本发明属于生物催化领域，涉及一种酶法制备β-羟基-β-甲基丁酸的方法，具体地说，涉及一种糖多孢红霉菌细胞色素p450氧化酶突变体及其在制备β-羟基-β-甲基丁酸中的用途。
背景技术
β-羟基-β-甲基丁酸(3-hydroxy-3-methylbutyratehydrate，hmb)是无色晶体，分子式为c5h10o3，结构式为：
hmb的钙盐是一种营养补剂，可以在运动员耐力训练中防止肌肉损伤、肌蛋白断裂，也可作为减肥食品的有效成分；可促进动物生长、减少脂肪、增加瘦肉，保证动物健康。该化合物在1995年通过美国gras认证，推荐使用量≤3g/天，市场潜力巨大。
在人和动物体内的天然代谢途径中，β-羟基-β-甲基丁酸可经由支链氨基酸代谢途径中的亮氨酸(leucine)降解的中间产物α-kic(α-ketosiocaproate)生成(miyazaki,t.,a.,etal.springerplus,4(1):494.)。目前hmb主要依赖化学合成法进行制备，例如主要是以次氯酸钠、二丙酮醇、盐酸、乙酸乙酯、乙醇、氢氧化钙为反应原料，经过氧化合成、酸化、萃取、中和反应、离心、干燥等步骤制得。但是，化学合成法存在着有机溶剂、腐蚀性酸等试剂使用量大、废料污染严重等无法克服的缺陷，使得化学合成法受到环境保护政策的严重管控和限制，承受着巨大的环保压力。
近些年来，寻找绿色环保的hmb制备途径已经成为研究热点，相对应的生物合成法日益受到业内青睐。目前研究得hmb生物法主要是利用galactomycesreessii菌体细胞发酵、同步流加底物β-甲基丁酸进行生物催化来制备hmb(lee,i.y.andj.p.n.rosazza.archivesofmicrobiology.1998,169(3):257-262.lee,i.y.,s.l.nissenandj.p.rosazza.appliedandenvironmentalmicrobiology.1997,63(11):4191-4195.)。但是，该方法存在反应产物组分复杂、后期分离纯化困难等问题。
目前还未有利用单一原料为底物、通过一步酶催化来制备hmb的方法。这成为本发明要实现的目标。
技术实现要素：
为了寻找催化效率高、产物后处理更容易的生物催化法来制备hmb，本发明选择以糖多孢红霉菌(saccharopolysporaerythraea)来源的细胞色素p450氧化酶eryk作为研究目标。该酶eryk的天然功能为：在氧气参与下，以nadph为辅因子，催化底物红霉素d(erythromycind)分子的甲基碳原子c-12发生羟基化反应(zhang,h.,y.wang,j.wu,k.skalinaandb.a.pfeifer.chemistry&biology.2010,17(11):1232-1240.)。细胞色素p450氧化酶又称为p450酶、单加氧酶、多功能氧化酶、羟化酶。本发明的研究对象为来源于糖多孢红霉菌的p450氧化酶eryk，其氨基酸序列为seqidno:1，选用的编码基因为seqidno:2。以eryk为基础，通过易错pcr的方法建立eryk基因突变库，再通过筛选基因突变库获得活力明显提高的p450氧化酶。
因此，本发明的一个目的在于提供一种p450氧化酶，其氨基酸序列为seqidno:3：
mttidevpgmadetalldwlgtmrekqpvwqdrygvwhvfrharvqtvlrdtatfssdptrviegasptpgmiheidppehralrrvvssaftprtisdleprirdvtrslladagesfdlvdvlafplpvtivaellglppmdhkqfgdwsgalvdilmddptdpalaeriadvlnpltaylkarcaerradpgddlisrlvlaevdgralddeeaanfstalllaghitttvllgnivrtldehpahwdaaaedpgripaiveevlryrppfpqmqrtttkatevagvpipadvmvntwvlsanrdsdahddpdrfdpsrksggaaqlsfghgvhfckgaplarlenrvaleeiiarfgrltvdrdderlrhfeqivlgtrhlpvlagssprqsa(seqidno:3)。
本发明的第二个目的在于提供编码上述p450氧化酶的基因。
优选地，上述基因的碱基序列为seqidno:4：
atgaccaccattgatgaagtgccgggtatggcagacgaaacagcactgctggattggctgggcaccatgcgtgagaagcaaccggtttggcaagatcgttatggtgtgtggcacgtttttcgccatgcccgtgttcagaccgtgctgcgtgacacagccaccttcagcagcgatccgacacgtgttattgaaggtgcaagccctaccccgggtatgattcatgagattgaccctccggaacatcgcgctttacgtcgagtggtgagcagcgcctttaccccgcgtaccattagcgatctggaaccgcgcattcgcgatgttacccgcagcttactggcagacgccggtgagagcttcgatctggttgatgttctggcctttccgctgccggttaccattgtggccgaactgctgggtttacctccgatggatcataaacagttcggcgattggagtggtgcactggtggacatcctgatggatgatccgaccgatccggcactggccgaacgcattgcagatgtgctgaatccgctgaccgcctatctgaaagcacgttgtgcagaacgtcgtgccgatcccggtgatgatttaattagccgtttagtgctggcagaagtggatggtcgtgctttagatgatgaggaagcagcaaacttcagcaccgctttactgctggccggtcatatcaccaccaccgttctgctgggcaatattgttcgcactttagatgagcatccggcacattgggatgcagccgccgaagatccgggtcgcattcccgctattgtggaagaagtgctgcgctaccgtccgcctttcccgcagatgcagcgcaccaccaccaaagccaccgaggttgccggcgttccgattccggccgacgtgatggttaacacttgggtgctgagtgcaaaccgcgacagcgatgcccatgatgatccggaccgctttgatccgagtcgcaaaagtggtggtgcagcccagctgagctttggccatggtgtgcatttctgtaaaggtgcaccgctggcacgtctggagaatcgcgtggctttagaagagattatcgcccgttttggtcgcttaaccgtggatcgcgatgatgagcgtctgcgccacttcgaacagattgttctgggtacccgtcatctgccggtgctggctggtagtagcccgcgccagagtgcttga(seqidno:4)。
本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。
本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。
优选地，上述微生物选自大肠杆菌、酵母、枯草杆菌。更优选大肠杆菌bl21(de3)。
本发明的第五个目的在于提供上述p450氧化酶或表达微生物在生产β-羟基-β-甲基丁酸中的用途。
在一种实施方式中，上述用途是以β-甲基丁酸为底物原料，通过羟基化反应来生产β-羟基-β-甲基丁酸。
优选地，上述的酶催化反应在ph7.4，温度37℃下进行。
本发明构建的p450氧化酶突变体seqidno:3明显提高了羟基化反应催化活力，可高效率地催化底物β-甲基丁酸生成hmb，该酶催化反应条件温和，产物后处理容易，大大减少有机溶剂的使用量，具备工业化应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
本文的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-25℃)。
作为构建p450氧化酶eryk突变体的基础模板，来源于糖多孢红霉菌的野生型p450氧化酶eryk的氨基酸序列为seqidno:1：
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编码野生型eryk的基因序列为seqidno:2：
atgaccaccattgatgaagtgccgggtatggcagacgaaacagcactgctggattggctgggcaccatgcgtgagaagcaaccggtttggcaagatcgttatggtgtgtggcacgtttttcgccatgccgatgttcagaccgtgctgcgtgacacagccaccttcagcagcgatccgacacgtgttattgaaggtgcaagccctaccccgggtatgattcatgagattgaccctccggaacatcgcgctttacgtaaagtggtgagcagcgcctttaccccgcgtaccattagcgatctggaaccgcgcattcgcgatgttacccgcagcttactggcagacgccggtgagagcttcgatctggttgatgttctggcctttccgctgccggttaccattgtggccgaactgctgggtttacctccgatggatcatgaacagttcggcgattggagtggtgcactggtggacatccagatggatgatccgaccgatccggcactggccgaacgcattgcagatgtgctgaatccgctgaccgcctatctgaaagcacgttgtgcagaacgtcgtgccgatcccggtgatgatttaattagccgtttagtgctggcagaagtggatggtcgtgctttagatgatgaggaagcagcaaacttcagcaccgctttactgctggccggtcatatcaccaccaccgttctgctgggcaatattgttcgcactttagatgagcatccggcacattgggatgcagccgccgaagatccgggtcgcattcccgctattgtggaagaagtgctgcgctaccgtccgcctttcccgcagatgcagcgcaccaccaccaaagccaccgaggttgccggcgttccgattccggccgacgtgatggttaacacttgggtgctgagtgcaaaccgcgacagcgatgcccatgatgatccggaccgctttgatccgagtcgcaaaagtggtggtgcagcccagctgagctttggccatggtgtgcatttctgtttaggtgcaccgctggcacgtctggagaatcgcgtggctttagaagagattatcgcccgttttggtcgcttaaccgtggatcgcgatgatgagcgtctgcgccacttcgaacagattgttctgggtacccgtcatctgccggtgctggctggtagtagcccgcgccagagtgcttga(seqidno:2)。
