本发明属于荧光标记物领域。具体地，本发明涉及一种远红光荧光蛋白及其融合荧光蛋白，编码该远红光荧光蛋白或其融合荧光蛋白的核酸及载体。
背景技术：
：：远红光(fr)或近红外光(nir)在动物组织中光吸收和光散射较低，有较高的穿透性，是穿透皮肤等大部分组织的能力最大的光谱区域。具有这类发光色素基团的荧光蛋白更适宜于动物活体组织的深层成像，是活体成像更为理想的荧光标记物。目前该类荧光标记物主要有两种，分子量大小均在35kd左右。一种源自绿色荧光蛋白(gfp)，能自催化形成发色团，但是光谱范围有一定局限性，最大荧光发射波长一般在670nm左右，例如标记物tagrfp675。另一种源自存在于细菌中的受体蛋白，细菌光敏色素蛋白(bphp)。bphp主要利用线性四吡咯结构的胆绿素(bv)作为发色团；同时胆绿素bv广泛存在于真核生物体内，这意味着bphp类荧光标记物可应用于活的动物细胞和组织，且无需任何酶或外源辅助因子。bphp类标记物的代表有ifp系列和irfp系列，荧光发射波长范围为670nm～720nm，比如ifp2.0最大荧光发射波长714nm。但是现有可激发出远红光或近红外光的荧光蛋白的分子量较大，活体检测时易聚集沉淀，而且不耐受极端环境，适用场合有限。藻胆蛋白(phycobiliprotein)存在远红光范围的荧光发射，机制与细菌光敏色素蛋白(bphp)类似，主要源自于非共价结合的藻蓝胆素(pcb)。典型的藻胆蛋白类荧光标记物例如apca、smurfp、apcf2，它们的最大荧光发射波长为698nm。dingwl等人基于藻胆蛋白体的核心亚基apcf2的序列，进行基因改造后得到了几种新的荧光藻胆蛋白并将其命名为bdfp，这些bdfp蛋白可共价结合胆绿素bv，性能比apcf2稳定(dingwl，miaod，houyn，etal.smallmonomericandhighlystablenear-infraredfluorescentmarkersderivedfromthethermophilicphycobiliprotein，apcf2[j].biochimicaetbiophysicaacta(bba)-molecularcellresearch，2017，1864(10)：1877-1886)。另外，这些bdfp蛋白的分子量较小，约15kd，最大荧光发射波长为710nm左右。虽然dingwl等人得到的bdfp蛋白很好地弥补了现有的远红光或近红外光的荧光蛋白的上述缺点，但是这些蛋白荧光发射波长比较单一(均在710nm左右)，因此不能有效地组合使用。因此通过基因工程改造，得到亮度更高、光谱性质更为多样和优异的荧光蛋白，具有非常重要的意义。技术实现要素：本发明的目的之一在于通过同源序列比对，选择保守功能位点，并确定目标突变位点。本发明的另一目的在于提供一种发射出远红光的经基因改造的藻胆蛋白及其融合荧光蛋白。本发明的又一目的在于提供一种编码本发明的经基因改造的藻胆蛋白及其融合荧光蛋白的核酸，和编码该核酸的载体。在本发明的一个方面中，提供了一种远红光荧光蛋白，所述远红光荧光蛋白可以包括近红外光bdfp蛋白的氨基酸序列，并且包括在第113位氨基酸处的突变，且在第120位氨基酸处不发生突变。所述近红外光bdfp蛋白的氨基酸序列如sedidno：2所示。上述近红外光bdfp蛋白来源于截短的藻胆蛋白apcf2，且包括apcf2的第20～169位氨基酸或由apcf2的第20～169位氨基酸构成，并且包括突变s46t、i51v、n72c、y82c、y92m、n136k、v160i和v161a。如无特殊说明，本发明中的氨基酸位置以藻胆蛋白apcf2的蛋白序列为基础进行编码。本文的藻胆蛋白apcf2指来源于chroococcidiopsisthermalispcc7203的apcf2。优选地，本发明的藻胆蛋白apcf2的氨基酸序列如seqidno：1所示。进一步地，在本发明的远红光荧光蛋白中，第113位亮氨酸被突变为苯丙氨酸或甲硫氨酸。进一步地，本发明的远红光荧光蛋白可以包括在第125位氨基酸的突变。优选地，第125位甘氨酸可以被突变为半胱氨酸。进一步地，本发明的远红光荧光蛋白可以包括在第30位、第39位、第47位、第81位、第101位、第143位和/或第151位的氨基酸处的突变。具体地，在本发明的远红光荧光蛋白中，第30位苯丙氨酸被突变为亮氨酸或丝氨酸；第39位谷氨酰胺被突变为精氨酸；第47位天冬酰胺被突变为丝氨酸；第81位甲硫氨酸被突变为苏氨酸；第101位天冬氨酸被突变为甘氨酸；第143位缬氨酸被突变为丙氨酸；或，第151位苏氨酸被突变为丙氨酸。