一种可多组实验用的斑马鱼胚胎急性毒性检测试剂盒的制作方法

本发明涉及斑马鱼胚胎急性毒性检测技术领域，具体是涉及一种可多组实验用的斑马鱼胚胎急性毒性检测试剂盒。

背景技术：

斑马鱼是一种常见的热带鱼。斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm，对水质要求不高。孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。发育温度要求在25～31℃之间。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库里有相关的资料可供查询和下载，方便了研究。斑马鱼由于养殖方便、繁殖周期短、产卵量大、胚胎体外受精、体外发育、胚体透明，已成为生命科学研究的新宠。全球范围内有超过1500个斑马鱼实验室。利用斑马鱼，可以研究生命科学的基础问题，揭示胚胎和组织器官发育的分子机理；可以构建人类的各种疾病和肿瘤模型，建立药物筛选和治疗的研究平台；可以建立毒理学和水产育种学模型，研究和解决环境科学和农业科学的重大问题。

斑马鱼的基因与人类基因相似度达到87％，这意味着在它身上得出的水质监测结果，多数情况下都适用于人类。因此对于某些毒性物质的反应也能更好与对人体的毒性反应类似，以试验样品浓度和相应浓度下斑马鱼胚胎的死亡率或畸形率为基础建立正相关关系，并根据未添加试验样品的斑马鱼胚胎为参考，通过恒温培养来快速的测出样品的急性毒性，因此如果能结合此原理快速测定物质毒性，直观的表征方便快速的判断，进行安全性评估，建立早期、灵敏及高通量筛选的急性毒预防系统，为进一步研发提供基础数据和实验依据。

技术实现要素：

本发明的目的是，为提高斑马鱼胚胎急性毒性实验的结果准确性、检测效率等，提供了一种可多组实验用的斑马鱼胚胎急性毒性检测试剂盒。

本发明的技术方案是:一种可多组实验用的斑马鱼胚胎急性毒性检测试剂盒，包括培养盒、中心盒、转动盘、温控装置和控制底座；位于试剂盒底端的控制底座，其上顶面环绕有一圈转动轨，用于带动转动盘转动，控制底座的侧面前端设有调节钮与转动轨连接，用于控制转动轨运动；位于控制底座中心上端的中心盒呈圆柱状，其内后端依次设有的培养液瓶和胚胎瓶用于分别放置胚胎培养液和斑马鱼胚胎，中心盒内前端的电池组用于给装置供电；环绕在中心盒上的转动盘，等分为四部分，每部分上置有一个孔数相同的测试板，每孔放置一个测试孔用于存放待测化学品及对比液；位于转动盘上端的温控装置，用于将待测化学品及对比液温度控制在29.5℃±0.1℃；位于中心盒上端的培养盒，其通过转动轴与温控装置上顶面左端连接进行转动；培养盒上设有保温盖，培养盒内设有培养皿，培养皿与培养盒之间空仓为水浴仓；转动盘和温控装置前端均开有的扇形缺口组成扇形空仓，用于进行试剂添加进培养皿。设置转动盘，通过转动的方式便于不同组别的实验，容量大，不易混淆；设置温控装置可满足添加待测化学品和对比液对温度的要求；通过圆形的设计，将各试剂位置进行合理布置，结构紧凑，容量大，使用方便。

进一步地，利用所述试剂盒进行斑马鱼胚胎急性毒性实验的方法为:

1)在25-30℃的环境下，将胚胎瓶中的斑马鱼胚胎用胚胎培养液清洗两遍，随机移取胚胎至1ml胚胎培养液/孔的培养皿中，每孔8-12胚胎；

2)将待测化学品及对比液分别装入单独的测试板的测试孔中，使用巴氏吸管吸去培养皿中胚胎培养液后，迅速加入待测化学品和对比液，每孔加液1ml，每16h换液一次；

3)将培养皿放入恒温培养箱内进行培养，然后在12-72小时观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率，通过判断和对比来确定待测化学品的急性毒性。

