一种屋尘螨过敏原Derp29基因重组蛋白及其应用的制作方法

本发明属于基因工程
技术领域：
，尤其涉及一种屋尘螨过敏原derp29基因重组蛋白及其应用。
背景技术：
：常见尘螨包括两种，一种叫粉尘螨(dermatophagoidesfarinae)，另一种叫屋尘螨(dermatophagoidespteronyssinus)。屋尘螨和粉尘螨均可引起过敏性疾病，以往文献表明，粉尘螨阳性率为59.0％、屋尘螨阳性率为57.6％，说明屋尘螨和粉尘螨是两种不同的致敏螨种。作为一种生物，每种螨体含有上千种蛋白，有的是过敏原，有的不致敏机体。已证实尘螨粗提物中含有多种成份可与人血清ige抗体结合，但患者病因可能只与其中的某种或某些成份有关，这些成份叫做“组分(groups)”。迄今，临床诊断试剂均采用尘螨粗提物。由于不同螨种之间具有交叉反应，尘螨与蟑螂、花粉等也有交叉反应，因此采用粗提物进行诊断会引起误诊、副反应。而且，由于粗提物中含有多种过敏原组分，同一组分在不同批次产品中含量不均一，难以实现产品的标准化。因此，需要了解每种螨的过敏原成份，制备过敏原单组份重组蛋白，检测尘螨粗提浸液皮试阳性患者血清特异性ige含量，从而可以明确引起机体致敏的过敏原单组份，为精准检测过敏性疾病奠定基础，为临床制订精准脱敏治疗方案提供依据。genbank已经公布了粉尘螨过敏原第29组分(derf29)基因序列，屋尘螨第29组分却还没有公布，但是粉尘螨过敏原第29组分却无法替代屋尘螨过敏原第29组分，这是因为，二者即使具有一定的序列相似，但即便只是相差1个氨基酸也会引起临床误诊，更何况是不同物种之间具有相似序列的蛋白质。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种屋尘螨过敏原derp29基因重组蛋白及其应用，旨在解决现有尘螨引起的过敏性疾病无法得到精准医学检测的问题。本发明是这样实现的，一种屋尘螨过敏原derp29基因重组蛋白，该基因的序列如seqidno：1所示。本发明进一步公开了上述屋尘螨过敏原derp29基因重组蛋白在用于制备精准医学检测屋尘螨引起的过敏性疾病的诊断试剂或生物制品方面的应用。优选地，所述诊断试剂或生物制品为屋尘螨过敏原derp29基因经表达、纯化后的重组蛋白，或者所述诊断试剂或生物制品包括屋尘螨过敏原derp29基因经表达、纯化后的重组蛋白。本发明克服现有技术的不足，提供一种屋尘螨过敏原derp29基因重组蛋白及其应用。本发明通过转录组测序后，进行序列比对，得到一个片段与粉尘螨derf29高度同源的序列，将该片段扩出来，然后进行基因克隆表达纯化，将纯化的蛋白质与屋尘螨过敏患者血清进行westernblotting，发现该片段编码的蛋白质具有高度的活性，并最终确定该序列为屋尘螨过敏原derp29编码基因序列如seqidno：2所示，以及屋尘螨过敏原derp29基因重组蛋白序列如seqidno：1所示。相比现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明首次发现屋尘螨derp29基因序列，并通过基因克隆、表达、纯化获得其重组蛋白，该重组蛋白用于westernblotting实验精准医学检测16例屋尘螨引起的过敏性哮喘患儿，阳性率100％，而对照组无阳性。附图说明图1是屋尘螨totalrna电泳图(1％琼脂糖)；其中，泳道m为dl2000dnamarker，泳道1为屋尘螨totalrna；图2是使用recombinantdnasei对屋尘螨totalrna进行dnasei消化后的电泳结果图；其中，泳道m1为dl2000dnamarker，泳道1为纯化后totalrna-xh；图3是pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道m为dl2000dnamarker，泳道1为pcr扩增产物；图4是pet28(a)-derp29质粒表达sds-page图像；其中，泳道m为proteinmwmarker(broad)，泳道1为pet28(a)空质粒转化大肠杆菌后的全细胞，泳道2为pet28(a)空质粒转化大肠杆菌后的上清，泳道3为pet28(a)空质粒转化大肠杆菌后的沉淀，泳道4为pet28(a)-derp29质粒转化大肠杆菌后的全细胞，泳道5为pet28(a)-derp29质粒转化大肠杆菌后的上清，泳道6为pet28(a)-derp29质粒转化大肠杆菌后的沉淀；图5是pet28(a)-derp29质粒转化后的500ml表达sds-page图像；其中，泳道m为proteinmwmarker(broad)，泳道1为pet28(a)-derp29质粒转化大肠杆菌后的全细胞，泳道2为pet28(a)-derp29质粒转化大肠杆菌后的上清，泳道3为pet28(a)-derp29质粒转化大肠杆菌后的沉淀；图6是sds-page验证重组蛋白rderp29亲和层析纯化结果，其中，泳道m为proteinmwmarker(broad)，泳道1～10为纯化出来收集到各管的重组蛋白rderp29，泳道bsa是对照的蛋白；图7是以重组蛋白rderp29为二抗通过western-blotting检测屋尘螨过敏性哮喘患儿血清ige结合率。