瑞士乳杆菌素及其表达载体的构建与应用的制作方法

本发明属于生物技术及食品防腐领域，具体涉及瑞士乳杆菌素表达载体的构建及其应用。

背景技术：

乳酸杆菌是一种广泛存在于食品工业的革兰氏阳性菌。乳酸杆菌通过发酵碳水化合物、脂质、蛋白质等原料代谢产生多种具有抑菌活性的物质，如有机酸(乳酸)、过氧化氢、双乙酰、细菌素等。乳酸杆菌产生的细菌素在体内可以被蛋白酶降解，因此具有无毒、耐酸、耐高温、无残留、无抗药性等优点。但是其仅对近缘的乳酸菌及革兰氏阳性菌具有抑制作用，对革兰氏阴性菌几乎没有抑制效果。乳酸杆菌产生的细菌素主要有：lactacin，sakacin，plantaricin，helveticin等。嗜酸乳杆菌是乳酸杆菌的一种，是公认安全的(gras)的微生物。它是人体和动物肠道菌群中的优势种类，具有调节肠道菌群平衡，降低乳糖不耐受症状，抑制肠道有害菌生长，降低胆固醇的作用。其中瑞士乳杆菌素是由嗜酸乳杆菌和瑞士乳杆菌等分泌的蛋白类的细菌素，可以作为一种安全、无毒、天然的食品防腐剂和抗菌添加剂，在食品行业中有巨大的应用前景。目前，对瑞士乳杆菌的研究主要集中在利用其发酵特性开发乳制品及生产功能性多肽，而对瑞士乳杆菌产生细菌素的报道较少。瑞士乳杆菌素属于蛋白类的抗菌物质，对温度和蛋白酶比较敏感，仅抑制革兰氏阳性菌，抑菌谱较窄，产量低，纯化困难。并且瑞士乳杆菌素的产生受培养条件影响较大，只有在特定的条件下才会合成瑞士乳杆菌素，因此难以得到大量的纯度较高的瑞士乳杆菌素，无法满足其在食品中的应用要求。目前还没有瑞士乳杆菌素生产方法相关的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于为了克服瑞士乳杆菌素产量低的困难，提供了两种瑞士乳杆菌素的基因，克隆并在大肠杆菌中表达了瑞士乳杆菌素，进而复性后得到大量活性瑞士乳杆菌素，显著地提高了瑞士乳杆菌素的产量，降低生产成本，并应用于人工污染牛奶中，具有良好的抑菌效果。

本发明通过以下技术方案实现：

瑞士乳杆菌素，其核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示。

瑞士乳杆菌素，其氨基酸序列如seqidno.3或seqidno.4所示。

瑞士乳杆菌素表达载体，包括整合了权利要求2所述的seqidno.1或seqidno.2所述序列的自主复制型表达质粒。

进一步，所述的瑞士乳杆菌素表达载体，所述自主复制型表达质粒包括pqe3、pqe4、pqe5、pqe6、pqe30、pqe32、pqe51、pqe70、pgex-2t、pgex-4t、pgex-5x、pgex-6p、pet3a、pet9a、pet21a、pet23a、pet24a、pet28a、pet30a、pet32a、pet42a、pet44a中的任意一种。

进一步，所述的瑞士乳杆菌素表达载体的构建方法，包括通过引物扩增seqidno.1或seqidno.2序列，回收扩增产物，连接到t载体，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选后利用限制性内切酶酶切t载体和自主复制型表达质粒，通过dna连接酶连接，然后转化大肠杆菌感受态细胞得到。

更进一步，所述的瑞士乳杆菌素表达载体的构建方法，通过引物nx267-f：ggatccatgacttgcacgagactcaggata和引物nx267-r：ctcgagctagcaccacgcgttaataata扩增seqidno.1序列，通过引物nx371-f：ggatccatggttaaaagtattacacctc和引物nx371-r：ctcgagctacaaatcagtaatatggaaaatc扩增seqidno.2序列，回收扩增产物，连接到t载体，转化大肠杆菌感受态细胞，氨苄青霉素抗性平板筛选后利用限制性内切酶酶切t载体和自主复制型表达质粒，通过dna连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到。

