年生草本植物，分布于云南东南部、尼泊尔中部、不丹高海拔地区、缅甸东枝、掸邦等地。姜状三七根茎肉质如姜块状，属濒危种，由于过度开发，目前野生资源极其稀少。姜状三七有散瘀、定痛、止血等功效，主治跌打损伤、骨折、吐血、功能性子宫出血、外伤出血等症。皂苷为姜状三七的主要活性成分，主要含有达玛烷型皂苷和齐墩果烷型皂苷，其中以齐墩果烷型皂苷为主，如人参皂苷ro，竹节参皂苷iv和竹节参皂苷iva。齐墩果烷型皂苷具有抗肿瘤、降血脂、降血糖、保肝等药理作用。齐墩果烷型皂苷是从齐墩果酸3-o-β-葡糖醛酸转化而来的，而齐墩果酸3-o-β-葡糖醛酸则是齐墩果酸经过一种未知的葡糖醛酸转移酶(oagt)催化形成的。尽管在其他人参属植物中也含有丰富的齐墩果烷型皂苷，并已报道了它们的转录组信息，但是没有鉴定出参与齐墩果烷型皂苷合成的糖基转移酶。因此如何克服现有技术的不足是目前植物基因工程和生物
技术领域：
亟需解决的问题。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用，该齐墩果酸葡糖醛酸转移酶能在合成齐墩果烷型皂苷的前体中起作用，从而为鉴定齐墩果烷型皂苷的其他修饰奠定基础。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：齐墩果酸葡糖醛酸转移酶，所述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的氨基酸序列如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.4所示。本发明同时保护编码上述述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的基因。具体为：所述基因的编码序列是seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7或seqidno.8所示的核苷酸序列。本发明的另一目的是提供一种含有齐墩果酸葡糖醛酸转移酶基因的重组载体，是将seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7或seqidno.8所示基因直接与不同表达载体连接所构建的重组载体。同时，本发明保护重组载体转化得到的重组基因工程菌。本发明还涉及上述齐墩果酸葡糖醛酸转移酶在合成齐墩果烷型皂苷中的应用。具体的应用方法是：以齐墩果酸葡糖醛酸转移酶为催化剂，以尿苷二磷酸葡糖醛酸为底物催化齐墩果酸生成齐墩果酸3-o-β-葡糖醛酸。本发明申请人发现姜状三七是研究齐墩果烷型皂苷合成的理想材料，在本发明中，利用illuminahiseqtm2000测序平台建立了姜状三七的转录组数据库，并功能识别了在齐墩果烷型皂苷生物合成中的关键步骤，即催化齐墩果酸形成齐墩果酸3-o-β-葡糖醛酸的葡糖醛酸转移酶编码酶基因。本发明首次对筛选到的4个编码齐墩果酸葡糖醛酸转移酶的基因(3个来自姜状三七，1个来自另一种含有齐墩果烷型皂苷的人参属植物竹节参)进行酶活性检测，发现这种齐墩果酸葡糖醛酸转移酶特异性地将葡糖醛酸转移到齐墩果酸的c-3位上，形成齐墩果酸3-o-β-葡糖醛酸。本发明为姜状三七研究提供了有价值的遗传信息，为齐墩果烷型人参皂苷的生物合成提供了候选基因，为进一步进行基因功能识别奠定了基础。本发明与现有技术相比，其有益效果为：1、本发明的齐墩果酸糖基转移酶能够以尿苷二磷酸葡糖醛酸(udp-glca)为糖基供体，特异性地催化齐墩果酸c3位的糖基化反应。2、本发明为姜状三七研究提供了有价值的遗传信息，为齐墩果烷型人参皂苷的生物合成提供了候选基因，为进一步进行基因功能识别奠定了基础。3、本发明克隆的齐墩果酸糖基转移酶是在皂苷合成过程中关键步骤的酶，这对于解析齐墩果烷型皂苷的合成途径，揭示人参属植物中人参皂苷合成的分子机理，进而为建立药用植物三萜皂苷异源合成系统奠定基础，对于促进人参属植物三萜皂苷生物合成，提高其产量具有重要意义。附图说明图1为参与人参皂苷生物合成的ugt聚类分析图。其中，标注三角形的6条unigene与bvugt73c10–ugt73c13同源性较高。据报道，欧洲山芥ugt73c10–ugt73c13可催化齐墩果烷型皂苷齐墩果酸和常春藤皂苷元的3-o-糖基化(augustin等，2012)，因此推测这6条基因可能具有催化齐墩果酸3-o-糖基化的作用。各序列在ncbi数据库中的编号如下：人参，ugtpg101(akq76389)，ugtpg1(aie12479)，ugtpg100(akq76388)，pgugt94q2(agr44632)，ugtpg29(aka44579)，ugtpg45(aka44586)，pgugt74ae2(agr44631)；西洋参，pq3-o-ugt2(ale15280)；蒺藜苜蓿mtugt71g1(aaw56092)，mtugt73f3(act34898)，mtugt73k1(aaw56091)；水稻，osugt707a3(bac83989)，osugt706c1(bab68090)，osugt706d1(bab68093)，osugt709a4(bac80066)，osrugt-10(bad69345)；番红花，csugt707b1(ccg85331)，csgt45(acm66950)，csugt84a22(alo19890)，csugt78a14(alo19888)；王不留行，svugt74m1(abk76266)；大豆，gmugt73f4(bam29363)，gmugt73f2(bam29362)，gmsgt2(bai99584)，gmsgt3(bai99585)；刺茄，sagt4a(bad89042)；拟南芥，atugt73c5(oap09184)，atugt73c6(oap07438)；欧洲山芥，bvugt73c10(afn26666)，bvugt73c11(afn26667)，bvugt73c12(afn26668)，bvugt73c13(afn26669)。