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。一、totalrna提取将客户屋尘螨使用rnaisoplus(codeno.9108)进行totalrna提取，取1ul进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。二、目的基因获取2.1、引物设计与合成表1设计引物名称序列(5'-3')长度(mers)f1aatatctacgcggtttgtgtttga24f2taatcatcatcattcttatcatcg24r1tttttcggaaggatatattgagtt242.2、反转录使用takaraprimescripttmrt-pcrkit(codeno.rr014a)合成cdna。同时设立正负对照。反应体系：1μltotalrna、1μlrandom6mers(20μm)、1μloligodtprimer(2.5μm)、1μldntpmixture(10mmeach)，加rnasefreedh2o至10μl。反应条件：65℃置5min，然后冰上静置2min。然后加入下列组分：4μl5xprimescriptrtbuffer、0.5μlrnaseinhibitor(40u/ul)、0.5μlprimescriptrtase(for2step)，总反应体积20μl。反应条件：30℃10min、45℃30min、70℃15min。2.3、第1次pcr扩增以上述反转录的cdna为模板，使用takaratksgflexdnapolymerase(codeno.r060a)进行pcr扩增，分别以f1/r1为引物。反应体系：1μl反转录cdna、25μl2×gflexpcrbuffer(mg2+，dntpplus)、1μltksgflexdnapolymerase(1.25units/μl)、1μlprimer*1(20um)(f1)、1μlprimer*2(20μm)(r1)、21μldh2o，总反应体积50μl。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、55℃15sec、68℃60sec进行35个循环。2.4、第2次pcr扩增以第1次pcr产物扩增为模板，使用takaratksgflexdnapolymerase(codeno.r060a)进行pcr扩增，分别以f2/r1进行第2次pcr扩增，反应体系：1μl反转录cdna、25μl2×gflexpcrbuffer(mg2+，dntpplus)、1μltksgflexdnapolymerase(1.25units/ul)、1μlprimer*1(20μm)(f2)、1μlprimer*2(20μm)(r1)、21μldh2o，总反应体积50μl。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、55℃15sec、68℃60sec进行30个循环。2.5、pcr产物纯化使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0(codeno.9762)分别切胶回收，产物约0.6kbp，命名为pcr-product。2.6、测序分析pcr-product使用引物f2进行测序，测序结果与粉尘螨第29组分(derf29)基因序列比对有相似性。分析：根据测序结果分析：获得的序列有来源于dna的可能，尝试将totalrna进行dnasei消化后，再进行目的基因获取验证。三、totalrna消化使用recombinantdnasei(rnasefree)(codeno.2270a)对屋尘螨totalrna进行dnasei消化，结果如图2所示。四、目的基因获取(第2次)4.1、反转录使用takaraprimescripttmrt-pcrkit(codeno.rr014a)合成cdna。同时设立正负对照。1μltotalrna、1μlrandom6mers(20μm)、1μloligodtprimer(2.5μm)、1μldntpmixture(10mmeach)，加rnasefreedh2o至10μl。反应条件：65℃置5min，然后冰上静置2min。然后加入下列组分：4μl5×primescriptrtbuffer、0.5μlrnaseinhibitor(40u/μl)、0.5μlprimescriptrtase，总反应体积20μl。反应条件：30℃10min、45℃30min、70℃15min。4.2、第1次pcr扩增以上述反转录的cdna为模板，使用takaratksgflexdnapolymerase(codeno.r060a)进行pcr扩增，分别以f1/r1为引物。反应体系：1μl反转录cdna、25μl2×gflexpcrbuffer(mg2+，dntpplus)、1μltksgflexdnapolymerase(1.25units/μl)、1μlprimer*1(20um)(f1)、1μlprimer*2(20um)(r1)、21dh2o，总反应体积50μl。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、55℃15sec、68℃60sec进行35个循环。