伏马毒素降解酶FumDPS及其基因和应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及伏马毒素降解酶fumdps及其基因和应用。

背景技术：

伏马毒素(fumonisin，fb)是镰刀菌属(fusariumspp.)在特定的条件下产生的一些水溶性的次级代谢产物。伏马毒素是由多氢醇和丙三羧酸组成双酯类化合物，结构中的主要活性官能团是伯胺、三羧酸、羟基和脂肪族骨架，这些与它们的毒性效应密切相关。研究表明，伏马毒素可引起大鼠肾肿瘤和肝癌、马脑白质软化症(elem)，猪肺水肿(ppe)等，且与人类食管癌的发病密切相关。到目前为止，发现了28种伏马毒素的类似物，将其分为四类，即fa、fb、fc和fp，在b系列中，最常发现的是伏马毒素b1(fb1)、b2(fb2)和b3(fb3)，其中fb1量在自然界中的量大约占70％-80％左右，其毒性最强，污染最广泛。应用物理、化学的方法能将伏马毒素去除，但是，化学方法局限性比较大，虽然能降低fb1的含量，但会引入新的化学物质，增加安全隐患，此外欧盟也禁止使用化学方法消除真菌毒素。物理方法可去除一定量的伏马毒素，但要求条件高，且易改变食品品质和风味。生物降解法降解伏马毒素反应温和，专一性强，特异性高，应用前景非常广阔。

真菌毒素的污染在全球范围内都在日益加剧，其造成宝贵的粮食资源的浪费，且对人具有致癌性。因此，研发降解真菌毒素的酶制剂，可以很好的遏制被污染的粮食作物中的毒素的产生，挽回经济损失。

技术实现要素：

为了能够利用生物降解法降解伏马毒素，本发明提供一种伏马毒素降解酶fumdps及其基因和应用。

本发明的目的在于提供一种伏马毒素降解酶fumdps。

本发明的再一目的在于提供一种伏马毒素降解酶fumdps的基因。

本发明的再一目的在于提供一种含有伏马毒素降解酶fumdps基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供一种含有伏马毒素降解酶fumdps基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供制备上述伏马毒素降解酶fumdps的方法。

本发明的再一目的在于提供上述伏马毒素降解酶fumdps的应用。

根据本发明具体实施方式的伏马毒素降解酶fumdps，其氨基酸序列如seqidno.1所示：

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其中，该酶编码552个氨基酸和一个终止密码子，前54个是信号肽，因此，成熟的伏马毒素降解酶fumdps的理论分子量为53.26kda。

成熟的伏马毒素降解酶fumdps的氨基酸序列如seqidno.2所示：

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本发明提供了编码上述伏马毒素降解酶fumdps的基因，该基因的基因组序列如seqidno.3所示：

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本发明成熟的伏马毒素降解酶fumdps编码基因，其核苷酸序列如seqidno.4所示：

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本发明通过pcr的方法分离克隆了伏马毒素降解酶fumdps基因，dna全序列分析结果表明，伏马毒素降解酶fumdps结构基因全长1659bp。

将伏马毒素降解酶fumdps序列及推导出的氨基酸序列在genbank中进行blast比对，本发明伏马毒素降解酶fumdps与来源于鞘氨醇盒菌mta144氨基酸序列一致性为45％，说明伏马毒素降解酶fumdps是一种新的伏马毒素降解酶。

本发明还提供了包含上述伏马毒素降解酶fumdps的重组载体，命名为pet28a(+)-fumdps。将本发明的伏马毒素降解酶fumdps基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的伏马毒素降解酶基因插入到质粒pet28a(+)上的ecori和xhoi限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于t7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠表达质粒pet28a(+)-fumdps。

本发明还提供了包含上述伏马毒素降解酶fumdps的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌。

本发明还提供了一种制备伏马毒素降解酶fumdps的方法，包括以下步骤：

(1)用包含编码伏马毒素降解酶fumdps的基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导伏马毒素降解酶fumdps表达；

(3)分离纯化获得的伏马毒素降解酶fumdps。

其中，优选所述宿主细胞为大肠细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选为大肠杆菌bl21(de3)。