一种重组以上所述的瑞士乳杆菌素包涵体蛋白的复性方法，采用蛋白复性缓冲液通过目的蛋白浓度梯度稀释的方法进行复性。

进一步，所述的复性方法，所述蛋白复性缓冲液包括：ph为9-10的硼砂-氢氧化钠缓冲液、ph为2-4的邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、ph为2-8的磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液、ph为2-7的柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、ph为3-7的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、ph为6-8的磷酸盐缓冲液、ph为9-11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、ph为3.5-6的乙酸-乙酸钠缓冲液或ph为7-9的tris-盐酸缓冲液中的任意一种或几种。

更进一步，所述的复性方法，所述蛋白复性缓冲液中添加了精氨酸、甘油、peg4000、peg6000、peg8000、尿素、蔗糖、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、十六烷基三甲基溴化铵、β-环糊精、盐酸胍、二硫苏糖醇、半胱氨酸、胱氨酸、十二烷基硫酸钠或硫代甜菜碱中的任意一种或几种。

一种食品添加剂，包括以上所述的瑞士乳杆菌素。

以上所述的瑞士乳杆菌素在抑制沙门氏菌、阪崎克罗诺杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌、副溶血性弧菌、表皮葡萄球菌或李斯特菌中的应用。

在前期的研究中，我们得到一株具有宽抑菌谱的嗜酸乳杆菌，该菌不仅对近缘的乳酸菌具有很好的抑制效果，而且对大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉、黑曲霉、烟曲霉、尖镰孢菌都具有一定的抑制效果。通过鉴定发现抗菌物质属于瑞士乳杆菌素。虽然该菌株的代谢产物具有广谱的抑菌活性，但是瑞士乳杆菌素的产量太低，成本较高，无法满足工业化生产的要求。

而本发明通过对瑞士乳杆菌素包涵体蛋白复性条件和参数的控制实现在两种新型广谱瑞士乳杆菌素的生产，并提高了产量，降低了生产成本。并且通过在人工污染的牛奶中添加瑞士乳杆菌素的方法，控制了牛奶中微生物的数量，说明通过该发明生产的瑞士乳杆菌素可以用于在牛奶等乳制品中，替代或者部分的替代目前用于最广泛的化学防腐剂。

附图说明

图1瑞士乳杆菌素nx267和nx371的进化树示意图；

图2瑞士乳杆菌素nx267(mh450111)与eew68007.1氨基酸序列比对图；

图3瑞士乳杆菌素nx371(mh450112)与afr21596.1氨基酸序列比对图；

图4瑞士乳杆菌nx267和nx371表达及纯化结果图；

图5瑞士乳杆菌素nx267和nx371稳定性图；

图6瑞士乳杆菌素nx267在人工污染牛奶中的应用菌落测试图，其中(a)和(b)为放置在25℃；(c)和(d)为放置在4℃。

具体实施方式：

实施例1

嗜酸乳杆菌nx2-6基因组测序

嗜酸乳杆菌nx2-6在mrs平板上活化之后，挑取单菌落接种到mrs液体培养基，30℃静置培养24小时，至od600达到1.0左右。离心后收集菌体，按照基因组提取试剂盒(omega)说明提取基因组。基因组送深圳市恒创基因科技有限公司测序。得到原始的测序数据307mb，有效数据300mb。组装前，采用基于k-mer统计的分析方法来估计基因组大小，预测基因组大小约为2.05m。使用genemarks软件可以对新测序的基因组进行编码基因预测，共鉴定出基因2075个。通过数据库：nr(版本：20150405，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；kegg(版本：59，http://www.genome.jp/kegg/)；cog(版本：20090331，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cog/)；go(版本：20150405，http://geneontology.org/)；swiss-prot版本：20150414，http://www.ebi.ac.uk/uniprot/)。trembl(版本：20150414，http://www.ebi.ac.uk/uniprot/)对基因进行注释和聚类分析。

