BRCA1基因g.43063754T>G突变体及其在乳腺癌辅助诊断中的应用的制作方法

本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，具体涉及一种brca1基因g.43063754t>g突变体及其在乳腺癌辅助诊断中的应用。

背景技术：

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，它严重威胁女性健康。已有研究显示约有5～10％的乳腺癌病例是发生于携带有自体显性遗传且高外显率的乳腺癌易感基因突变者，相关基因有brca1、brca2、p53、pten、atm等。乳腺癌易感基因包括高外显率易感基因、中外显率易感基因和低外显率易感基因。其中，brcal和brca2基因是最主要的高外显率易感基因，也是目前研究最为确切的与乳腺癌发生相关的两个基因，表现出明显的家族遗传倾向。brcal和brca2基因都是抑癌基因。brcal基因定位于染色体17q21区域，基因大小为81.19kb，共有24个外显子。brcal基因富含alu重复序列，上游5’端存在假基因序列。brca2基因定位于染色体13q12-13区域，基因大小为84.19kb，共有27个外显子。brca2基因富含at。brcal蛋白由1863个氨基酸残基组成，n端ring结构域，中部含有核定位序列，即nls；c端包含brctl和brct2结构域。brca2蛋白由3418个氨基酸残基组成，其11号外显子编码8个brc模体，通过该模体有助于brca2蛋白与rad51蛋白相互结合，修复损伤双链dna。它们编码的蛋白都是同源重组系统中参与dna双链损伤修复的重要组成成分，也通过参与细胞周期监测、转录调控及染色质重塑来维持基因组的稳定性。

大量研究证明携带有这两个基因致病性突变的妇女终生患乳腺癌的风险显著升高。据估计，携带有brcal基因突变的妇女到70岁时患乳腺癌的累积风险达到65～87％；而携带有bcra2基因突变的妇女到70岁时患乳腺癌的累积风险为45～84％。此外，这两个基因的突变也可能增加其他一些恶性肿瘤的发病危险度。因此一些发达国家已经开展了对于适当选择的病人进行的遗传咨询和遗传检测，并对检测到的突变携带者给予早期筛查与预防干预。因此有必要对中国高危乳腺癌人群中这两个基因的变异情况有一个全面的认识，建立一个快速、准确的筛查检测方法，制定关于中国妇女的遗传筛查指南，以便于在特定人群中早期发现、早期预防并最终降低乳腺癌的发病率。

技术实现要素：

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种brca1基因g.43063754t>g突变体、检测该突变体的特异性引物、包含该特异性引物的诊断试剂盒和该突变体在乳腺癌辅助诊断中的应用，以实现快速方便的辅助判断乳腺癌。

技术方案：为实现上述目的，本发明的一种brca1基因g.43063754t>g突变体，其野生型brca1基因dna序列如seqidno:1所示，其突变型brca1基因dna序列如seqidno:2所示。

进一步的，一种用于检测所述brca1基因g.43063754t>g突变体的特异性引物，所述特异性引物的上游引物序列如为seqidno:3所示，下游引物序列如seqidno:4所示。

进一步的，一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，包括用于检测所述brca1基因g.43063754t>g突变体的特异性引物。

进一步的，一种brca1基因g.43063754t>g突变体在乳腺癌辅助诊断中的应用，利用外周血通过权利要求3所述一种乳腺癌辅助诊断试剂盒检测brca1基因g.43063754t>g位点突变，再通过突变位点谱辅助判断乳腺癌；所述一种乳腺癌辅助诊断试剂盒检测brca1基因g.43063754t>g位点突变的具体步骤如下，

(1)提取全血基因组dna；

(2)利用权利要求2所述用于检测brca1基因g.43063754t>g突变体的特异性引物进行pcr扩增反应，并得到pcr扩增产物；

(3)检测brca1基因是否存在g.43063754t>g突变基因。

进一步的，所述检测brca1基因是否存在g.43063754t>g突变基因的具体步骤如下，

(1)利用琼脂糖凝胶将所述pcr扩增产物进行电泳；

(2)将电泳后的pcr扩增产物进行纯化回收，以方便测序；

(3)将纯化后的pcr扩增产物在dna测序仪上进行测序，将测序结果与野生型brca1参考序列ncbireferencesequence:nc_000017.11进行比对。

进一步的，pcr扩增反应的总体积为50μl，含pcr5×缓冲液10μl，dna模板5.0μl，taq聚合酶1.0μl，mgcl2终浓度2.0mmol/l，dntp终浓度200nmol/l，以及特异性的上游引物和下游引物终浓度200nmol/l，并加消毒双蒸水至总体积50μl；反应条件为95℃预变性5分钟，然后依次95℃变性30秒，接着58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环。