图2为pczn1-jzsqunigene0023775(rc)测序验证与预期序列进行比对图。图3为重组质粒pczn1-jzsqunigene0023775(rc)酶切鉴定结果，其中，标记(marker)：200,500,800,1200,2000,3000,4500；m：标记；1:酶切前质粒；2:酶切后质粒。图4为重组表达载体图谱；其中，mcs：多克隆位点；tee：翻译增强元件；cspa：冷休克蛋白；lac：乳糖操纵子；amp：氨苄青霉素。图5为蛋白表达鉴定sds-page分析图；其中，m:蛋白质分子质量标准；1:未诱导；2:诱导后；3:诱导破碎后上清；4:诱导破碎后沉淀。图6为蛋白纯化sds-page分析图；m:蛋白质分子质量标准；1:破碎后处理样品；2:流出；3:洗脱。图7为蛋白westernblot鉴定分析图；其中，m:蛋白质分子质量标准；1:纯化后样品。图8为根据已有报道推测的人参皂苷生物合成途径；其中，aact，乙酰辅酶a乙酰基转移酶；hmg-coa，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a；hmgs，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a合成酶；hmgr，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶；mvk，甲羟戊酸激酶；pmk，磷酸甲羟戊酸激酶；mvd，甲羟戊酸二磷酸脱羧酶；fpp，法尼基焦磷酸；dmapp，二甲丙烯二磷酸；dxp，1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸盐；mep，甲基赤藓糖醇磷酸酯；fps，法尼基焦磷酸合成酶；ss，鲨烯合成酶；se，鲨烯环氧酶；dds，达玛烯二醇合成酶；β-as，β-香树脂合成酶；cas，环阿屯醇合酶；las，羊毛甾醇合酶；ppds，原人参二醇合成酶；ppts，原人参三醇合成酶；cyp，细胞色素p450；glc，β-d-吡喃葡萄糖基；ara(f)，a-l-阿拉伯呋喃基；glca，β-d-吡喃葡糖醛酸苷；oagt，齐墩果酸葡糖醛酸转移酶；glct-n表示尿苷二磷酸糖类：糖基转移酶(glct)在第n个碳原子上催化第一个糖基化反应；glct-n(2)表示在第n个碳原子上催化第二个糖基化反应；ugrdgt，尿苷二磷酸葡萄糖：人参皂苷rd糖基转移酶。图9为齐墩果烷型皂苷生物合成中的关键步骤，即葡糖醛酸转移酶催化齐墩果酸形成齐墩果酸3-o-β-葡糖醛酸。图10为从聚类分析中得到的6条unigene中，筛选出在姜状三七根中高表达的3条unigene进行酶活检验，注：另外1条unigene基因来自于竹节参，从图1可知它与姜状三七这3条unigene具有较高同源性。图11为hplc分析齐墩果酸葡糖醛酸转移酶(oagt)对齐墩果酸c-3位的糖基化作用谱图；以变性的齐墩果酸葡糖醛酸转移酶纯化蛋白为对照，对筛选到的4个编码葡糖醛酸转移酶的基因(3个来自姜状三七，1个来自竹节参)进行体外酶活检测，发现这四个重组蛋白不能将尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glc)作为糖供体，但能以尿苷二磷酸葡糖醛酸(udp-glca)作为糖供体，特异性地将葡糖醛酸转移到齐墩果酸的c-3位上，产生齐墩果酸3-o-β-葡糖醛酸。在酶活验证试验中，姜状三七unigene0023775，unigene0022968和unigene0004252分别命名为pzgat1，pzgat2和pzgat3，竹节参unigene0053366命名为pjgat。图中，1：齐墩果酸对照品(authenticoa)；2：齐墩果酸3-o-β-葡糖醛酸(authenticoaga)；control：对照；“+”表示反应体系中有两种物质的参与，如pzgat1+udp-glca，表示反应体系中加入重组蛋白pzgat1和尿苷二磷酸葡糖醛酸(udp-glca)。图12为齐墩果酸葡糖醛酸转移酶基因编码的蛋白在齐墩果酸糖基化作用中酶活反应体系的液相色谱-质谱(lc-ms)示意图；a.重组蛋白酶活检测的总离子流图。其中oleanolicacid为底物齐墩果酸标准品，3-o-β-glucuronideoleanolicacid为产物齐墩果酸3-o-β-葡糖醛酸标准品。b.负离子模式下齐墩果酸糖醛酸化产物的质谱图，其中右上图为齐墩果酸3-o-β-葡糖醛酸，631.3850是[m-h]-，455.3529是[m-gla-h]-(其中gla为葡糖醛酸基glucuronide，h为质子)。右下图为齐墩果酸，455.3529是[m-h]-。esi负离子模式下皂苷类成分特征碎片离子主要是[m-h]-，在二级质谱途中，皂苷易发生糖苷键的断裂，产生去糖基化离子。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本发明除非另有说明，否则百分号为质量百分数。