进一步地，本发明的远红光荧光蛋白的氨基酸序列如seqidno.5所示。或者，本发明的远红光荧光蛋白如seqidno.7所示。或者，本发明的远红光荧光蛋白如seqidno.8所示。或者，本发明的远红光荧光蛋白如seqidno.9所示。在本发明的又一方面中，提供了一种融合荧光蛋白，所述荧光融合蛋白包括本发明的上述远红光荧光蛋白。进一步地，所述融合荧光蛋白可以进一步包括另一远红光荧光蛋白。优选地，所述另一远红光荧光蛋白为bdfp远红光荧光蛋白。更优选地，所述另一远红光荧光蛋白为本发明的上述远红光荧光蛋白。或者，所述融合荧光蛋白可以进一步包括非远红光荧光蛋白，所述非远红光荧光蛋白为近红外光荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、蓝绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和/或橙色荧光蛋白。例如，所述非远红光荧光蛋白可以为ebfp、ecfp、mcerulean、tfp、gfp、egfp、eyfp、frp、tagrfp或bdfp近红外光荧光蛋白。该bdfp近红光荧光蛋白的氨基酸序列可以如sedidno：2所示。进一步地，在本发明的融合荧光蛋白中，各荧光蛋白之间通过连接子连接。优选地，所述连接子由5～80个氨基酸构成，例如由5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个氨基酸构成。更优选地，所述连接子由5～70个，优选5～60、5～55、5～50、5～45、5～40、5～35或10～35个氨基酸构成。在本发明的又一方面中，提供了一种编码上述远红光荧光蛋白或上述融合荧光蛋白的核酸。在本发明的又一方面中，提供了一种包括上述核酸的载体。如上所述，本发明的经改造的bdfp远红光荧光蛋白具有较小的分子量，能与色素共价结合，性能稳定，耐受极端环境。现有的近红外光bdfp蛋白的最大荧光发射峰在710nm附近(近红外光)。本发明通过位点突变，得到的bdfp蛋白的荧光发射峰发生蓝移，最大荧光发射波长在670nm附近(远红光)。因此，本发明通过位点突变得到的bdfp远红光荧光蛋白可以与现有的非远红光荧光蛋白(例如bdfp近红外光荧光蛋白)组合使用，对细胞、组织等以进行双重或多重生物标记。另外，本发明的bdfp远红光荧光蛋白还可以与另一远红光或非远红光荧光蛋白一起构建融合荧光蛋白，以提升活体细胞检测时的有效亮度，或者进行组合荧光标记。进一步地，本发明的远红光bdfp荧光蛋白与现有的bdfp近红外光荧光蛋白的串联融合蛋白不仅具有显著提高的有效亮度，而且还具备大范围的stokes位移等特点，可用于荧光共振能量转移的相互作用研究等。附图说明图1示出了apcb、apcf2、bdfp1.1、bdfp1.2、bdfp1.6的同源序列对比图。图2示出了突变体在hek293t细胞内的荧光显微镜成像图像(a)和有效亮度对比图(b)。各突变体分别与egfp(fps：ires：egfp)在hek293t细胞内共表达。图2a分别示出了在荧光显微镜下观察到egfp的绿色荧光和各突变体的红色荧光(fr或nir通道)。在图2b中，各突变体的平均远红光荧光亮度先与其平均egfp荧光亮度取比值，修正表达水平；然后再与bdfp1.6(v23)的值相比较，得到有效亮度终值。细胞成像参数：绿色通道(λex＝470/40nm，λem＝510/40nm)，远红光和近红外光通道(λex＝630/20nm，λem＝690/50nm)。bdfp1.1、v1、v2、v3、v4、v7、v8、v14的数据采集时间均为30s，其他突变体的数据采集时间为5s。图3示出了突变体v13～v32在hek293t细胞内的荧光显微镜成像图像(a)和有效亮度对比图(b)。各突变体分别与egfp在hek293t细胞内共表达。图3a分别示出了在荧光显微镜下观察到的egfp的绿色荧光和各突变体的红色荧光(fr通道)。在图3b图中，突变体的平均远红光荧光亮度先与其平均egfp荧光亮度取比值，修正表达水平；然后再与bdfp1.6(v23)的值(其被设定为1)相比较，得到有效亮度终值。细胞成像参数，绿色通道(λex＝470/40nm，λem＝510/40nm)，远红光和近红外光通道(λex＝630/20nm，λem＝690/50nm)。数据采集时间，v17为30s，其他突变体为5s。图4示出了bdfp1.2(v6)、bdfp1.6(v23)蛋白与已知远红光荧光蛋白irfp670、mirfp670和smurfp在体外的稳定性对比的曲线图。