有益效果：本发明的有益效果如下所述：一种乳腺癌辅助诊断试剂盒只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，再通过突变位点谱辅助判断乳腺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗；本发明获得了乳腺癌发病相关突变位点谱和特异性标志物。通过突变位点序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

附图1为brca1基因g.43063754t>g突变基因检测凝胶电泳图；

附图2为brca1基因g.43063754t>g突变基因测序图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

如附图1至2所述的一种brca1基因g.43063754t>g突变体，其野生型brca1基因dna序列如seqidno:1所示，其突变型brca1基因dna序列如seqidno:2所示，突变型brca1基因dna序列相比野生型brca1基因dna序列具有g.43063754t>g位点突变。

本实施例采用pcr扩增和sanger测序技术在58例具有乳腺癌家族史的中国汉族女性乳腺癌患者中，我们发现有1例患者存在brca1基因组第17号染色体的43063754位置发生碱基t到g碱基的突变，该基因在ncbl参考数据库grch38.p12中的编号为nc_000017.11(43044295-43125483)。随后进行无家族史乳腺癌样本验证，在1850例无家族史中国汉族乳腺癌女性乳腺癌患者中，存在4例患者携带该突变；在1850例无肿瘤家族史，年龄匹配的正常女性对照人群中，未发现突变个体。为进一步提高该突变致乳腺癌的可靠性，我们建立了正常人群队列(排除任何肿瘤患者，排除乳腺癌家族史患者)中女性3000名(35岁～65岁)检测该突变，发现突变阳性1例(基线时为48岁)，经追踪随访查出7例新发乳腺癌患者，其中包含该突变阳性者。该突变位点为本研究首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，且在正常人群中不存在该突变，通过纳入前瞻性队列研究，证明了携带该突变的患者最终发展成了乳腺癌，证明了该位点是乳腺癌的致病因素。

以上所发现的与乳腺癌辅助诊断相关的突变位点为g.43063754t>g，该突变发生于第17号染色体的43063754位置，该基因在ncbl参考数据库grch38.p12中的编号为nc_000017.11(43044295-43125483)，这里列出在该数据库中包含有本位点野生型的部分碱基序列供参考，如seqidno:1所示，brca1基因突变相对应的序列如seqidno:2所示，其中突变位点在seqidno:1序列的第138位由碱基t突变为g。其中

seqidno:1

taaatccctagctcatatgctaacattgctaggagcagattaggtcctattagttataaaagagacccattttcccagcatcaccagcttatctgaacaaagtgatattaaagataaaagtagtttagtattacaattaaagaccttttggtaactcagactcagcatcagcaaaaaccttaggtgttaaacgttaggtgtaaaaatgcaattctgaggtgttaaagggaggaggggagaaatagtattatact

seqidno:2

taaatccctagctcatatgctaacattgctaggagcagattaggtcctattagttataaaagagacccattttcccagcatcaccagcttatctgaacaaagtgatattaaagataaaagtagtttagtattacaatgaaagaccttttggtaactcagactcagcatcagcaaaaaccttaggtgttaaacgttaggtgtaaaaatgcaattctgaggtgttaaagggaggaggggagaaatagtattatact

该突变位点首次在中国汉族女性乳腺癌患者中发现，且在正常人群中不存在该突变，数据库显示欧美人群该区域的扫描也未发现该突变位点。通过纳入前瞻性队列研究，证明了携带该突变的患者最终发展成了乳腺癌，证明了该位点是乳腺癌的致病因素。

本发明通过控制年龄对疾病发展的影响因素，研究突变位点在乳腺癌辅助诊断的应用前景，阐述突变位点对于乳腺癌进展的影响，揭示其诊断价值。

一种用于检测权利要求1所述一种brca1基因g.43063754t>g突变体的特异性引物，所述特异性引物的上游引物序列如为seqidno:3所示，下游引物序列如seqidno:4所示。

一种乳腺癌辅助诊断试剂盒，包括所述用于检测brca1基因g.43063754t>g突变体的特异性引物。

突变位点试剂盒的制作和操作流程是基于pcr扩增和sanger测序扫描检测技术。试剂盒含有一批突变位点特异性引物(包括下列引物：g.43063754t>g突变位点的引物序列为seqidno:3和seqidno:4)，该试剂盒还可以包括pcr反应常用的试剂，如taq酶、dntp混合液、mgcl2溶液、去离子水等；这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还含有标准品和/或对照品(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测突变位点，再通过突变位点谱辅助判断乳腺癌，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

一种brca1基因g.43063754t>g突变体在乳腺癌辅助诊断中的应用，利用外周血通过权利要求3所述一种乳腺癌辅助诊断试剂盒检测brca1基因g.43063754t>g位点突变，再通过突变位点谱辅助判断乳腺癌；所述一种乳腺癌辅助诊断试剂盒检测brca1基因g.43063754t>g位点突变的具体步骤如下，

