本发明属于生物提取技术领域，具体涉及一种水山药中多酚氧化酶的提取工艺。
背景技术
山药（dioscoreabatatas）又名淮山药，性平味甘，食之补而不腻，是薯蓣科多年生单子叶缠绕性草本质藤本植物薯蓣的块茎，主要分布在热带、亚热带地区，是世界上重要的十大食用块茎根类植物之一，产量仅次于马铃薯、木薯和薯。我国大约有90多个山药品种，在南方、西北、西南等地区种植普遍，资源丰富。山药中含有大量的蛋白质、各种维生素、有益的微量元素、粘质多糖等，是营养价值很高的食品，经常食用还可以强身健体，具有调节人体消化系统、益肺止咳、健脾固肾等及医疗保健作用。然而，山药在加工、贮藏和销售过程中很容易发生褐变，引起色泽、风味和质地的变化，从而影响其商业价值。
多酚氧化酶（polyphenoloxidase，简称ppo，e.c.1.10.3.1），又称儿茶酚氧化酶、酪氨酸酶或儿茶酚酶，是一种自然界普遍存在的氧化还原酶，广泛存在于各类果蔬中，是一种核基因编码的铜金属酶。这种酶在有氧条件下能氧化果蔬组织中内源性酚类物质形成邻醌，邻醌再相互聚合导致果蔬褐变，已成为影响肉质颜色较浅水果、蔬菜深加工品质的关键因素。山药的收获季节比较集中，产量高、水分含量大、皮薄柔嫩，易受损伤。在加工和储藏过程中，组织中的多酚类物质在多酚氧化酶（ppo）的催化作用下很容易发生褐变，造成山药加工能力变弱、产品销路受限、产业附加值低等诸多问题。因此，解决山药加工和贮藏过程中的褐变问题，对提高山药的商品价值具有重要的现实意义。因此，有必要提出有效的技术方案，解决上述问题。
技术实现要素：
本发明针对上述现有技术的不足，提供一种可达到电泳纯的水山药中多酚氧化酶的提取工艺。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种水山药中多酚氧化酶的提取工艺，步骤包括：
（1）取新鲜水山药加入ph6.0的磷酸缓冲液，再加入纤维素酶、pvpp、tritonx-100和peg6000后匀浆，浸提2-6h，然后冷冻离心，收集上清液即为山药多酚氧化酶粗酶液；
每克新鲜水山药配置1-1.2毫升磷酸缓冲液；
每克新鲜水山药配置0.01-0.015克纤维素酶；
每克新鲜水山药配置0.02-0.03毫克pvpp；
每克新鲜水山药配置0.01-0.02毫克tritonx-100；
每克新鲜水山药配置0.01-0.03毫克peg6000；
（2）将多酚氧化酶粗酶液置于冰浴中，缓慢加入一定量的硫酸铵，至30%的饱和度，冰浴下静置24h后，将溶液进行离心30min，去沉淀留上清液；继续加入硫酸铵至80%的饱和度，进行二次沉淀分离，冰浴静置24h后离心收集沉淀；将沉淀经透析处理后，转移到超滤离心管中进行离心，截留分子量大于10kda的粗酶液，最后经纯化后得到多酚氧化酶提取物。
优选地，步骤（1）中所述浸提具体条件为：在冰浴下浸提2-3h后，再升温至30℃浸提2-3h。
优选地，步骤（2）中所述硫酸铵分级沉淀具体条件为：将多酚氧化酶粗酶液置于冰浴中，缓慢加入硫酸铵至30%的饱和度，冰浴下静置20-24h后，将溶液进行离心，去沉淀留上清液；向上清液中加入硫酸铵至80%的饱和度，进行二次沉淀分离，冰浴静置20-24h后离心收集沉淀。
优选地，所述纯化为通过deae-sepharosefastflow柱（xk16/10柱）对超滤后的粗酶液进行纯化。
优选地，所述纯化为经过sephadexg-75柱对超滤后的粗酶液进行纯化。
有益效果：本申请以极易产生褐变的水山药为材料，提取并纯化山药中的多酚氧化酶。本发明通过提取液提取、硫酸铵沉淀、透析等手段对山药多酚氧化酶进行粗提取，再通过离子交换柱、凝胶柱分离等方式对来自山药的多酚氧化酶进行纯化，结果表明山药多酚氧化酶的分子量约为32kda，达到了电泳纯。
附图说明