实施例2

新型瑞士乳杆菌素基因的挖掘

瑞士乳杆菌素具有较大的可变性，从不同乳酸菌中分离出的瑞士乳杆菌素氨基酸差异较大。大部分的瑞士乳杆菌素之间存在同源序列。我们从ncbi中下载目前已鉴定出的42种瑞士乳杆菌素分析其保守序列并与嗜酸乳杆菌nx2-6中基因进行比对。预测出的两种瑞士乳杆菌素家族的细菌素(nx267、nx371)其碱基序列如seqidno.1和seqidno.2所示，氨基酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示。瑞士乳杆菌素nx267和nx371进化树分析发现(图1)，nx267与瑞士乳杆菌dsm20075中的eew68007.1蛋白的亲缘关系相近，氨基酸序列比对发现，二者的相似度为80.44％(图2)，说明瑞士乳杆菌素nx267是一种新型的细菌素。nx371与瑞士乳杆菌r0052菌株的afr21596.1蛋白相似度较高，氨基酸序列比对发现，二者的相似度为98.15％(图3)。但是也存在6个氨基酸的差异。

实施例3

瑞士乳杆菌素表达载体构建

根据瑞士乳杆菌素nx267(seqidno.1)和nx371(seqidno.2)的序列，设计引物nx267-f:ggatccatgacttgcacgagactcaggat和nx267-r:ctcgagctagcaccacgcgttaataata(小写字母为限制性内切酶bamhⅰ和xhoⅰ的识别位点)扩增瑞士乳杆菌素nx267。以瑞士乳杆菌nx2-6的基因组为模板，采用高保真的superpfu酶扩增基因nx267，扩增条件为：预变性95℃3分钟，变性95℃30秒，退火45℃30秒，延伸72℃60秒。35个循环，最后72℃延伸7分钟。扩增产物1％琼脂糖电泳后，割胶回收(方法参照bbi公司胶回收试剂盒方法进行)。将片段连接到pmd19-t载体，转化大肠杆菌dh5α，在氨苄青霉素平板上筛选阳性克隆。提取质粒后，加入bamhⅰ和xhoⅰ酶切30分钟。同时，利用bamhⅰ和xhoⅰ内切酶处理表达载体pet30a。1％琼脂糖电泳后，割胶回收。利用t4连接酶将nx267与pet30a连接到一起，条件：nx267片段1μl，pet30a载体5μl，buffer1μl，t4dnaligase1μl，水2μl；16℃过夜连接，化学法转化大肠杆菌dh5a，通过pcr的方法验证阳性转化子。送测序，确保碱基没有突变。

采用相同的方法，通过引物nx371-f：ggatccatgacttgcacgagactcaggat和nx371-r；ctcgagctacaaatcagtaatatggaaaatc扩增瑞士乳杆菌素nx371基因，并连接到表达载体pet30a上。重组载体构建并且测序验证完成后，转化表达宿主大肠杆菌bl21(de3)，pcr检测阳性转化子。阳性转化子接种lb培养基，37℃培养至od600大约0.8左右，加入终浓度1mm的iptg作为诱导剂。16℃180rpm过夜培养。

