牛白血病毒快速检测方法与流程

本发明涉及病毒检测领域，具体的说是一种牛白血病毒快速检测方法。

背景技术：

牛白血病（bovineleukemia）是由牛白血病病毒（bovineleukemiavirus,blv）所引起的以淋巴细胞持续性增生为特征的一类具有传染性的肿瘤性疾病。本病于1871年首次发现，目前已经遍布世界各养牛国家，给养牛业造成了巨大的经济损失，成为影响世界养牛业发展的重要传染病之一。

牛白血病的传播途径较多，例如分泌物传播、乳源性传播、寄生虫传播、精液和胚胎移植传播，以及血源性传播等等。研究表明本病主要以血源性传播为主。因此在控制本病的传播过程中应该严把血源性传播的关口。

牛白血病病毒（blv）属于逆转录病毒科（retroviridae），为单股rna病毒。病毒在感染宿主细胞后，前病毒（provirus）以dna的形式嵌入宿主细胞的染色体基因组中或者以闭合的环状游离存在。末端重复序列（ltr）为前病毒最为保守的部分。病毒在感染后通常为以前病毒的形式存在于宿主细胞的染色体中。这为疫苗的研制和开发带来了难题。因此，至今还没有有效的疫苗可以预防此病，该病的预防措施主要以净化为主。

目前牛白血病的检测方法主要为血清学检测方法，如琼脂扩散试验、补体结合试验、中和试验、酶联免疫吸附试验（elisa）等。由于本病的潜伏期较长，抗体产生较慢，血清学检测方法难以满足本病的净化需求。而目前直接检测抗原的检测技术较少，且费时费力灵敏度欠佳，难以满足本病的净化需求。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，灵敏度高耗时少的pcr检测技术已广泛地应用于动物疾病诊断。因此，将pcr检测技术应用于牛白血病病毒的检测具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种牛白血病毒快速检测方法，该方法基于巢式pcr检测方法，能快速检测血液样品中牛白血病病毒，其灵敏度可检测到1fg的dna模板，是一般的pcr检测敏性的100倍，可以精准的检测到样品中微量存在的病毒，为牛白血病的检测和净化提供可靠的检测手段。

为解决上述技术问题，本发明的牛白血病毒快速检测方法包括如下步骤：

步骤1）采集发病牛及隐性带毒牛的外周血作为血液样品；

步骤2）利用核酸抽提试剂盒提取血液样品dna；

步骤3）对血液样品dna进行巢式pcr检测；

第一重pcr检测引物采用片段大小为399bp的ltr1-1/ltr1-2；

第二重pcr的检测引物采用片段大小279bp的ltr2-1/ltr2-2；

按下列配比建立第一重pcr反应体系：

10×extaq缓冲液5.0μl，

dntp(2.5meach)4.0μl，

mgcl2(25um)4.0μl，

ex-taq酶0.4μl，

ltr1-1(25pmol)0.5μl，

ltr1-2(25pmol)0.5μl，

血液样品dna1.0μl补rnase-free水至50μl；

第一重pcr反应程序为：94℃5min；94℃1min,58℃1min,72℃1min,35个循环；72℃10min；反应结束后4℃恒温保存；

按下列配比建立第二重pcr反应体系：

10×extaq缓冲液5.0μl，

dntp(2.5meach)4.0μl，

mgcl2(25um)4.0μl，

ex-taq酶0.4μl，

ltr2-1(25pmol)0.5μl，

ltr2-2(25pmol)0.5μl，

第一重pcr产物1.0μl补rnase-free水至50μl；

第二重pcr反应程序为：94℃5min；94℃1min,58℃1min,72℃1min,35个循环；72℃10min；反应结束后4℃恒温保存；

步骤4）结果判定；

取第二重pcr产物5.0μl加1μl（6×）上样缓冲液混匀加样；100v电泳40min后，放入10mg/ml的溴化乙锭溶液中染色10min以上，在凝胶成像系统下观察并拍照；出现目的条带的判为阳性，无目的条带的判为阴性。

其中，检测引物ltr1-1的序列为5'–ccccgtaaaccagacagaga–3’；

检测引物ltr1-2的序列为5'–aagccagacgcccttggagc–3’；

检测引物ltr2-1的序列为5'–ccgaaaaatccacaccctga–3’；

检测引物ltr2-2的序列为5'–aggaggcaaaggagagagt–3’。

本发明的有益效果是：本发明直接以血液作为检测样本，不需要进行特殊处理，便于采集、保存和运输；针对牛白血病病毒（blv）前病毒最为保守的部分ltr设计引物扩增，保证了本方法的准确性和稳定性；本发明基于巢式pcr检测方法，能快速检测血液样品中牛白血病病毒，其灵敏度可检测到1fg的dna模板，是一般的pcr检测敏性的100倍，为牛白血病的临床诊断提供了快速准确的诊断工具，对牛白血病的流行病学调查及净化的实施具有重要的现实意义。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