图1为本发明水山药多酚氧化酶粗酶液经过deae-sepharosefastflow离子柱交换层析洗脱图谱（280nm的吸光度和酶活性）。
图2为本发明水山药多酚氧化酶粗酶液经过sephadexg-75柱进行凝胶过滤层析洗脱图谱（280nm的吸光度和酶活性）。
图3为本发明山药不同分离提取阶段的非变性凝胶电泳和纯化多酚氧化酶酶的变性凝胶电泳图（泳道1：标准蛋白marker；泳道2：提取第一步得到的粗酶非变性电泳；泳道3：30-80%硫酸铵盐析后粗酶液非变性电泳；泳道4：磷酸缓冲液透析后粗酶液非变性电泳；泳道5：超滤后粗酶液非变性电泳；泳道6：deae柱洗脱液变性电泳；泳道7：superdexg-75洗脱液变性电泳）。
图4为本发明水山药的提取、分离及纯化流程图。
具体实施方式
材料与试剂
水山药（dioscoreaalata），烟台惠安市场；
tritonx-100、聚乙二醇6000（peg6000）、聚乙烯聚吡咯烷酮（pvpp），北京solarbio科技有限公司；
植酸，天津市光厦精细化工研究所；
邻苯二酚、间苯二酚，天津市北辰方正试剂厂；
间苯三酚，成都市科隆化学品有限公司；
焦性没食子酸，天津市北联精细化学品开发有限公司；
l-半胱氨酸，天津市博迪化工股份有限公司；
抗坏血酸，天津市大茂化学试剂厂；
其他试剂均为分析纯及以上。
实施例1
一种水山药中多酚氧化酶的提取工艺，步骤包括：
（1）化学药品粗提多酚氧化酶
取500g新鲜水山药样品，加入500ml4℃冰箱预冷的磷酸缓冲液（0.1mol/l、ph6.0），再加入5g纤维素酶、10mgpvpp、5mgtritonx-100（浓度是0.5％）和8mgpeg6000（浓度是0.34％）后匀浆2~3min，在冰浴下浸提2h后，再升温至30℃浸提2h，然后冷冻离心（10000r/min，20min），收集上清液即为山药多酚氧化酶粗酶液。
（2）硫酸铵分级沉淀
将多酚氧化酶粗酶液置于冰浴中，缓慢加入一定量的硫酸铵，至30%的饱和度，冰浴下静置24h后，将溶液进行离心（4℃、12000r/min、30min），去沉淀留上清液备用；继续加入硫酸铵至80%的饱和度，进行二次沉淀分离，冰浴静置24h后离心收集沉淀。
通过多酚氧化酶比活性分析，得到饱和度为30％~80％的粗提物。
（3）透析处理
将经过硫酸铵处理的粗酶液放入透析袋（1/2）中，在超纯水中透析3次，每次间隔3~5h；然后用0.1mol/l磷酸缓冲液（ph6.0）透析两次，每次间隔8h。
（4）超滤
将透析处理的粗酶液转移到超滤离心管中进行离心（5000r/15min），截留分子量大于10kda的粗酶液备用。
（5）多酚氧化酶提取物的纯化
通过deae-sepharosefastflow柱（xk16/10柱）对超滤后的粗酶液进行纯化。该柱用0.05mol/l磷酸缓冲液（ph6.0）和1mol/lnacl进行线性梯度洗脱至平衡，洗脱速度为5.0ml/min，设置收集体积5ml/管。收集洗脱峰相对应的样品测定其多酚氧化酶酶活及蛋白含量，将有活性的样品超滤备用。
山药多酚氧化酶粗酶液经过deae-sepharosefastflow离子柱交换层析，洗脱曲线如图1所示。通过比较多酚氧化酶酶活与蛋白含量曲线可以看出，用nacl梯度洗脱后得到了4个蛋白峰。其中第一和第四个峰为杂蛋白，没有蛋白活性，中间两个峰对应的多酚氧化酶活性较高。馏分10～28管和28～47管，特别是17馏分具有较高的酶活性，因此收集中间两个峰对应的洗脱液。
本申请通过纤维素酶、pvpp、tritonx-100和peg6000的协同提取是尤其重要的，具体是使用温度、用量、使用时间改变了体系作用关系，可有效得到高活性多酚氧化酶。
实施例2