根据本发明的一个方面，所述的胚胎瓶制备方法为：

1)选择游动和体色均正常，摄食无异常的6-24月龄的健康性成熟的斑马鱼，按照雌雄比例为1：1-2的比例放入交配容器内，并在交配容器内设置围挡；该比例范围下交配产生的受精卵最多，便于后续受精卵的采集，提高采集效率。

2)第二天早上经光刺激后于8-10点拿开围挡，在25-30℃的环境下自然交配，在交配过程中每隔1-2h采集受精卵1次，共收集2-3次；保证受精卵采集的质量和数量。

3)将采集到的受精卵使用胚胎培养液清洗2-3次去除坏卵和杂质，之后置于胚胎培养液中并放入恒温培养箱中，静置控温培养，光照时温度控制在29℃±0.1℃，黑暗时温度控制在27.5℃±0.1℃，并通过光控系统保持光照13h/黑暗11h交替的光照周期；通过该温度和时间的控温控光，胚胎培养效果好，防止胚胎质量不良影响急性毒性实验的准确性。

4)选择处于4-细胞期至128-细胞期的斑马鱼受精卵，鱼卵直径为1-1.5mm，然后加入瓶中，每瓶的加入量为15个，形成胚胎瓶。

进一步地，所述胚胎培养液每毫升最多培养12个胚胎。

根据本发明的一个方面，所述的胚胎培养液主要由5.5mm的nacl、0.18mm的kcl、0.35mm的cacl2、0.35mm的mgso4、0.21mm的mgcl2·6h2o、1.07mm的kh2po3、0.2mm的丙酮酸钠、1.2mm的葡萄糖、2.4mm的半乳糖酸钙、1.7mm的谷胱甘肽、2.3mm的复合维生素和1.6mm的微量元素化合物，余量为水溶液；

所述复合维生素为维生素a、维生素b6、维生素c、维生素m以质量比为0.7:1.3:1:0.3组成的；

所述微量元素化合物为硫酸锌、氯化铁、碘酸钾以质量比为1.1:1.5:0.7组成的。

进一步地，所述水溶液制备方法为:先将2.5v/v％的必需氨基酸和1.2v/v％的非必须氨基酸先后加入到蒸馏水中，以0.5℃/min的速度升温至18℃±0.1℃，升温期间使用超声处理，超声处理20min后得到水溶液；

其中，所述必需氨基酸是由以下氨基酸按浓度配制：l-精氨酸5.23g/l、l-胱氨酸二盐酸盐1.421g/l、l-异亮氨酸2.374g/l、l-亮氨酸2.13g/l、l-赖氨酸盐酸盐2.948g/l、l-蛋氨酸0.586g/l、l-苯丙氨酸1.24g/l、l-苏氨酸2.25g/l、l-色氨酸0.34g/l、l-酪氨酸1.4g/l和l-缬氨酸2.07g/l；

所述非必需氨基酸是由以下氨基酸按浓度配置：l-丙氨酸0.78g/l、l-天冬氨酸1.21g/l、l-谷氨酸1.27g/l、甘氨酸0.69g/l、l-脯氨酸1.12g/l和l-丝氨酸0.97g/l。

根据本发明的一个方面，所述胚胎培养液的制备方法:使用浓度为2.3％的nahco3调节水溶液的ph至7.1-7.3，将水溶液升温至22℃±0.1℃时依次加入5.5mm的nacl、0.18mm的kcl、0.35mm的cacl2、0.35mm的mgso4、0.21mm的mgcl2·6h2o和1.07mm的kh2po3，再将混合液升温至25℃±0.1℃依次加入0.2mm的丙酮酸钠、1.2mm的葡萄糖、1.7mm的谷胱甘肽和2.4mm的半乳糖酸钙，之后继续升温至29.5℃±0.1℃依次加入2.3mm的复合维生素和1.6mm的微量元素化合物，期间以120-140rpm的速度进行三次搅拌，每次搅拌间隔时间为60s，后恒温保持至29.5℃±0.1℃，再使用nacl饱和溶液调节电导率在520-560μs后制成胚胎培养液。该胚胎培养液效果好，能有效的提高胚胎的活性，减少胚胎自然死亡等对急性毒性试验检测准确度的影响，提高检测准确性。