图4a示出各荧光蛋白的荧光强度在ph9.5～2范围中的荧光变化，其中ph2～5的介质为0.1m醋酸钠和0.3m氯化钠，ph5.5～10的介质为0.1mnah2po4和0.3m氯化钠。图4b示出荧光蛋白的荧光强度在不同浓度的混合盐酸胍(ph7.2)环境中的变化。图4c示出荧光蛋白的荧光强度在溶液80℃温浴后的变化。图4d示出光漂白实验的结果，介质为磷酸钾缓冲液(ph7.2)，100whbo103w/2光源照射，远红光滤光设置(λex/漂白＝630/20，λem＝690/50nm)，光聚焦镜头为100×c-apochromat油浸物镜，孔径1.2，显微镜为zeissaxioscopea1，成像相机为cool-snaphq2ccd。图5示出了在哺乳动物活细胞内表达人源蛋白与单色和双色bdfp蛋白的融合蛋白的显微照片。(a)广域显微镜(wf)和结构化照明显微镜(sim，超分辨率显微镜)成像图：hek293t表达各突变体与组蛋白(h2b)的融合蛋白；hela细胞表达各突变体与线粒体导入序列(mts)、角蛋白(keratin)、钙连蛋白(calnexin)或微管蛋白(α-tubulin)的融合蛋白；u-2os细胞表达各突变体与肌动蛋白(β-actin)的融合蛋白；仓鼠cho-k1细胞表达突变体与肌动蛋白标签(f-actinmarker)lifeact的融合蛋白。(b)远红光(bdfp1.6、1.2或1.3)和近红外光(bdfp1.1)荧光蛋白的双色成像图。远红光成像图(左列)滤光片设置(λex＝630/20nm，λem＝667/30nm)，近红外光成像图(中间列)滤光片设置(λex＝685/20，λem＝740/40nm)；双色合成覆盖图(右列)。比例尺：10μm。图6示出了bdfp1.2、bdfp1.6以及它们的同序列融合蛋白与现有荧光蛋白的有效亮度对比图。(a)为荧光显微镜照片。其中，将各bdfp荧光蛋白和现有的荧光蛋白(irfp670、mirfp670和smurfp)均与egfp构建在同一载体中(bdfps：ires：egfp)，瞬时转染至hek293t细胞中。可基于egfp的荧光亮度，修正各bdfp荧光蛋白的荧光亮度。观测通道的设置分别为绿光(egfp，λex＝470/40nm，λem＝510/40nm)和远红光(λex＝630/20nm，λem＝690/50nm)。比例尺设置为50μm。(b)对(a)的荧光亮度的量化结果。数据采用origin8.0软件处理，单因子方差分析显著水平为α＝0.05(n＝30)。图7示出了bdfp系列蛋白的同序列或异序列串联构建体的荧光亮度。(a)串联构建体的结构示意图；(b)串联构建体的吸收光谱图；(c)串联构建体的荧光光谱图；(d)上排为hela细胞体内标记的广域双色成像图，下排为sim超分辨率成像图；(e)有效亮度的柱状图，深色柱表示630nm通道数据(λex＝630/20nm，λem＝690/50nm)，白柱表示660nm通道数据(λex＝660/45nm，λem＝710/50nm)。采用origin8.0软件处理数据，单因子方差分析显著水平为α＝0.05(n＝30)。具体实施方式以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
：技术人员来说，在不脱离本发明基本原理的前提下，可以做出若干改进，这些改进也视为在本发明的范围内。下面分通过具体实施方式对本发明进行详细说明。但是，应当理解，本发明并不限定于以下的具体实施方式。本发明的保护范围由权利要求书来定义，在其范围内，可以对本发明下述实施方式进行任意改变和组合。下面将结合具体实施例，进一步解释本发明。材料和方法1.载体pet28(或pet30)和pacycduet(novagen)是t7启动子表达载体。pacycduet经设计，能够用于双目的基因序列在大肠杆菌(e.coli)内共同转化表达。表达载体pcdna3.1(invitrogen)是带有cmv启动子的哺乳动物类表达载体。在hek293t细胞内进行筛选时，使用表达载体pcdna3.1，融合表达序列为bdfp：ires：egfp。作亮度对比时，可基于egfp的荧光亮度，对bdfp蛋白的荧光亮度进行修正。2.突变突变起始模板为bdfp1.1(如seqidno.2所示，即apcf2(20-169)-s46t/i51v/n72c/y82c/y92m/n136k/v160i/v161a)。