本发明还提供上述伏马毒素降解酶fumdps的应用，尤其是在降解伏马毒素的应用。

本发明的伏马毒素降解酶fumdps的最适温度37℃，最适ph为8-9，在ph3-7范围内仍保持60％以上的活性。在最适温度和最适ph下，本发明的伏马毒素降解酶fumdps对fb1的降解率为100％。

应用本发明的方法可以获得性质优良的伏马毒素降解酶，该酶可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素对动物及人类健康的危害。

附图说明

图1为伏马毒素降解酶酶fumdps的sds-page纯化图，其中，m：蛋白marker；1:伏马毒素降解酶fumdps；

图2显示伏马毒素降解酶fumdps的最适温度情况；

图3显示伏马毒素降解酶fumdps的最适ph情况。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：大肠杆菌表达载体pet28a(+)及菌株bl21(de3)。

2、培养基：

(1)大肠杆菌培养基lb(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％nacl，ph7.0)。

实施例1脱羧酶家族的伏马毒素降解酶fumdps的克隆

通过过人工化学合成法合成的fumdps编码区核苷酸序列，在核苷酸序列的5’端添加酶切位点ecori、3’端添加酶切位点xhoi。

实施例2重组伏马毒素降解酶fumdps的制备

将表达载体pet28a(+)进行双酶切(ecori+xhoi)，同时将编码伏马毒素降解酶的基因fumdps双酶切(ecori+xhoi)，切出编码成熟伏马毒素降解酶的基因片段与表达载体pet28a(+)连接，获得含有伏马毒素降解酶fumdps的重组质粒pet28a(+)-fumdps，转化至大肠杆菌bl21(de3)，获得重组大肠杆菌菌株bl21(de3)/fumdps。

以同样的方法构建含信号肽序列的伏马毒素降解酶基因的重组表达载体。

取含有重组质粒的bl21(de3)菌株，接种于100mllb培养液中，37℃220rpm振荡培养2-3h后，od600为0.6-0.8时，加入终浓度为1mmiptg，25℃诱导20h，诱导结束，4℃离心收集菌体。通过超声破碎，收集上清，镍柱纯化后，sds-page结果表明，重组伏马毒素降解酶在大肠杆菌中得到了表达，如图1所示，泳道1为纯化后的fumdps。

实施例3伏马毒素降解酶fumdps的性质测定

高效液相色谱检测伏马毒素降解酶酶的酶活，具体方法如下：

(1)fb1标准储备液：称1mg标品，用10ml乙腈和水(1：1)溶解，配制成浓度为100ug/ml的标准液，-20℃保存。

(2)样品的制备：取纯化好的伏马毒素降解酶酶液900ul，加入100ul的fb1标准储备液，使fb1的终浓度为10ug/ml，37℃，220rpm，避光培养20min。

(3)样品衍生化：取待测样品100ul，加入400ul50％乙腈水，500ulopa衍生液，混匀30s，衍生2min内进样，过滤膜待测。通过与fb1的标品的峰图对比，来确定伏马毒素降解酶fumdps的酶活性。

1.测定伏马毒素降解酶的最适温度

以fb1为底物，取100μl底物并加入900μl的酶液，终浓度为10μg/ml，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph7.0)缓冲液体系及不同温度下，反应20min，然后沸水煮10min，让酶失活。冷却至室温后过膜，待高效液相色谱检测。

如图2所示，伏马毒素降解酶fumdps的最适温度为37℃。

2.测定伏马毒素降解酶fumdps的最适ph

将纯化的重组伏马毒素降解酶fumdps在不同的ph缓冲液下进行酶促反应，以测定其最适ph，所选用的缓冲溶液的缓冲梯度为：100mm柠檬酸-磷酸氢二钠(ph3.0–8.0)，100mm的tris-hcl(ph8.0-9.0)，100mm甘氨酸-naoh(ph9.0–12.0)。伏马毒素降解酶fumdps在上述不同的缓冲液中与底物fb1(终浓度为1μg/ml)在37℃反应30min，沸水煮10min，高效液相色谱检测。

结果如图3所示，伏马毒素降解酶fumdps的最适ph为8.0-9.0，在ph3.0～7.0之间有58％以上的降解率。

序列表

<110>天津科技大学

<120>伏马毒素降解酶fumdps及其基因和应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<213>人工序列(artificialsequence)

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