为了找到齐墩果酸糖基转移酶(ogat)基因，在姜状三七和珠子参的转录组数据中搜索与糖基化相关的基因，将这些基因与其他物种中已知功能的糖基转移酶基因聚类构建进化树(图1)，从中找到预测其功能为c-3位糖基化，并在根部具有高表达的4个unigene作为ogat的候选基因进行酶活检测，包括来自姜状三七的unigene0023775、unigene0022968和unigene0004252，以及珠子参unigene0053366，分别命名为pzgat1、pzgat2、pzgat3和pjgat，氨基酸序列依次对应seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4，核苷酸序列依次对应seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8。以pzgat1为例，说明蛋白重组的过程。pzgat2、pzgat3和pjgat的蛋白重组过程与之相同。采用基于全基因合成方法pas(pcr-basedaccuratesynthesis)，设计全长拼接引物，合成基因姜状三七unigene0023775(rc)，后面缩写为jzsqunigene0023775(rc)，酶切连接连入载体pczn1；获得的重组质粒pczn1-jzsqunigene0023775(rc)转入top10克隆菌株和arctic-expresstm表达菌株。使用异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导表达目的蛋白jzsqunigene0023775(rc)。优化表达条件，将诱导条件调整至37℃，经分析目标蛋白主要呈包涵体形式。通过变复性的方式，重溶目标蛋白jzsqunigene0023775(rc)，ni柱亲和纯化获得目的蛋白。具体实验方法及结果如下：1.pczn1-jzsqunigene0023775(rc)测序验证将获得的重组质粒pczn1-jzsqunigene0023775(rc)转入top10克隆菌株，具体的转入方法是：(1)将重组质粒1μl加入100μltop10感受态细菌中，置冰上20min；(2)42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μllb培养液；(3)37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml氨苄的lb平板，37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆子测序。测序结果与预期序列进行比对，截取部分比对序列如图2所示。2.质粒酶切鉴定2.1酶切体系其中，质粒为：jzsqunigene0023775酶切鉴定结果如图3所示。酶切后的质粒od260/od280:1.82。3.原核蛋白表达3.1原核蛋白的表达鉴定pzgat1蛋白大小理论分子量为56.857kd左右(含组氨酸标签(his-tag))，氨基酸序列翻译如下：3.1.1pczn1-jzsqunigene0023775(rc)载体转化至大肠杆菌表达体系(arcticexpress)(1)将pczn1-jzsqunigene0023775(rc)质粒1μl加入100μl感受态细菌(arcticexpress)中，置冰上20min；(2)42℃热激90s，迅速置冰中5min；加入600μllb培养液；(3)37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml氨苄青霉素(amp)的lb平板，37℃倒置培养过夜。3.1.2iptg诱导pczn1-jzsqunigene0023775(rc)载体融合蛋白的表达(1)挑取转化平板(amp+lb)上的单克隆接种于含50μg/mlamp的3mllb培养液的试管中，37℃、220r/min振摇过夜；(2)次日按体积比1:100接种于30ml含50μg/ml氨苄青霉素(amp)的lb培养液中，37℃、220r/min振摇至菌体od600为0.6-0.8；(3)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；(4)向剩余的培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.5mm，37℃、220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达；(5)取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000r/mim，离心10min，弃上清，用ph7.4磷酸盐缓冲液重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。(6)进行sds-page胶浓度12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测分析，考马斯亮蓝染色显带，结果如图5所示。3.1.3表达鉴定结果分析利用异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导蛋白表达，经sds-page胶浓度12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，目标蛋白主要存在于沉淀中，结果如图5所示。