位点特异性和位点饱和诱变(20个氨基酸全部使用引物混合物来编码)使用zheng等人(l.zheng，u.baumann，j.l.reymond，anefficientone-stepsite-directedandsite-saturationmutagenesisprotocol，nucleicacidres.32(2004)e115)的有效一步式方案来进行。随机诱变通过易错pcr来进行，所使用的条件导致每1000个碱基对(bp)产生高达16个突变的频率(o.griesbeck，g.s.baird，r.e.campbell，d.a.zacharias，r.y.tsien，reducingtheenvironmentalsensitivityofyellowfluorescentprotein.mechanismandapplications，j.biol.chem.276(2001)29188-29194)。通过随机诱变得到的基因文库，被克隆至pet28载体质粒上。然后该质粒将与产生胆色素(bv)的质粒pacyc-ho1，一起转化进入大肠杆菌bl21(de3)。细胞先在37℃条件下琼脂平板培养10h，然后在17℃条件下培养48h。诱导剂采用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，浓度0.05mm。平板上的强荧光克隆，是采用型号qpix420的菌落挑选系统(moleculardevices)，红光激发通道设置628/65nm/，远红光荧光通道设置692/65nm。每个文库挑选到的具有高亮度荧光的克隆，将会用作下一轮的易错pcr模板。3.大肠杆菌内的重组蛋白的表达将带有编码荧光蛋白的pet表达载体转化到大肠杆菌菌株bl21(de3)(novagen)后，再将载体pacyc-ho1转化到同一菌株中。将经转化的bl21细胞在18℃，培养在补充有卡那霉素(20μg/ml)和氯霉素(17μg/ml)lb培养基中。当o.d值达到0.4～0.6时，使用1mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导表达5～16小时，然后在4℃，12,000×g离心3min，收集细胞，经水冲洗2次，短期保存在4℃或者置于-20℃长期保存。4.蛋白的纯化与定量将湿菌体悬浮在冰预冷的起始缓冲液[磷酸钾缓冲液(kpb，20mm，ph7.2)，氯化钠(nacl，0.5m)]中。经50w功率超声(jy92-ii，宁波新芝生物科技股份有限公司，中国)破碎，5分钟。悬浮液在4℃，12000×g离心60分钟。得到的上清液经ni2+亲和层析柱(amershambiosciences)纯化，其中使用起始缓冲液[磷酸钾(kpb，20mm，ph7.2)上样，使用额外含有0.5m咪唑的缓冲液进行洗脱。收集到的样品，用起始缓冲液(ph7.2)透析至少两次。通过bradford法测定蛋白浓度，使用牛血清白蛋白作为标准品进行校正。5.哺乳动物细胞的培养将hek293t、hela或u-2os细胞培养在含10％胎牛血清的dmem培养基(invitrogen)中，将cho-k1细胞培养在含10％胎牛血清的f-12k培养基中。使用2000(invitrogen)进行转染。转染时，2000与dna以3∶1(μl∶μg)的比率在无血清培养基opti-中混合10分钟后，立即加入到要转染的细胞中。5～6h后，更换新鲜的dmem培养基。6.活体细胞成像(体内成像)在20mm玻璃细胞培养皿(nest)内完成瞬时转染，24h后开始进行活体细胞成像。成像前先用1mlpbs冲洗两次，然后用deme培养基(无酚红)冲洗一次。成像设备为倒置显微镜nikonti，配有cool-snaphq2ccd相机和nikonplanfluorelwd200.45-dicl-wd物镜。激发和发射设置如下：egfp为绿色通道，λex＝470/40，λem＝510/40nm；远红光荧光蛋白为远红光通道，λex＝630/20，λem＝690/50nm。图片使用imagej软件(nationalinstitutesofhealth)进行分析和处理。7.广域和超分辨率显微镜检查在室温，通过独立模式，使用配有100×1.49na油浸物镜的eclipseti-e倒置尼康显微镜上的尼康结构化照明系统，获取广域和结构化照明显微镜(sim)照片。使用640nm的半导体激光器(100mw，cube640-100c，coherent)激发fr荧光。使用受nis-elementsar软件(尼康)控制的电子倍增ccd相机(andorixon3du897)进行数据采集。使用nis-elementsar对图像进行处理。