图1为本发明的pcr检测结果电泳图；

图2为临床血液样品检测结果电泳图。

具体实施方式

参照附图，本发明的牛白血病毒快速检测方法，其特征是包括如下步骤：

步骤1）采集发病牛及隐性带毒牛的外周血作为血液样品；

步骤2）利用核酸抽提试剂盒提取血液样品dna；

步骤3）对血液样品dna进行巢式pcr检测；

第一重pcr检测引物采用片段大小为399bp的ltr1-1/ltr1-2；

第二重pcr的检测引物采用片段大小279bp的ltr2-1/ltr2-2；

其中，检测引物ltr1-1的序列为5'–ccccgtaaaccagacagaga–3’；

检测引物ltr1-2的序列为5'–aagccagacgcccttggagc–3’；

检测引物ltr2-1的序列为5'–ccgaaaaatccacaccctga–3’；

检测引物ltr2-2的序列为5'–aggaggcaaaggagagagt–3’

按下列配比建立第一重pcr反应体系：

10×extaq缓冲液5.0μl，

dntp(2.5meach)4.0μl，

mgcl2(25um)4.0μl，

ex-taq酶0.4μl，

ltr1-1(25pmol)0.5μl，

ltr1-2(25pmol)0.5μl，

血液样品dna1.0μl补rnase-free水至50μl；

第一重pcr反应程序为：94℃5min；94℃1min,58℃1min,72℃1min,35个循环；72℃10min；反应结束后4℃恒温保存；

按下列配比建立第二重pcr反应体系：

10×extaq缓冲液5.0μl，

dntp(2.5meach)4.0μl，

mgcl2(25um)4.0μl，

ex-taq酶0.4μl，

ltr2-1(25pmol)0.5μl，

ltr2-2(25pmol)0.5μl，

第一重pcr产物1.0μl补rnase-free水至50μl；

第二重pcr反应程序为：94℃5min；94℃1min,58℃1min,72℃1min,35个循环；72℃10min；反应结束后4℃恒温保存；

步骤4）结果判定；

取第二重pcr产物5.0μl加1μl（6×）上样缓冲液混匀加样；100v电泳40min后，放入10mg/ml的溴化乙锭溶液中染色10min以上，在凝胶成像系统下观察并拍照；出现目的条带的判为阳性，无目的条带的判为阴性。

图1中1-11为含有blv-ltr的重组质粒10倍倍比稀释10ng～1ag/μl的电泳图，图中，p为阳性对照，n为阴性对照，m为marker。第一幅图为第一重pcr扩增后的电泳图，第二幅图为第二重pcr扩增后的电泳图，第三幅图为巢式pcr扩增完成后的电泳图。由图可见，阳性对照样品出现预期的399bp和279bp的条带，阴性样品未出现任何条带证明试验成立。1-11为含有blv-ltr的重组质粒10倍倍比稀释后的样品，浓度为10ng～1ag/μl，pcr扩增结果显示，第一幅图电泳结果显示到第6个稀释度（即100fg/μl）可见预期的与阳性对照相同的399bp条带，以后未见条带，说明第一重pcr的敏感性可检测到100fg/μl。第二幅图电泳结果显示到第6个稀释度（即10fg/μl）可见预期的与阳性对照相同的279bp条带，以后未见条带，说明第二重pcr的敏感性可检测到100fg/μl。第三幅图电泳结果显示到第8个稀释度（即1fg/μl）可见预期的与阳性对照相同的279bp条带，以后未见条带，说明巢式pcr的敏感性可检测到1fg/μl。由此可以证明本实验建立的巢式pcr的敏感性较高，是一般pcr的100倍。

图2为采用本方法对1-14共14份临床血液样品进行白血病检测的结果图，14份样品为某牛场外观健康牛的颈静脉血液，用本实验建立的巢式pcr检测方法检测，电泳结果显示样品4和样品9出现与阳性对照相同的预期的279bp条带，结果显示样品4和样品9中含有牛白血病病毒，为阳性样品。此结果证实本实验建立的牛白白血病巢式pcr检测方法，可以有效的检测到临床血液样品中的牛白血病病毒，可用于临床样品检测。

综上所述，本发明不限于上述具体实施方式。本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可做若干的更改或修饰。上述更改或修饰均落入本发明的保护范围。