(1)提取全血基因组dna；

(2)利用权利要求2所述用于检测brca1基因g.43063754t>g突变体的特异性引物进行pcr扩增反应，并得到pcr扩增产物；

(3)检测brca1基因是否存在g.43063754t>g突变基因。

所述提取全血基因组dna的具体步骤如下所述，

(1)取无菌2.0ml离心管一只，加入1ml细胞裂解液；

(2)轻轻震荡然经edta抗凝的全血样本，直到彻底混匀；然后吸取500μl血样加入上述含有细胞裂解液的离心管中，轻轻倾倒离心管5-6次混匀；

(3)室温孵育10分钟(期间颠倒离心管2-3次混匀)；

(4)12000rpm室温离心5分钟；

(5)用移液器缓慢的尽可能将上清液移弃干净，注意勿将两相交界处的白色物质吸出；

(6)使用涡旋振荡器(votex)剧烈混匀，直至白细胞重悬(10-15秒)；

(7)向重悬细胞溶液中加入核裂解液300μl。用移液枪头吸放溶液5-6次裂解白细胞。此时溶液应变得很粘稠。若混合后可见细胞团块，则将溶液置于37℃孵育直至团块消散。若孵育1小时后仍可见细胞团块，则另加核裂解液100μl并重复置于37℃孵育；

(8)向核裂解物中加入蛋白沉淀液100μl，用涡旋振荡器剧烈震荡10-20秒；

(9)12000rpm室温离心5分钟；

(10)将其上清液转至对应编号的已加入300μl室温异丙醇的2.0ml离心管中；

(11)轻轻颠倒以混匀溶液，直至白色线状dna形成沉淀；

(12)12000rpm室温离心1分钟；

(13)弃去上清液，加入与样本量等体积的室温70％乙醇，轻轻颠倒离心管数次。

(14)用移液器缓慢的尽可能将乙醇液移弃干净。将离心管置于50℃烘烤5-10分钟，尽量让残余的乙醇液挥发干净。

(15)向离心管中加入50-100μl的dna溶解液，轻轻混匀。

(16)用1％琼脂糖凝胶电泳来评估dna提取效果，nanodrop核酸仪检测含量，定量到20-50ng/μl，-20℃保存。

所述检测brca1基因是否存在g.43063754t>g突变基因的具体步骤如下，

仪器：veriti96型pcr仪、bio-radgeldocxr+型凝胶成像仪(美国伯乐公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。

试剂：qiaampdna提取试剂盒(德国qiagen公司)；dnaisolationkit提取试剂盒(北京pelfreez公司)；pcr缓冲液、dntp、taq酶(美国abi公司)；引物由上海生工生物有限公司合成。

(1)引物设计：根据美国国家生物信息中心(ncbi)genbank记录的brca1基因(序列号:nc_000017.11)，通过oligo6.0引物软件设计引物，最终确定1对特异性寡核苷酸引物序列为f:5’-aagtagtttagtattacaatg-3’(seqidno:3)和r:5’-tgggtagttagctatttctgta-3’，扩增产物片段长度为159bp。

(2)反应总体积：50μl，含pcr5×缓冲液10μl，dna模板5.0μl，taq聚合酶(1u/μl)1.0μl，mgcl2终浓度2.0mmol/l，dntp终浓度200nmol/l，以及特异性上、下引物终浓度200nmol/l，并加消毒双蒸水至总体积50μl。

反应条件：95℃预变性5分钟，然后依次95℃变性30秒，接着58℃退火30秒，72℃延伸30秒分钟，共35个循环。

(3)brca1基因g.43063754t>g突变基因检测：用1.5％琼脂糖凝胶对将步骤(2)所得的增扩产物进行电泳，以检测其是否有目的片段。通过凝胶成像仪观察结果并拍照，pcr产物经电泳后显示为单一条带，无杂带，则提示pcr产物单一，无非特异扩增。若条带位置位于适当大小的位置，则为目的片段。如图1所示，m：50bp梯度分子量标记物，1：空白对照，2：野生型对照，3：brca1基因g.43063754t>g突变样本。

(4)扩增产物纯化：本研究采用takara公司的agarosegeldnapurificationkit试剂盒将琼脂糖凝胶电泳后的pcr产物进行纯化回收，准备测序。

(5)sanger测序和结果判断：纯化后pcr产物在abi3730型全自动dna测序仪上进行测序。将测序结果与brca1野生型参考序列(ncbireferencesequence:nc_000017.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。检测所得基因突变测序图如图2所示，图中箭头所示为brca1基因显示g.43063754t>g位点突变。

相关突变位点寡核苷酸引物序列如表1所示。

表1

其中，f＝上游引物序列；r＝下游引物序列。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。