8.串联融合蛋白的构建bdfp系列的荧光蛋白可以通过以下连接子(linker)构建融合蛋白：11个氨基酸残基的连接子：ghgtgstgsgs；23个氨基酸残基的连接子：ghgtgstgsgssgtassednnma；31个氨基酸残基的连接子：ghgtgstgsgshgtgstgssgtassednnma。实验发现，上述3种不同长度的连接子对融合蛋白的荧光没有明显影响(结果未示出)。9.同源序列比对bdfp荧光蛋白结构比对，在swiss-model远程服务器上完成。采用的模板序列为钝顶螺旋藻(spirulinaplatensis)的藻胆蛋白apcb(pdbcode：1all)，对比软件为swiss-pdbviewer，版本4.1。采用pymol(http：//www.pymol.org/)创建蛋白结构图。采用clustal(http：//www.clustal.org/)创建完成蛋白序列比对图。10.光谱分析通过分光光度计(du800，beckman-coulter)来检测色素蛋白的紫外-可见吸收光谱。荧光蛋白的消光系数是依据胆色素bv在390nm处的吸收系数ε＝39,900m-1cm-1，进行参比换算的。通过荧光分光光度计(f320，天津港东科技发展股份有限公司)来检测荧光光谱。参考已知的irfp670荧光蛋白(φf＝0.122)检测荧光量子产率φf，样品检测环境为磷酸钾盐溶液(20mm，ph7.2，kpb)。11.荧光蛋白的稳定性检测检测不同ph条件下的稳定性实验。检测纯化后的bdfp荧光蛋白溶液，在不同ph缓冲液环境下的荧光强度变化。ph设置范围为2～10，其中ph2～5采用0.1m醋酸钠，0.3m氯化钠的缓冲体系；ph5.5～10采用0.1mnah2po4，0.3m氯化钠的缓冲体系。检测在强变性剂环境的稳定性实验。检测纯化后的bdfp荧光蛋白溶液，在不同浓度的盐酸胍溶液环境下的荧光强度变化，ph7.2。检测在高温环境下的稳定性实验。检测纯化后的bdfp荧光蛋白溶液，在80℃水浴锅中，荧光强度随时间的变化。光漂白实验。将荧光蛋白溶液(ph7.2，20mmkpb)滴入矿物油中，用100whbo103w/2光源100％功率照射，远红光滤光设置(λex＝630/20，λem＝690/50nm)，光聚焦镜头为100×油镜(c-apochromatoil-immersionlens)，孔径1.2，采用显微镜zeissaxioscopea1，成像相机为cool-snaphq2ccd。运用软件imagej(nationalinstitutesofhealth)分析数据。本领域技术人员应理解的是，对于本文未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》(第四版，m.r.格林和j.萨姆布鲁克著)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。所用试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例实施例1.同源序列比对分析图1示出了几个同源序列的对比，其中apcf2及其衍生序列bdfp1.1均来自chroococcidiopsisthermalispcc7203；apcb来自钝顶螺旋藻spirulinaplatensis，该藻种不适应远红光和近红外光生长环境。从图1可以看出，l113在apcb、apcf2和bdfp1.1之间是高度保守的。在bdfp1.1序列(seqidno.：2)基础上，对l113进行定点饱和诱变；筛选得到的突变体通过易错pcr反应，进行持续的随机突变，建立突变体文库。采用体外光谱性质检测和活体细胞成像的方法，按照以下筛选标准，对突变体文库中的突变体进行筛选：与bdfp1.1相比，目标突变体最大荧光发射波长发生明显蓝移，但仍大于660nm；同时与已知荧光蛋白标记irfp670(ε·φfl＝10.2mm-1cm-1)相比，分子亮度相当。通过筛选，首先得到7个突变体。对这7个突变体进行测序，测序结果发现它们分别具有如下表1中所示的氨基酸突变。在大肠杆菌中表达这7个突变体，然后通过ni2+亲和层析纯化表达的各突变体并进行蛋白定量。将等量的突变体蛋白置于检测溶液磷酸钾缓冲液(kpb，20mm，ph7.0)和0.5mnacl中。荧光发射光谱的激发光波长为620nm；分子亮度对比参照物为irfp670(ε·φfl＝10.2mm-1cm-1)。检测该7个突变体的光谱性质，结果如下表2所示。