根据本发明的一个方面，所述的待测化学品是将待测物溶解在去离子水中，通过超声助溶制成不同浓度的溶剂，超声间歇时间为29s，总时间为3-5min；所述的对比液为去离子水，所述待测化学品和对比液的温度均控制在29.5℃±0.1℃。

本发明的有益效果是:

(1)本发明试剂盒结构紧凑，操作简便，通过转动的方式进行待测化学品或对比液的切换，便于不同组别的实验，不易混淆，容量大，且控温装置和水浴仓满足实验对温度控制的要求；

(2)本发明将斑马鱼健康胚胎直接进行急性毒性检测，过程简单，易操作，检测效率高，通过对试剂盒制备、胚胎瓶制备和胚胎培养液制备方法进行优化来进一步提高检测准确性；本发明的试剂盒对化学品的急性毒性检测效率高、灵敏度高。

附图说明

图1是本发明试剂盒整体结构示意图。

图2是本发明试剂盒俯视图。

图3是本发明转动盘整体结构示意图。

其中，1-试剂盒、2-培养盒、21-培养皿、22-保温盖、23-水浴仓、24-转动轴、3-中心盒、4-转动盘、5-控温装置、6-控制底座、61-转动轨、62-调节钮、7-培养液瓶、8-胚胎瓶、9-测试板、10-测试孔、11-电池组。

具体实施方式

除非特别指出，否则实施例中使用的原料均是本领域常规使用的或可市售购买的。

实施例1

如图1和2所示，一种可多组实验用的斑马鱼胚胎急性毒性检测试剂盒，包括培养盒2、中心盒3、转动盘4、温控装置5和控制底座6；位于试剂盒1底端的控制底座6，其上顶面环绕有一圈转动轨61，用于带动转动盘4转动，控制底座6的侧面前端设有调节钮62与转动轨61连接，用于控制转动轨61运动；位于控制底座6中心上端的中心盒3呈圆柱状，其内后端依次设有的培养液瓶7和胚胎瓶8用于分别放置胚胎培养液和斑马鱼胚胎，中心盒3内前端的电池组11用于给装置供电；如图3所示，环绕在中心盒3上的转动盘4，等分为四部分，每部分上置有一个孔数相同的测试板9，每孔放置一个测试孔10用于存放待测化学品及对比液；位于转动盘4上端的温控装置5，用于将待测化学品及对比液温度控制在29.5℃±0.1℃；位于中心盒3上端的培养盒2，其通过转动轴24与温控装置5上顶面左端连接进行转动；培养盒2上设有保温盖22，培养盒2内设有培养皿21，培养皿21与培养盒2之间空仓为水浴仓23；转动盘4和温控装置5前端均开有的扇形缺口组成扇形空仓，用于进行试剂添加进培养皿21。设置转动盘4，通过转动的方式便于不同组别的实验，容量大，不易混淆；设置温控装置5可满足添加待测化学品和对比液对温度的要求；通过圆形的设计，将各试剂位置进行合理布置，结构紧凑，容量大，使用方便。

试剂盒的制备：

a.挑选适宜的斑马鱼进行培养，收集斑马鱼胚胎，制成胚胎瓶8，所述的胚胎瓶8制备方法为：

1)选择游动和体色均正常，摄食无异常的8月龄的健康性成熟的斑马鱼，按照雌雄比例为1：1.5的比例放入交配容器内，并在交配容器内设置围挡；该比例范围下交配产生的受精卵最多，便于后续受精卵的采集，提高采集效率。