4.3、第2次pcr扩增以第1次pcr产物扩增为模板，使用takaratksgflexdnapolymerase(codeno.r060a)进行pcr扩增，分别以f2/r1为引物进行第2次pcr扩增，反应体系：1μl反转录cdna、25μl2×gflexpcrbuffer(mg2+，dntpplus)、1μltksgflexdnapolymerase(1.25units/ul)、1μlprimer*1(20μm)(f2)、1μlprimer*2(20μm)(r1)、21μldh2o，总反应体积50μl。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、55℃15sec、68℃60sec进行30个循环。电泳检测结果表明：以经过dnasei消化后的totalrna为模板，rt-pcr扩增得到derp29基因片段，表明来源于rna。4.4、pcr产物纯化使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0(codeno.9762)切胶回收pcr产物，约0.4kbp的条带。4.5、测序分析使用引物r1对pcr产物进行测序，测序结果与参考序列比对一致。五、全长基因克隆将目的基因derp29克隆至pet-28a(+)质粒中，提取2个质粒测序。5.1、引物设计与合成表2设计引物5.2、pcr扩增以上述pcr产物为模板，使用takaratksgflexdnapolymerase(codeno.r060a)进行pcr扩增。反应体系：1μlpcr产物、25μl2×gflexpcrbuffer(mg2+，dntpplus)、1μltksgflexdnapolymerase(1.25units/μl)、1μlprimer*1(20μm)(inf)、1μlprimer*2(20μm)(inr)、21μldh2o，总反应体积50μl。反应条件：94℃1min，然后置98℃10sec、55℃15sec、68℃60sec进行35个循环。取5μlpcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。5.3、pcr产物纯化使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0(codeno.9762)分别切胶回收pcr产物约0.4kbp的扩增产物条带，命名为insert。5.4、载体制备将质粒pet28a(+)使用bamhi/noti进行酶切，反应体系：10μlpet28a(+)(50ng/μl)、5μl10×quickcutbuffer、1μlbamhi(10u/ul)、1μlnoti(10u/ul)，加dh2o至50μl。反应条件：37℃2小时。取10μl进行1％琼脂糖凝胶电泳。使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0(codeno.9762)切胶回收约5.3kbp的dna片段，命名为vectordna。5.5、in-fusion克隆、转化、阳性克隆筛选及质粒测序使用hdcloningkit(clontechcodeno.639650)，分别将insert与vectordna连接，反应体系如下：3μlvectordna(约50ng/ul)、3μlctg0579-insert(约50ng/μl)、2μl5×in-fusionhdenzymepremix，加dh2o至10μl。反应条件：50℃15min。分别取上述in-fusion连接产物各2.5μl热转化至e.colicompetentcellsjm109(codeno.9052)中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒；使用引物t7对2个质粒进行测序，序列测通。测序结果与pcr产物测序均一致，选择1个质粒进行后续蛋白表达实验。六、目的蛋白表达将质粒转入rosetta2(de3)plyss感受态细胞中，对阳性克隆进行诱导表达，同时进行pet-28a空载体对照。6.1、转化取pet28(a)-derp29质粒1μl转入competentcellrosetta2(de3)plyss中；使用lb抗生素kana(50μg/ml)+cm(34μg/ml)平板，100ul转化液涂布，37℃o/n培养。pet-28a进行同样操作。6.2、培养及诱导6.2.1、种培养挑取单菌落至2mllb/kana(50μg/ml)+cm(34μg/ml)培养基中，37℃o/n培养。6.2.2、主培养诱导主培养时在glasstube中添加5mllb/kana(50ug/ml)+cm(34ug/ml)培养基，添加种培养菌液100μl。37℃培养至od600nm值约为0.6。添加150mmiptg33μl(final1mmiptg)进行诱导，37℃培养4小时。pet-28a诱导前吸光度值为0.60，集菌前吸光度值为1.35；pet28(a)-derp29质粒转化的大肠杆菌诱导前吸光度值为0.60，集菌前吸光度值为2.20。