结合表1列出的各突变体的突变位点以及表2的光谱结果可以看出，bdfp1.1的最大发射波长约为707nm；突变体v1和v2均在l113处发生突变，它们的最大发射波长蓝移至约700nm；突变体v4在l113和g125处发生突变，其最大发射波长进一步蓝移至约670nm；突变体v6、v7和v8除了在l113和g125处发生突变之外，还具有其他位点的突变，但它们的最大发射波长均在670nm左右。上述结果表明，l113处的突变使得荧光蛋白的光谱蓝移(从约707nm蓝移至约700nm)，而且l113与g125组合突变是的荧光蛋白光谱蓝移效果更加显著(蓝移至约670nm)。其他位点，f30、q39、n47、m81、d101、v143或t151处的突变不会造成荧光蛋白光谱的进一步蓝移。另外，与bdfp1.1相比，可以看到l113突变提高了荧光蛋白的分子亮度，且l113与g125组合突变进一步提高了荧光蛋白的分子亮度。具体地，bdfp1.1的分子亮度为39，突变体v1和v2(带有l113突变)的分子亮度分别升高至70和57；突变体v4(带有l113和g125组合突变)的分子亮度进一步升高至157；其他带有l113和g125组合突变的突变体v6～v8的分子亮度均高于150。实施例2.检测各bdfp荧光蛋白在hek293t细胞内的有效亮度将表达各突变体的核酸(fps：ires：egfp)构建在表达载体pcdna3.1中，然后瞬时转染到hek293t细胞内，使用倒置荧光显微镜观察荧光亮度。结果示于图2中。图2a示出了分别在绿色通道和fr/nir通道下观察到的荧光图像。因为bdfp1.1、v1、v2、v3、v4、v7、v8、v14在fr/nir通道下，5s曝光时间没有采集到有效亮度的图像，因此采取30s曝光时间。其他突变体均采取5s曝光时间。图2b中示出了突变体v6(bdfp1.2)、v7和v8有效亮度的量化结果。从上面的结果可以看出，突变体v1、v2、v4、v6(bdfp1.2)、v7和v8均能在fr/nir通道下观察到荧光。另外，虽然突变体v4、v7和v8的分子亮度得到显著提高，但在hek293t细胞内的有效亮度并不高。与其相比，突变体v6(bdfp1.2)的有效亮度较高。实施例3.进一步的突变体筛选为了进一步寻找性质优异的突变体，发明人进行了又一轮突变。以与实施例1相同的筛选标准，筛选出20个突变体v13～v32，如下表3所示。同时，检测了突变体v13～v32的光谱性质，结果如上表4所示。从表4中的结果可以看出v13～v32的最大发射波长与v6(bdfp1.2)类似，均在670nm左右，且分子亮度也较高。实施例4.检测突变体v13～v32在hek293t细胞内的有效亮度以与实施例2相同的方法，将共表达各突变体和egfp的表达载体瞬时转染到hek293t细胞内，使用倒置荧光显微镜观察荧光亮度。结果示于图2(v13～v15)和图3中。图2a和3a示出了分别在绿色通道和fr通道下观察到的荧光图像。其中，由于突变体v17在5s曝光时间时未采集到有效亮度图像，因此采取30s曝光时间来采集图像(v14在30s曝光时间时也未采集到有效亮度图像，因此在图中未示出)。其他突变体均采取5s曝光时间。图2a和图3b分别对荧光亮度进行了量化。从图中可以看出，除了v14和v17之外，其他突变体在hek293t细胞内的有效亮度均很高。实施例5.检测各荧光蛋白在体外条件下的稳定性本实施例检测了荧光蛋白对体外条件，例如酸碱、变性条件、高温、光漂白的耐受性。结果示于图4中。图4a示出了各荧光蛋白在不同ph下的荧光强度。从图中可以看出，bdfp1.2(v6)和bdfp1.6(v23)荧光蛋白的荧光强度在ph2时荧光还保留50％以上(与ph7时相比)，而irfp670和mirfp670在ph3.5时荧光已经完全淬灭了。这说明bdfp1.2在低ph下是相对稳定的。图4b示出了各荧光蛋白在不同浓度的盐酸胍溶液中的荧光强度。从图中可以看出，bdfp1.2(v6)在3m盐酸胍(ph7.2)条件下，仍保留有70％以上的荧光。bdfp1.6(v23)荧光蛋白的耐受力更高，在3.5m盐酸胍条件下，还能保留约60％的荧光。图4c示出了各荧光蛋白在高温(80℃)下荧光保持的时间。从图中可以看出，bdfp1.2(v6)和bdfp1.6(v23)在80℃温浴2h后，仍保留有40％以上的荧光。而irfp670的荧光在80℃温浴2h后已经完全淬灭了，smurfp的荧光也降低至25％以下。图4d示出了各荧光蛋白在光漂白处理中荧光的保持时间。从图中可以看出，bdfp1.2(v6)和bdfp1.6(v23)在光漂白与irfp670、mirfp670和smurfp类似。