为了获得酶活性更高的p450氧化酶突变体，本发明对野生型p450氧化酶eryk的基因序列seqidno:2进行点突变。通过易错pcr技术获得一个或多个氨基酸位点取代的突变体氨基酸序列，筛选出8个可提高酶活力的位点，然后以定点组合突变的方式，获得一株酶活力明显提高的突变体。
在本文中，“p450酶”可简称为“p450氧化酶”、“氧化酶eryk”或者“eryk”。
在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指未经基因工程改造的p450氧化酶eryk(seqidno:1)。
本发明的eryk突变体(seqidno:3)由于氨基酸序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
上述转化体宿主可以是任何适合表达p450氧化酶突变体的微生物，括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者枯草杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌bl21(de3)。
当作为生物催化剂用于生产β-羟基-β-甲基丁酸时，本发明的p450氧化酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。
本发明的p450氧化酶的分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。
实施例
材料和方法
本文中的全基因合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成；表达载体由浙江华睿生物技术有限公司亚克隆制备。引物合成及测序皆由生工生物工程上海股份有限公司完成。
本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
pcr扩增实验根据质粒或dna模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
1.β-羟基-β-甲基丁酸含量测定方法：采用高效液相色谱hplc测定产物中β-羟基-β-甲基丁酸含量，色谱柱为岛津sb-aq柱，流动相a浓度0.3％的磷酸，流动相b为乙腈，流动相比例a:b＝80:20，柱温40℃，检测波长215nm，检测时长8min，保留时间为4.08min。
2.p450氧化酶酶活力测定
p450氧化酶酶活力测定体系：包含5％的eryk细胞，0.8μmnadph-p450还原酶，β-甲基丁酸40μm，100mmk2hpo3(ph7.4)，nadph再生系统(0.5mmnadp+，10mm葡萄糖6磷酸，1iu/ml的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)。
酶活定义：在ph7.4、温度37℃条件下，每分钟催化β-甲基丁酸产生1微摩尔(μmol)hmb所需要的酶量定义为1个单位(u)。
3.培养基
发酵培养基：蛋白胨20g/l，酵母浸粉5g/l，甘油4.0ml/l，反丁烯二酸(富马酸)2g/l，磷酸二氢钾1g/l，nh4no38g/l，氨水调节ph至7.5，121℃灭菌20min。
lb培养基：10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/l氯化钠，ph7.2，121℃高温灭菌20min。(固体培养基另加20g/l琼脂粉)。
tb培养基：24g/l酵母提取物、12g/l胰蛋白胨、16.43g/lk2hpo4.3h2o、2.31g/lkh2po4、5g/l甘油，ph7.0-7.5，121℃高温灭菌20min。
20x电转母液：80g/l甘氨酸，2％吐温80。
实施例1p450氧化酶基因工程菌构建
1.1通过全基因序列合成序列seqidno:2，两端设计酶切位点ndei和bamhi，克隆到psh质粒上相应位点，得到重组质粒psh-eryk，然后用电转化法转化入大肠杆菌表达宿主bl21(de3)感受态细胞中，涂含卡那霉素的lb培养基平板，37℃培养过夜，挑选单菌落，接种到含有lb培养基的试管中，培养过夜，离心收集菌体，抽提质粒，基因测序确定正确，得到表达野生型eryk的重组基因工程菌株bl21(de3)/psh-eryk。
氨基酸序列测定为seqidno:1。
1.2从含有eryk工程菌种的平板挑选单克隆，接种到5mllb培养基中，37℃培养过；1％v/v接种到含有100ml发酵培养基的1000ml摇瓶中培养4-6小时，od600达到1.2-1.5，加入0.2mm的iptg诱导，降温到25℃培养10-16小时，离心获得菌体，-80℃冻存24小时备用。
实施例2易错pcr法构建eryk随机突变点库
以seqidno:2为模板，应用易错pcr技术构建随机突变体库。
正向引物eryk-nde-f：5’-catatgaccaccattgatgaagtgccggg-3’，
反向引物eryk-bam-r：5’-ggatcctcaagcactctggcgcgggctacta-3’。