实施例4

重组瑞士乳杆菌素的表达及纯化

重组菌株经过iptg诱导后，5000g离心5分钟收集菌体，用tris-hcl缓冲液(50mmtris，50mm氯化钠，1mmedta，10mmdtt，ph8.2)清洗一遍。加入五分之一发酵液体积的破碎液(50mmtris，50mm氯化钠，1mmedta，10mmdtt，2m尿素，ph8.2)超声波破碎30分钟(30％功率，开1秒停2秒)。12000g离心5分钟收集沉淀，沉淀用洗涤缓冲液(50mmtris，50mm氯化钠，1mmedta，10mmdtt，2％tritonx-1002m尿素，ph8.2)清洗两次，离心收集沉淀。用百分之一体积的变性液i(50mmtris，50mm氯化钠，1mmedta，10mmdtt，6m盐酸胍，ph8.2)溶解，充分涡旋处理5分钟。离心，上清液加入10倍体积的沉淀液(50mmtris，50mm氯化钠，1mmedta，10mmdtt，ph8.2)，室温混匀，处理10分钟。12000离心，沉淀用变性液ii(50mmtris，50mm氯化钠，1mmedta，10mmdtt，8m尿素，ph8.2)溶解。

变性后的样品通过akat蛋白纯化仪纯化，具体条件为：镍柱先用变性液ⅱ平衡5个柱体积，控制样品缓慢通过镍柱(0.5ml/min，5ml预装柱)，用含有25mm咪唑的变性液ⅱ清洗3个柱体积，去掉未结合的杂质蛋白。用含有150mm咪唑的变性液ⅱ洗脱目的蛋白。收集的样品在透析袋中4℃过夜透析(缓冲液为变性液ⅱ)，去掉咪唑。用10kd的超滤管浓缩样品。诱导及纯化的结果如图4所示，诱导后有明显的目的蛋白条带，纯化后条带单一，纯度较高。

实施例5

蛋白复性

在不同的蛋白复性缓冲液(硼砂-氢氧化钠缓冲液，ph9-10)、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液(ph2-4)、磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液(ph2-8)、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液(ph2-7)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(ph3-7)、磷酸盐缓冲液(ph6-8)、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(ph9-11)、乙酸-乙酸钠缓冲液(ph3.5-6)和tris-盐酸缓冲液(ph7-9)中探索复性缓冲液的主要成分。添加辅助复性试剂如：精氨酸、甘油、peg4000、peg6000、peg8000、尿素、蔗糖、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、β-环糊精、盐酸胍、二硫苏糖醇、半胱氨酸、胱氨酸、十二烷基硫酸钠、硫代甜菜碱等中的任意一种或几种。通过改变复性缓冲液的ph(3、4、5、6、7、8、9、10、11)确定最佳的复性ph。通过改变复性时蛋白的浓度(10、20、50、100、200、400μg/ml)确定最佳的复性蛋白浓度。采用双层平板法，以大肠杆菌为指示菌，检测复性后蛋白的活性。部分结果如表1所示，乙酸-乙酸钠缓冲液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液复性后检测到抑菌活力，其中柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在ph5.0左右的抑菌活力最强。不同的蛋白复性助剂的瑞士乳杆菌素复性的影响如表2所示，谷胱甘肽和甘油能够促进瑞士乳杆菌素nx267和nx371的复性。

表1、瑞士乳杆菌素在不同缓冲液中的复性

“+”表示抑菌圈直径在6-9mm，“++”表示抑菌圈直径在9-12mm，“+++”表示抑菌圈直径大于12mm。其中打孔的直径为6mm。

表2、不同的蛋白复性助剂对瑞士乳杆菌素复性的影响

“+”表示抑菌圈直径在6-9mm，“++”表示抑菌圈直径在9-12mm，“+++”表示抑菌圈直径大于12mm。其中打孔的直径为6mm。

实施例6

抑菌活性分析

最小抑菌浓度(mic)测定：在96孔板中加入50μl约2×10⁶cfu的指示菌，加入50μl不同浓度的瑞士乳杆菌素，使培养液中瑞士乳杆菌素的终浓度为400、200、100、50、25、12、6μg/ml。在37℃，200rpm培养24小时后，测od600值。