基于上述结果，可以得出bdfp1.2(v6)和bdfp1.6(v23)在低ph、高浓度盐酸胍溶液或高温的环境中，都具有优异的稳定性，而且也能耐受光漂白。实施例6.检测各荧光蛋白在细胞中的有效亮度及其聚合状态样品在检测光谱前，需要通过ni2+亲和层析纯化，检测溶液环境为kpb(20mm，ph7.0)和0.5mnacl；荧光发射光谱的激发光波长为660nm。分子亮度的对比参照物为irfp670(ε·φfl＝10.2mm-1cm-1)。在hek293t细胞内的有效荧光(远红光)亮度，在转染pcdna3.1-fps：ires：egfp质粒24h后检测得到，无需添加外源胆色素bv或者共表达血红素氧化酶ho-1。结果示于下表5中。与上面的结果类似，bdfp1.1的最大发射波长约为707nm，bdfp1.2和bdfp1.6的最大发射波长发生明显蓝移，约为670nm。因此，bdfp1.2和bdfp1.6可以与bdfp1.1组合使用，进行双重荧光标记。另外，bdfp1.2在hek293t中有效亮度，每bv为10.5，每kda为21.8；bdfp1.6在hek293t中的有效亮度，每bv为61.6，每kda为128。这表明bdfp1.2和bdfp1.6的有效亮度均显著高于bdfp1.1，而且bdfp1.6的有效亮度与bdfp1.2相比又得到了进一步提高。实施例7.检测荧光蛋白在哺乳动物细胞中的单独表达及其与bdfp1.1的组合表达本实施例中，检测了bdfp1.2单独与组蛋白(h2b)、线粒体导入序列(mts)、角蛋白(keratin)或钙连蛋白(calnexin)的融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达，同时检测了bdfp1.2、bdfp1.6分别与bdfp1.1组合标记的效果。结果示于图5中。图5a示出了bdfp1.2单独标记的结果。在hek293t细胞中表达bdfp1.2与组蛋白(h2b)的融合蛋白；在helab细胞中表达bdfp1.2单独与线粒体导入序列(mts)、角蛋白(keratin)或钙连蛋白(calnexin)的融合蛋白。从图中可以看出，使用广域显微(widefield，wf)和结构化照明显微(sim，超分辨率显微镜)都可以清晰地观察到融合蛋白的荧光。图5b示出了bdfp1.1与bdfp1.2或bdfp1.6进行组合标记的结果。将融合蛋白bdfp1.2-mts与bdfp1.1-nls共转染在hela细胞中以组合表达。然后在荧光显微镜下检测。最左列的滤光片设置为λex＝630/20nm，λem＝667/30nm；中间列的滤光片设置为λex＝685/20，λem＝740/40nm；最右列为重叠图像。类似地，将融合蛋白bdfp1.6-h2b与bdfp1.1-mts共转染在hela细胞中以组合表达。从图中可以看出，bdfp1.2和bdfp1.6的融合蛋白所发出的远红光荧光可以与bdfp1.1的近红外光荧光区分开，从而能够同时对细胞进行双重标记。实施例8.检测bdfp系列蛋白串联构建体的吸收和发射光谱性质本实施例使用23个氨基酸的连接子，进一步构建了串联构建体bdfp1.1：1.2、bdfp1.1：1.6(如图7a所示)。将构建的串联构建体bdfp1.1：1.2、bdfp1.1：1.6、bdfp1.2：1.2和bdfp1.6：1.6转化到大肠杆菌中，并诱导表达。然后通过亲和层析纯化得到表达的融合荧光蛋白bdfp1.1：1.2、bdfp1.1：1.6、bdfp1.2：1.2和bdfp1.6：1.6。采用紫外可见吸收光谱仪和荧光光谱仪检测这些融合荧光蛋白的光谱性质，结果示于下表6中。从表6和图6b、c可以看出，同序列串联构建体bdfp1.2：1.2和bdfp1.6：1.6的发射峰波长均约为670nm，未发生明显变化。而异序列串联构建体bdfp1.1：1.2和bdfp1.1：1.6，吸收峰蓝移至640nm附近，荧光峰红移至710nm附近，这表明增大了stokes位移。另外，融合后荧光蛋白变为单体状态，不易发生聚集沉淀现象(数据未示出)。实施例9.检测串联构建的有效亮度及其聚合状态本实施例中，将串联构建体bdfp1.1：1.2、bdfp1.1：1.6、bdfp1.2：1.2和bdfp1.6：1.6瞬时转染至hek293t细胞中，于荧光显微镜下观察其有效亮度，结果示于表6、图6和图7e中。从表6和图6b可以看到，同序列串联构建体bdfp1.2：1.2和bdfp1.6：1.6的有效亮度均得到显著提高，且高于两个bdfp荧光蛋白单独使用时有效亮度的总和。