50μl易错pcr反应体系包括：50ng质粒模板psh-eryk，30pmol一对引物eryk-nde-f和eryk-bam-r，1xtaqbuffer，0.2mmdgtp，0.2mmdatp，1mmdctp，1mmdttp，7mmmgcl2，(0mm、0.05mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm)mncl2，2.5个单位的taq酶(fermentas)。pcr反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp；30个循环；72℃10min。胶回收2.0kb随机突变片段作为大引物，用kod-plusdna聚合酶做megaprimerpcr：94℃5min，；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃10min。dpni消化质粒模板，电转化大肠杆菌e.colibl21(de3)，得到超过104个克隆的随机突变库。
实施例3eryk突变体库的高通量筛选
3.1选取eryk突变体库中的转化子接种到含700μllb培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含100μg/ml卡那霉素，37℃培养6h后，加入终浓度0.1mmiptg后，降温至25℃，培养过夜。5000rpm离心10min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。加入200μl含0.1m磷酸钾盐缓冲液(ph7.4)，重悬菌体，用于eryk酶活力测定。
3.2试剂配制：
底物反应液：加入10g/l的β-甲基丁酸，用naoh调节ph，使其溶解。
终止反应液：0.5ml的1m的naoh溶液。
3.3反应过程：
在上述步骤3.1中的80μl菌体液(即酶液)中加入80μl底物反应液，在37℃的条件下反应2h，加入40μl终止反应液，然后5000rpm离心10min。离心取上清，用hplc检测β-羟基-β-甲基丁酸含量，计算eryk酶活力。
在随机突变库，通过对约1000个突变体克隆筛选，结果如表1中突变体对β-甲基丁酸的酶活。
3.4高酶活突变体的测定和筛选
按照前述方法，对各个eryk突变体的酶活力，进行重复筛选和测定。
在随机突变库，通过对约1000个突变体克隆筛选，筛选出8个可提高eryk酶活力的位点，结果如表1所示。
表1.部分eryk突变体的酶活力比较
*酶比活力：以野生酶的酶活力(u/ml)与菌体浓度od(od/ml)的比值为100％。
其中编号为eryk-1025的突变体(d44r,k86r,e146k,q159l,l340k)的酶活力相对于野生型eryk提高了约3.5倍。
突变体eryk-1025的氨基酸序列为seqidno:3。
实施例4高酶活基因工程菌的构建
将突变体eryk-1025的编码基因seqidno:4按照实施例1中的方法克隆到psh质粒中，得到重组质粒psh-eryk-1025，然后用电转化法转化入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，涂含卡那霉素的lb培养基平板，37℃培养过夜，挑选10个单菌落，接种到含有lb培养基的试管中，培养过夜，离心收集菌体，抽提质粒，基因测序确定突变正确，得到重组菌株。
本领域技术人员应当理解，包括seqidno:4在内的突变体eryk-1025编码基因、也可在枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母中表达，表达宿主不限于大肠杆菌。
实施例5野生型eryk和突变体eryk-1025菌株的发酵
分别从表达野生型eryk和表达突变体eryk-1025的基因工程菌种的平板上挑选单克隆，接种到5mllb培养基中，37℃培养过；1％v/v接种到含有100mltb培养基的1000ml摇瓶中培养4-6小时，od达到1.2-1.5后，加入0.2mm的iptg诱导，降温到25℃培养10-16小时，离心获得菌体，-80℃冻存24小时备用。
实施例6突变酶eryk-1025催化β-甲基丁酸生成hmb
反应体系200ml，底物β-甲基丁酸浓度为10g/l，加酶量分别为2000、4000、6000、8000、10000u/g底物。控制37℃，200rpm，ph7.4，反应24h。测定hmb生成量，计算底物转化率，结果列于表2中。
表2.不同加酶量突变酶eryk-1025催化β-甲基丁酸制备hmb
上述实施例对本发明的p450氧化酶eryk突变体生产β-羟基-β-甲基丁酸的工艺进行了验证，相关的工艺条件可以进一步优化。本领域的技术人员应理解，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员可以在此基础上做出各种改动或者修改，所做的各种变形或者修改的等价形式，同样应属于本发明的范围。
另外，需说明的是，本说明书中对先前公开的文献的列举和论述不应视为承认该文献是现有技术或者是公知常识。
序列表
<110>浙江华睿生物技术有限公司
<120>一种酶法制备β-羟基-β-甲基丁酸的方法
<130>shpi1811136
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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