2)第二天早上经光刺激后于9点拿开围挡，在29.5℃的环境下自然交配，在交配过程中每隔1.5h采集受精卵1次，共收集3次；保证受精卵采集的质量和数量。

3)将采集到的受精卵使用胚胎培养液清洗3次去除坏卵和杂质，之后置于胚胎培养液中并放入恒温培养箱中。

4)选择处于4-细胞期至128-细胞期的斑马鱼受精卵，鱼卵直径为1mm，然后加入瓶中，每瓶的加入量为15个，形成胚胎瓶8。

b.制备胚胎培养液，所述胚胎培养液每毫升最多培养12个胚胎；所述胚胎培养液的制备方法:使用浓度为2.3％的nahco3调节水溶液的ph至7.1，将水溶液升温至22℃±0.1℃时依次加入5.5mm的nacl、0.18mm的kcl、0.35mm的cacl2、0.35mm的mgso4、0.21mm的mgcl2·6h2o和1.07mm的kh2po3，再将混合液升温至25℃±0.1℃依次加入0.2mm的丙酮酸钠、1.2mm的葡萄糖、1.7mm的谷胱甘肽和2.4mm的半乳糖酸钙，之后继续升温至29.5℃±0.1℃加入1.6mm的微量元素化合物，所述微量元素化合物为硫酸锌、氯化铁、碘酸钾以质量比为1.1:1.5:0.7组成的。期间以130rpm的速度进行三次搅拌，每次搅拌间隔时间为60s，后恒温保持至29.5℃±0.1℃，再使用nacl饱和溶液调节电导率在540μs后制成胚胎培养液。该胚胎培养液效果好，能有效的提高胚胎的活性，减少胚胎自然死亡等对急性毒性试验检测准确度的影响，提高检测准确性。

c.制备试剂盒1得到所述的斑马鱼胚胎急性毒性实验的的试剂盒；

利用该试剂盒进行斑马鱼胚胎急性毒性实验：

1)在29.5℃的环境下，将胚胎瓶8中的斑马鱼胚胎用胚胎培养液清洗两遍，随机移取胚胎至1ml胚胎培养液/孔的培养皿21中，每孔12胚胎；

2)将用胚胎培养液配置不同浓度的待测化学品及去离子水分别装入单独的测试板9的测试孔10中，使用巴氏吸管吸去培养皿中胚胎培养液后，迅速加入用胚胎培养液配置不同浓度的待测化学品和去离子水，待测化学品和去离子水的温度均控制在29.5℃±0.1℃。每孔加液1ml，每16h换液一次；

3)将培养皿21放入恒温培养箱内进行培养，然后在48h观察记录斑马鱼胚胎发育的畸形率和死亡率，通过判断和对比来确定待测化学品的急性毒性。

在确定的试验条件下，用斑马鱼作为试验生物测定样品在48小时内引起受试斑马鱼胚胎致死的浓度，观察记录斑马鱼鱼卵是否产生效应，通过判断和对比来确定苯并黄素待测化学品的急性毒性。分成实验组和对照组，其中每组10孔胚胎，对照组是与实验组相同水温、溶解氧等情况相同的水溶液。

待测化学品为苯并黄素，

制备苯并黄素母液：以助溶剂dmso溶解苯并黄素粉末至澄清，用10ml注射器、0.22μm滤器单独过滤两次后，分装至已灭菌的5ml的eppendorf管，标记母液的名称、浓度、配制时间等信息，储存，备用；

制备苯并黄素待测化学品：用胚胎培养液配制不同浓度的苯并黄素待测化学品，要求苯并黄素待测化学品内所含dmso最终浓度为0.1％(v/v)；同时调解ph至7.4，溶解氧浓度不低于4mg/l，且不能过饱和。

苯并黄素待测化学品进行试验浓度为：25μm、50μm、75μm，100μm，150μm，200μm震荡摇匀，现配现用。

鱼卵效应判定，在48h后进行观察，出现以下任意一种情况，表明鱼卵产生效应:

1)卵凝结:肉眼能清楚判别卵凝结。(在显微镜下观察时是不透明的、灰暗的)

2)尾部未脱离:通过倒置式显微镜或体视镜观察到胚胎的尾部会由长度的伸长而从卵黄囊中脱离，若无，则表明尾部未脱离。

3)体节未形成:观察鱼卵是否有体节，48h后，体节仍未形成开始，则认为胚胎已死亡。

4)未能检测出心跳:记录是否检测到心跳。

记录的数据如下：

结论：对照组几乎100％的胚胎正常发育，同时自身发育异常的胚胎出现几率也极低，可忽略不计，说明本发明的试剂盒灵敏度好，可快速的检测出毒性；同时急性毒性检测准确率为98.6％。