3.2包涵体蛋白的变复性(1)将菌体沉淀重悬于20ml裂解液[20mmtris-hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液)含有1mmpmsf(苯甲基磺酰氟)和蛋白酶抑制剂混合物]，ph8.0)，超声破碎，超声功率400w，超声方式为：工作4s，间歇8s，共20min；(2)将超声破碎的细胞裂解液于4℃10000r/mim离心20min，收集沉淀(包涵体)；(3)使用包涵体洗涤液[20mmtris(三羟甲基氨基甲烷)，1mmedta，2m尿素，1mnacl，1％tritonx-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，ph8.0]洗涤包涵体3次；(4)用30ml溶解缓冲液[20mmtris(三羟甲基氨基甲烷)，5mmdtt(二巯基苏糖醇)，8m尿素，ph8.0]溶解包涵体，4℃放置过夜；之后于室温下，10000r/mim离心15min；(5)将上一步离心的上清液逐步滴加(1ml/min)至120ml含有20mmtris-hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液)、0.15mnacl(氯化钠)，ph8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释(1:4)缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于2l含有20mmtris-hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液)、0.15mnacl(氯化钠)，ph8.0溶液中透析过夜。3.3融合蛋白的镍(ni)柱亲和纯化及结果分析3.3.1ni柱纯化(1)利用低压层析系统，将上述透析液离心后的上清以0.5ml/min流速上样至ni-idabinding-buffer(镍-亚氨基二乙酸结合缓冲)预平衡的ni-ida-sepharose(镍-亚氨基二乙酸-琼脂糖凝胶)cl-6b亲和层析柱；(2)用ni-idabinding-buffer(镍-亚氨基二乙酸结合缓冲)以0.5ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线；(3)用ni-idawashing-buffer(镍-亚氨基二乙酸洗涤缓冲液)[20mmtris-hcl，20mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0]以1ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线；(4)用ni-idaelution-buffer(镍-亚氨基二乙酸洗脱缓冲液)[20mmtris-hcl，250mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；(5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用2l含有20mmtris-hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液)，0.15mnacl(氯化钠)，ph8.0进行透析过夜；(6)透析后的纯化蛋白进行胶浓度12％sds-page(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，结果如图4所示。3.3.2纯化结果分析包涵体经过变复性的方式，重溶目标蛋白，通过镍柱亲和纯化获得目标蛋白，进行12％sds-page(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，结果如图6所示，纯化到相应的目的蛋白。3.4westernblot(蛋白质印迹法)及结果分析3.4.1westernblot(蛋白质印迹法)步骤(1)取纯化透析后的样品上样5μl(2)上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90v跑完积层胶，再将电压升至200v直到电泳结束。(3)电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100v转膜，为1.5h，恒流250ma(4)电转结束后，取下膜后先用pbst(含吐温-20的磷酸盐缓冲液)洗涤4次，每次5min。(5)将膜置于5％(w/v)脱脂奶粉封闭液中封闭37℃1h。(6)用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。(7)次日将膜取出后用pbst(含吐温-20的磷酸盐缓冲液)洗膜4次，每次5min，(8)用含5％(w/v)牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1h。(9)反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5min。(10)ecl(电化学发光)显影，曝光。一抗是antihismab((小鼠)抗his标签单抗)，1:1000二抗是hrp-羊抗兔igg1:5000。稀释比例如表1所示。表1编号一抗名称稀释比例二抗名称稀释比例1his1:1000羊抗兔1:50003.4.2westernblot(蛋白质印迹法)结果分析经westernblot验证，纯化到的蛋白即为所表达的目的蛋白。通过以上步骤获得的重组蛋白用于后续酶活验证试验中。