6.2.3、蛋白质抽提集菌后2.0od相当的菌体加入320μlpbs悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离(12，000×rpm、5min)。6.2.4、抽提液电泳取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8μl(0.05od相当)，加入2μl4×sdsloadingbuffer，95℃加热10分钟，进行sds-page电泳。电泳条件：(c.c.)25ma/枚、约70分，使用gel；12.5％/15％polyacrylamidegel。电泳结束后，cbb-r250染色，使用脱色液脱色。sds-page/cbb染色结果如图4所示。目的基因在pet-28a37℃诱导系统中有表达，且基本为可溶性表达。七、500ml大量培养使用pet28(a)-derp29质粒甘油菌保进行500ml培养，以从菌体中进行目的蛋白纯化。7.1、种培养将甘油菌保样品分别取50μl植入10mllb/kana(50ug/ml)+cm(34ug/ml)培养基中，37℃o/n培养。7.2、主培养及诱导将10ml种培养菌液植入500mllb/2lflask中，37℃、200rpm培养至od600≈0.6时，添加100mmiptg5ml(final1mmiptg)进行诱导，诱导前吸光度值为0.60，集菌前吸光度值为3.35，继续培养4小时。培养后离心，收集菌体。使用pbs清洗菌体后离心，称量菌体湿重2.20g。吸光度测定如下表3所示：7.3、sds-page电泳(1)蛋白质抽提取2.0od相当的菌体加入320ulpbs悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离(12，000×rpm、5min)。(2)抽提液电泳取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8μl(0.05od相当)，加入2μl5×sdsloadingbuffer，95℃加热10分钟，进行sds-page电泳。电泳条件：(c.c.)25ma/枚、约80分，使用gel；12.5％polyacrylamidegel。电泳结束后，cbb-r250染色，使用脱色液脱色。sds-page/cbb染色结果如图5所示，目的蛋白以箭头指示。八、重组蛋白纯化8.1、缓冲液配制sonicationbuffer/washbuffer/bufferaph8.0(4℃)50mmsodiumphosphateph8.0300mmnacl5mmimidazolebufferbph8.0(4℃)50mmsodiumphosphateph8.0300mmnacl300mmimidazole透析buffer：takarapbs(codeno.t900)8.2、菌体破碎(1)培养后菌体湿重2.2g(2)加入sonicationbuffer25ml。(3)4℃充分悬浊，sonication180w，10min。破碎液27ml。(4)s112，000rpm，30min，4℃离心，得到上清27ml，沉淀0.3g。(5)s2使用0.45μm1000mlvacuumfilter/storagebottlesystem进行过滤，得到样品27ml；8.3、柱层析纯化(1)使用gehitraptaloncrude，5mltalonsuperflow(codeno.28-9537-66)柱层析操作；(2)树脂的平衡化使用10倍柱体积的灭菌milliqh2o50ml和10倍柱体积的buffera50ml平衡树脂，流速1ml/min；(3)上样buffera平衡化后上样，流速0.5ml/min；(4)树脂wash及蛋白溶出①树脂wash蛋白吸附后，使用10倍柱体积的buffera，50ml清洗树脂；流速1ml/min，w1：10ml，w2：20ml，w3：20ml。②蛋白溶出elution：buffera：50ml、bufferb：50ml，梯度溶出，流速1ml/min，fraction1.1ml/tube×90tubes。8.4、收集收集目的蛋白共计约11ml。取小量进行sds-page电泳并以bsa标准品浓度为参考。电泳胶：12.5％sdspage/考马斯亮蓝染色液染色，结果如图6所示，其中，泳道m为proteinmwmarker(broad)，泳道1为rderp29重组蛋白2.0μl上样，泳道2为rderp29重组蛋白4.0ul上样，泳道3为bsa200ng，泳道4为bsa400ng，泳道5为bsa600ng，泳道6为bsa800ng，泳道7为bsa1000ng。8.5、透析使用pbs进行buffer透析，反复进行3次。透析buffer：pbs；置换率：1：1000；透析膜：snakeskindialysistubing10000mwco(catno.68035lotno.mh160055)。使用imagemaster1dversion3.0解析soft对浓缩后样品进行定量分析，结果如下表4所示：表4定量分析结果九、westernblotting检测纯化后的重组蛋白与血清特异性结合9.1、westernblotting样品电泳对照取纯化后的蛋白样品约1ug，加入pbsbuffer将体积补足至16ul，加入4ul4×sdsloadingbuffer，95℃加热10分钟，进行sds-page电泳。电泳条件；(c.c.)25ma/枚、约70分；使用gel；12.5％polyacrylamidegel；电泳结束后，cbb-r250染色，使用脱色液脱色。9.2、westernblotting将pvdf膜、滤纸分别剪切成与凝胶相同大小，使用转膜缓冲液处理后，按滤纸、pvdf膜、凝胶、滤纸的顺序依次放在转膜仪电极板之间，设置转膜仪参数如下：电流42ma，转印时间70min。将pvdf膜置于含1.5％bsa的12mlblockingbuffer中，37℃平放1小时封闭。使用1：10稀释后的血清溶液6ml，进行一次抗体反应1小时。tbst缓冲液(25ml)洗涤1次；洗涤tbs缓冲液冲洗2次。使用1；4000稀释后的msmabtohuige(hrp)抗体溶液6ml，进行二次抗体反应1小时。tbst缓冲液(25ml)洗涤1次；洗涤tbs缓冲液冲洗2次。1mltrueblueperoxidasesubstrate显色1min。显色后pvdf膜如图7所示，由图7可以看出，该重组蛋白阳性率为100％。十、重组蛋白rderp29检测屋尘螨过敏性哮喘患儿血清ige阳性反应结果如下表6所示：表6应用重组蛋白rderp29检测屋尘螨过敏性哮喘患儿血清ige阳性反应率注：a01-17为屋尘螨过敏性哮喘/鼻炎患儿，unicap检测对尘螨过敏；b01-04为健康正常人，unicap检测其对尘螨不过敏。“+”对重组蛋白rderp29阳性，“—”对重组蛋白rderp29阴性。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>无锡市人民医院<120>一种屋尘螨过敏原derp29基因重组蛋白及其应用<141>2018-09-30<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>130<212>prt<213>dermatophagoidespteronyssinus<400>1metsertrpglnsertyrvalaspasnglnilecysglnhisvalasp151015cysthrleualaalailealaasnileglnaspglyseriletrpala202530lyspheglulysaspasplyslysileserprolysgluleulysthr354045ilealaaspthrileargglnasnproasnglypheleugluthrgly505560ilehisileglyglyglulystyrilecysileglnalaaspasngln65707580leuvalargglyargargglyserseralaleucysilevalalathr859095asnthrcysleuleualaalaalathrvalaspglytyrproalagly100105110glnleuasnasnvalileglulysleuglyasptyrleuargserasn115120125asntyr130<210>2<211>407<212>dna<213>dermatophagoidespteronyssinus<400>2ggatccatgtcttggcaatcatatgtcgataatcaaatctgccaacatgttgattgtacg60cttgctgctatagccaatattcaagatggttctatttgggccaaatttgaaaaagatgat120aaaaagatcagtccaaaagaattgaaaacaattgccgatacaattagacagaatccaaat180ggatttttagaaaccggtatacatattggtggtgaaaaatatatttgtattcaagctgat240aatcaattggtacgtggtcgtcgtggttcatcagcattgtgtatcgttgcaaccaataca300tgccttttagcggccgcaacagtcgatggttatccggctggacaacttaataatgttatt360gaaaaattgggtgattatttgagatccaataattattgagcggccgc407<210>3<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>3aatatctacgcggtttgtgtttga24<210>4<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>4taatcatcatcattcttatcatcg24<210>5<211>24<212>dna<213>artificialsequence<400>5tttttcggaaggatatattgagtt24<210>6<211>37<212>dna<213>artificialsequence<400>6aatgggtcgcggatccatgtcttggcaatcatatgtc37<210>7<211>38<212>dna<213>artificialsequence<400>7tgctcgagtgcggccgctcaataattattggatctcaa38当前第1页12