实施例2

以实施例1为对比，配制两组组分配比不同的胚胎培养液，具体如表1所示，分别记为比较例1和比较例2:

表1:胚胎培养液组分组成、剂量表

得到的胚胎培养液效果与实施例1有所不同:

使用实施例1的胚胎培养液，结果为:胚胎自然死亡率为1.1％，畸形率为0.6％；

使用比较例1的胚胎培养液，结果为:胚胎自然死亡率为1.4％，畸形率为0.8％；

使用比较例2的胚胎培养液，结果为:胚胎自然死亡率为1.2％，畸形率为0.7％。

结论:应用实施例1的组分配比制备的胚胎培养液相对于比较例1和比较例2来说，胚胎自然死亡率、畸形率显著降低，进而提高了急性毒性检测的准确度。

实施例3

实施例3与实施例1基本相同，所述复合维生素组成成分和比例的不同对检测效果的影响，具体见表2:

表2:复合维生素组成成分和质量比

使用实施例1的复合维生素，结果为:胚胎自然死亡率为1.0％，畸形率为0.5％；

使用比较例3的复合维生素，结果为:胚胎自然死亡率为1.2％，畸形率为0.7％；

使用比较例4的复合维生素，结果为:胚胎自然死亡率为1.1％，畸形率为0.6％。

结论:实施例1的组分配比制备的复合维生素相对于比较例1和比较例2来说，胚胎自然死亡率、畸形率显著降低，进而提高了急性毒性检测的准确度。

实施例4

实施例1中水溶液为经特殊处理的混合溶液，所述水溶液制备方法为:先将2.5v/v％的必需氨基酸和1.2v/v％的非必须氨基酸先后加入到蒸馏水中，以0.5℃/min的速度升温至18℃±0.1℃，升温期间使用超声处理，超声处理20min后得到水溶液；其中，所述必需氨基酸是由以下氨基酸按浓度配制：l-精氨酸5.23g/l、l-胱氨酸二盐酸盐1.421g/l、l-异亮氨酸2.374g/l、l-亮氨酸2.13g/l、l-赖氨酸盐酸盐2.948g/l、l-蛋氨酸0.586g/l、l-苯丙氨酸1.24g/l、l-苏氨酸2.25g/l、l-色氨酸0.34g/l、l-酪氨酸1.4g/l和l-缬氨酸2.07g/l；所述非必需氨基酸是由以下氨基酸按浓度配置：l-丙氨酸0.78g/l、l-天冬氨酸1.21g/l、l-谷氨酸1.27g/l、甘氨酸0.69g/l、l-脯氨酸1.12g/l和l-丝氨酸0.97g/l。

结果为:胚胎自然死亡率为0.9％，畸形率为0.4％；

使用蒸馏水替代水溶液作为对照，结果为:胚胎自然死亡率为2.1％，畸形率为1.2％。

结论:通过对比，使用本发明的水溶液作为胚胎培养液的溶剂，胚胎自然死亡率、畸形率显著降低，进而提高了急性毒性检测的准确度。

实施例5

将实施例1的待测化学品加入去离子水震荡摇匀进一步通过超声助溶制成的溶剂，超声间歇时间为29s，总时间为3-5min。

结果为:急性毒性检测准确率为98.9％。

使用传统搅拌，结果为:急性毒性检测准确率为98.7％。

结论:进行对比，将待测化学品进行上述处理之后，急性毒性检测更加准确。

实施例6

将实施例1中胚胎瓶8制备中受精卵培养通过静置控温培养，光照时温度控制在29℃±0.1℃，黑暗时温度控制在27.5℃±0.1℃，并通过光控系统保持光照13h/黑暗11h交替的光照周期。

表3：不同温度对急性毒性测定影响

结论:当光照时温度控制在29℃±0.1℃，黑暗时温度控制在27.5℃±0.1℃，胚胎自然死亡率最低，进而急性毒性检测的准确率最高；当温度高于或低于光照时温度29℃±0.1℃和黑暗时温度27.5℃±0.1℃时，胚胎自然死亡率显著提升。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。