预测皂苷合成的可能途径(图8)，并以途径中的化合物作为底物对该糖基转移酶进行酶活反应试验，酶活反应分别以尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glucose)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(udp-glucuronide)作为糖基供体，齐墩果酸为糖基受体进行，反应完后用hplc检测是否有产物生成。酶活检测条件：200μl混合物中含有25mmtaps-hcl(ph8.6)，1mmdtt，1mm受体底物齐墩果酸，5mmudp-葡萄糖或5mmudp-葡萄糖醛酸和50μg纯化的重组酶，利用纯化的标记蛋白组蛋白在沸水中加热20min变性后作为对照。将酶反应体系在30℃下温育30min后，加入200μl甲醇终止反应。最后，通过高效液相色谱(hplc)方法进行产物鉴定和检测。hplc测定条件：高效液相色谱分析利用安捷伦1260系列高效液相色谱仪完成。色谱柱为安捷伦zorbaxsb-c18(250mm×4.6mm,5μm)，流动相为质量浓度为0.1％磷酸水溶液(a)-乙腈(b)，梯度洗脱：0-10min，20％b；10-18min，50％b；18-26min，100％b。流速1.0ml·min-1，检测波长203nm，柱温25℃，进样体积10μl。超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(uplc-qtof-ms)分析条件：仪器为美国waters公司iuplc-qtof-ms/ms仪器；色谱柱为acquityuplcbehc18(2.1x100mm，1.7μm)，流动相：a(质量浓度为0.1％甲酸的水溶液)，b(乙腈)，梯度洗脱：0–1.5min，20％b；1.5–2.0min，35％b；2.0–4.0min，50％b；4.0–6.0min，65％b；6.0–7.5min，85％b；7.5–8.0min，95％b；8.0–10.0min，20％b。流量：0.5ml·min-1；柱温：35℃，分析时间为10min，进样量1.0μl，采用自动进样方式。质谱参数：离子扫描模式为esi负离子扫描；扫描范围为100-1200da；离子源温度100℃；去溶剂气温度：400℃；去溶剂气体流速：800l·h-1；毛细管电压：2.5kv(负离子)；锥孔电压：40v；低能量碰撞能：6v；高能量碰撞能：30-50v。结果如图11所示，与对照相比，4个编码葡糖醛酸转移酶的基因pzgat1、pzgat2、pzgat3和pjgat重组蛋白，以齐墩果酸作为糖基受体，以尿苷二磷酸葡糖醛酸(udp-glca)为糖基供体的反应，经检测有产物齐墩果酸3-o-β-葡糖醛酸生成，而以尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glc)为糖基供体的反应没有上述产物的生成。此结果说明，该齐墩果酸糖基转移酶在皂苷的合成过程中，作用于齐墩果酸的糖基化修饰，使齐墩果酸在c3位被糖基化后最终形成齐墩果酸3-o-β-葡糖醛酸。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表seqidno.1seqidno.2seqidno.3seqidno.4seqidno.5seqidno.6seqidno.7seqidno.8序列表<110>云南农业大学<120>齐墩果酸葡糖醛酸转移酶及其编码基因和应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>492<212>prt<213>人工序列()<400>1metserlysmetglnasnglnleuhisphevalleuvalproleuleu151015alaglnglyhismetileprometileaspmetalaargleuleuala202530glnhisglyvalvalvalserleuvalthrthrprohisasnalaser354045argphealaserthrilehisargalaargaspserglyleulysile505560glnleuileglnilepropheprotrpglngluvalglyleupropro65707580glycysgluasnleuaspserleuproserargaspleuileglyasn859095phepheseralaleuasnlysleuglnglnproleugluglnhisleu100105110glngluleumetproproproasncysileileserasplystyrleu115120125sertrpthrthrlysthralaglnlysphehisvalproargleuval130135140phehisglymetcyscyspheserleuleuserserhisasnilearg145150155160leutyrasnalahisleuservalthrseraspserglnpropheval165170175valproglymetproglnargvalgluilethrlysalaglnleupro180185190glyalaphevalthrleuproaspleuaspaspileargaspglnmet195200205a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