一种水山药中多酚氧化酶的提取工艺，步骤同实施例1，不同之处仅在于多酚氧化酶提取物的纯化。实施例2中首先使用0.5mol/lnaoh溶液冲洗活化sephadexg-75柱，随后使用去离子水冲洗，使用150mmol/l的nacl进行平衡和洗脱。洗脱流速设置为2.0ml/min，收集体积设置为5ml/管。将上述超滤后的多酚氧化酶用磷酸缓冲液溶解，每次上样2ml，收集洗脱峰对应的样品并测定其多酚氧化酶酶活及分子量。并将得到的多酚氧化酶样品放置在-20℃环境下储存。
超滤后加到sephadexg-75柱进行凝胶过滤层析纯化，洗脱结果如图2所示。由图可以看出，在280nm处，第一峰和最后峰的吸光度很低，没有活性，而中间的第二峰（32-61管）表现出高活性，收集这些馏分以确定多酚氧化酶纯度。
实施例1和实施例2的水山药的提取、分离及纯化流程图如图4所示。
表1为实施例1和实施例2中水山药的分离纯化结果。
表1水山药的分离纯化结果表
从山药中纯化多酚氧化酶的结果如表1所示。通过deae-sepharosefastflow柱（xk16/10柱）对超滤后的粗酶液进行纯化，将山药多酚氧化酶成功纯化至3.21纯化倍数。凝胶过滤层析suxdexg-75后，纯化倍数由3.21提高到4.58，回收率为3.54u／100u。
凝胶电泳法测定多酚氧化酶分子量
提取和纯化多酚氧化酶的分子量采用native-page和sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳测定。采用tanon系列数码凝胶图像分析系统和eps数显稳压稳流电泳仪使用5%浓缩凝胶和12%分离凝胶进行跑胶（solarbiop1200）。
蛋白质样品溶液在100℃水浴中加热5分钟，在4×native-page或4×sds-page上样缓冲液（solarbiop1015，带dtt）中加热。并在浓缩胶中以80v电泳40min，分离胶中以100v进行电泳70min，然后取出凝胶用考马斯亮蓝g-250染色4h，随后在含10%乙酸溶液和甲醇的洗脱液中进行脱色直到蛋白区带清晰，最后用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离，进而计算出蛋白的分子量。已知mark分子量为10kda、17kda、26kda、34kda、43kda、55kda、72kda、95kda、130kda和180kda的蛋白质。
山药不同提取阶段的非变性凝胶电泳和纯化多酚氧化酶酶的变性凝胶电泳图谱如图3所示，样品来源于6个分离纯化步骤：提取液提取的上清液、30-80%硫酸铵盐析后的样品、磷酸盐透析样品、10kda超滤膜超滤后样品、deae离子交换柱洗脱收集的酶液、superdexg-75柱洗脱下来的酶液。其中从deae柱洗脱下来的液体因具有较高的盐浓度，需要经过透析后再进行蛋白电泳分析。从superdexg-75柱洗脱下来的收集液中，蛋白含量低，需要冷冻干燥后，再使用缓冲液溶解，经过前处理进行sds-page分析。本实验在未纯化前，样品进行了native-page分析。经离子交换柱分离纯化后，样品进行sds-page分析。根据每一步电泳图谱的变化，可以很好地了解分离纯化过程蛋白数量的变化。
透析处理对硫酸铵盐析后粗酶液进行了除盐处理，只是浓度变小了，因此泳道3和4的图谱相似，超滤浓缩后，蛋白浓度变大了，因此泳道3、4、5的图谱都相似。第一步泳道2和后面的3、4、5比也是三个条带，与标准分子量蛋白比，计算各蛋白的迁移率，3个条带分子量大约为32kda、13kda和11.5kda。泳道6只剩2个条带，说明deae离子交换柱除去了11.5kda的杂蛋白，泳道7出现的单一条带说明，整个实验最后得到了纯度很高的酶，已经达到电泳纯。由变性电泳sds-page可知，多酚氧化酶酶蛋白的分子量约为32kda。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。