图7e也得到了类似结果。这一结果表明，串联构建体中的两个bdfp荧光蛋白协同式地提高了串联构建体的有效亮度。另外，将融合蛋白bdfp1.2：1.2-组蛋白和bdfp1.1：1.6-线粒体导入序列共转染到hela细胞内，在荧光显微镜下进行观察，结果示于图7d中。其中，bdfp1.1：1.6-线粒体导入序列采用近红外通道来观察，bdfp1.2：1.2-组蛋白采用远红外通道观察。从图7d中可以看出bdfp1.2：1.2与bdfp1.1：1.6的荧光可以区分开，从而能够对细胞进行双重标记。sequencelisting<110>广州天宝颂原生物科技开发有限公司<120>源自bdfp近红外光荧光蛋白的新型荧光标记物及其融合蛋白<130>p18gz1nn03250cn<160>29<170>patentinversion3.5<210>1<211>169<212>prt<213>chroococcidiopsisthermalis<400>1metglnasplysleuthrservalalalysasncysaspleuthrgly151015serserleuasnarggluvalvalgluthrleulysglupheleuala202530aspglyglulysargvalglnvalalaglyvalileglyserasnala354045alagluilevallysthralavalserleuleupheglnglutyrpro505560gluleuvalserproglyglyasnalatyrthrthrargargtyrasn65707580mettyrvalargaspmetasntyrpheleuargtyrcyssertyrala859095ilevalalaglyaspalaservalleuaspgluargleuleualagly100105110leuargaspthrpheasnserleuglyileproleuglyprothrala115120125argserileglnleumetlysasnilevallysglulysleuvalthr130135140alaglymetthrasnilethrphevalaspglupropheasptyrval145150155160valarggluilesergluthrgluile165<210>2<211>152<212>prt<213>artificialsequence<220><223>bdfp1.1<400>2metalaasnarggluvalvalgluthrleulysglupheleualaasp151015glyglulysargvalglnvalalaglyvalileglythrasnalaala202530gluvalvallysthralavalserleuleupheglnglutyrproglu354045leuvalserproglyglycysalatyrthrthrargargtyrasnmet505560cysvalargaspmetasntyrpheleuargmetcyssertyralaile65707580valalaglyaspalaservalleuaspgluargleuleualaglyleu859095argaspthrpheasnserleuglyileproleuglyprothralaarg100105110serileglnleumetlyslysilevallysglulysleuvalthrala115120125glymetthrasnilethrphevalaspglupropheasptyrileala130135140arggluilesergluthrgluile145150<210>3<211>152<212>prt<213>artificialsequence<220><223>v1<400>3metalaasnarggluvalvalgluthrleulysglupheleualaasp151015glyglulysargvalglnvalalaglyvalileglythrasnalaala202530gluvalvallysthralavalserleuleupheglnglutyrproglu354045leuvalserproglyglycysalatyrthrthrargargtyrasnmet505560c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