根据od600大小，选择合适的处理样品，稀释后涂平板计数。与阳性对照相比，抑制率超过90％的最小蛋白浓度为最小抑菌浓度mic90。

阳性对照为样品中加入50μlph5.0的柠檬酸缓冲液。阴性对照为纯培养基不加指示菌，确保培养基没有污染。

瑞士乳杆菌素nx267和nx371的抑菌谱及最小抑菌浓度如表3所示，其对食源性的致病菌如沙门氏菌、阪崎克罗诺杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌、副溶血性弧菌、表皮葡萄球菌和李斯特菌均有明显的抑制作用，并且最小抑菌浓度mic90比nisin小，抑菌谱比nisin广。这说明瑞士乳杆菌素可以可以替代nisin作为食品添加剂，控制食品中的微生物的数量。

表3瑞士乳杆菌素抑菌谱及最小抑菌浓度

每行中不同的上标小写字母表示存在统计学上的显著性差异(p<0.05)

实施例7

稳定性分析

以大肠杆菌为指示菌，将瑞士乳杆菌素nx267、nx371样品调节蛋白浓度至不同的浓度，测定不同浓度的瑞士乳杆菌素对指示菌的抑制率，并制作抑制率曲线。

检测方法：样品经过不同的处理后，按照抑菌试验方法测定对大肠杆菌的抑制率，根据抑菌曲线计算对应的瑞士乳杆菌素浓度，得到瑞士乳杆菌素的相对浓度。相对活性计算按照以下公式：

温度稳定性：将样品蛋白浓度调节至200μg/ml，在不同的温度下(5、15、20、30、40、50、50、60、70、80、90、100、110和120℃)处理1小时，按照上面描述抑菌试验方法测定对指示菌的抑制率。

酸碱稳定性：在样品中加入盐酸或者氢氧化钠调接到不同的酸碱度(ph1-14)，4℃条件下处理1小时，再将ph调节至5.0，将蛋白浓度调节至200μg/ml，按照上面描述抑菌试验方法测定对指示菌的抑制率。

蛋白酶稳定性：在样品中加入不同的蛋白酶，37℃处理1小时，80℃加热5分钟，杀死蛋白酶。调节ph至5.0，蛋白浓度为200μg/ml，按照上面描述抑菌试验方法测定对指示菌的抑制率。

储藏稳定性：将样品处存在不同的温度下，定期检测抑菌活力，按照下列公式计算半衰期：

t为处理的时间(天)，aut表示在t天的活性，au0表示在0天的活性.

瑞士乳杆菌素nx267和nx371的稳定性如图5所示，在较低的处理温度下稳定性较好，60℃条件下处理1小时，活力能够存留60％以上。在贮藏稳定性方面，贮存在4℃以下，半衰期大于50天。ph的耐受性较好，在ph4-8之间处理时，抑菌活力保留较高。而其他的乳酸菌产生的细菌素如nisin，仅在酸性环境下稳定和具有抑菌活力。瑞士乳杆菌素对蛋白酶比较敏感，胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶处理后检测不到抑菌活力，胰蛋白酶、蛋白酶k、中性蛋白酶处理后还剩余部分活力。

实施例8

瑞士乳杆菌素nx267在人工污染牛奶中的防腐效果

uht灭菌的无菌奶中加入大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌至终浓度10³cfu/ml。将样品放置在4℃和25℃，每天采用平板法检测样品中的菌落数。结果如图6所示，在25℃条件下，对照组的菌落数迅速增加，3天左右达到10¹⁰cfu/ml。处理组3天时仅10⁴cfu/ml，7天后小于10⁶cfu/ml。在4℃条件下，对照组的菌落数增长较慢，革兰氏阴性菌在7天时达到10⁴cfu/ml，革兰氏阳性菌达到10⁵cfu/ml。实验组的菌落数基本没有变化，维持在10³cfu/ml。这说明瑞士乳杆菌素nx267可以用在牛奶等乳制品的防腐中。

序列表

<110>南京福斯弗瑞生物科技有限公司

南京农业大学

<120>瑞士乳杆菌素及其表达载体的构建与应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>726

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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tctggtcaagcaggtggtcacactcaaacatgggaatatgcaggcaatcgcatcaaatct300

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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202530

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354045

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325