一种检测次氯酸的荧光探针及其合成方法和应用与流程

本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种检测次氯酸的荧光探针。

背景技术：

活性氧（ros）是生物体内在很多生理和病理过程起着非常重要作用的一些含氧自由基（羟基自由基和超氧阴离子自由基等）和非自由基（过氧化氢和次氯酸等）的总称。生物体内在氧化应激、炎症等生理和病理情况下通过酶促和非酶促反应产生各种ros。次氯酸（hclo），是弱酸性的(pka=7.53)活性氧。日常生活中，由于次氯酸强的氧化性，被广泛用于漂白剂和消毒剂。在生理条件下，次氯酸可解离出次氯酸根（ocl^-）来完成抗菌消炎的生理防御功能。然而，当次氯酸浓度激增或者内生部位发生错乱时，可能导致组织损伤和疾病，包括心血管疾病、神经元变性、关节炎。因此，在生命系统中，检测次氯酸是非常必要的。

hclo因其浓度变化较快，检测次氯酸的荧光探针需要一定的响应速度,以达到对生物体系次氯酸进行实时检测的目的。生物体内存在大量的不同类型的氧化剂（如，超氧自由基，羟基自由基，过氧化氢，单线态氧等），在其他干扰离子或分子存在的条件下，专一性的对体内次氯酸进行识别，需要探针分子具有较好的抗干扰性。然而目前现有的次氯酸探针在生物体内的选择专一性不是很好，因此构建高效、高选择性、高灵敏性和短时间响应的检测次氯酸的方法是人们目前亟待解决的问题。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测次氯酸的荧光探针，该探针选择性好、响应时间短。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单、收率高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测次氯酸的荧光探针，简称为cr-hclo，其结构式如式（i）所示：

式（i）。

一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

（1）玫瑰红b溶于乙醇中，依次加入过量的nh2oh-hcl和naoh水溶液，加热回流反应，产物分离纯化得到化合物1：

；

（2）在氮气保护下，7-二乙胺基香豆素-3-羧酸、n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edci）在dmf中常温反应，产物分离纯化得化合物2：

；

（3）化合物1与化合物2溶于二氯甲烷中，在三乙胺存在下常温反应，产物分离纯化得荧光探针：

。

步骤（1）中，反应温度为80℃。步骤（2）中，反应时间为12h。步骤（3）中，反应时间为3-4h。

步骤（1）中，所述分离纯化步骤为：产物用二氯甲烷萃取，萃取液经水洗，干燥后除去溶剂，得到粗产品；粗产品用二氯甲烷溶解，再以甲醇/二氯甲烷=1:20（v/v）为洗脱剂，用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目。

步骤（2）中，所述分离纯化步骤为：反应液倒入冰水中，将析出的固体过滤，水洗，干燥后得到粗产品；粗产品用二氯甲烷溶解，再以甲醇/二氯甲烷=1:50（v/v）为洗脱剂，用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目。

步骤（3）中，所述分离纯化步骤为：将反应液除去溶剂，得粗产品；粗产品用二氯甲烷溶解，再以甲醇/二氯甲烷=1:50（v/v）为洗脱剂，用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目。

上述荧光探针在荧光检测水溶液与细胞中次氯酸的应用。

本荧光探针的荧光机理如下：

在未加入次氯酸前，探针cr-hclo由于罗丹明的闭环结构，未能形成推拉电子体系，未能发出红色荧光，随着次氯酸的加入，次氯酸根进攻罗丹明的位点，导致罗丹明开环，形成强烈的推拉电子体系，发出强烈的红色荧光。本发明的有益效果为：

本发明所述的检测次氯酸的荧光探针，检测速度快，选择性好，抗其他分子干扰能力强。此外，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。本发明的荧光探针的合成只需要几步就可以完成，且后处理过程相对简单。该荧光探针可作为显示水溶液中和生物细胞内次氯酸分子的专一性指示剂，可进行实时的目视比色法检测，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是探针cr-hclo的¹hnmr图谱；

图2是探针cr-hclo随次氯酸钠的加入荧光谱图的变化情况；

图3是探针cr-hclo对不同离子和分子的选择性荧光谱图；

图4是探针cr-hclo对不同离子和分子的选择性柱状图；

图5是探针cr-hclo溶液在次氯酸钠加入前后溶液颜色；

图6是探针cr-hclo溶液在次氯酸钠加入前后紫外灯下荧光颜色；

图7是探针cr-hclo应用与细胞中对外源性hclo进行荧光成像；

图8是探针cr-hclo应用与细胞中对内源性hclo进行荧光成像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1cr-hclo荧光探针的合成

（1）化合物1的合成：

；

将玫瑰红b（1.0g,2.25mmol,1eq）溶于10ml无水乙醇中，分别加入nh2oh-hcl(1.56g,22.5mmol,10eq)，naoh(900mg,22.5mmol,10eq)水溶液，加热回流,反应温度80℃，用tcl板检测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取，水洗，真空干燥，减压旋干，得到粗产品。用二氯甲烷溶解，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷=1:20。分离得到化合物1，产率89%；

（2）化合物2的合成：

；

将7-二乙胺基香豆素-3-羧酸（940mg，3.76mmol，1eq）溶于5mldmf中，然后依次加入n-羟基琥珀酰亚胺（432.4mg，3.76mmol，1eq）edci（793mg，4.14mmol，1.1eq），常温反应12h。用tcl板检测反应，反应完全后，将反应液倒入100ml冰水中，有固体析出，减压过滤，水洗，真空干燥，得到粗产品。用二氯甲烷溶解，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为甲醇/二氯甲烷=1:50，产率为75%；

（3）化合物cr-hclo的合成：

；

化合物1（50mg，0.112mmol,1eq）与化合物2（40g，0.112mmol,1eq）溶于3ml二氯甲烷中，滴加两滴三乙胺，常温反应3-4h。用tcl板检测反应，反应完全后，将反应液减压旋干溶剂，得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/甲醇=1:50，产率为70%，其¹hnmr图谱如图1所示。

实施例2荧光探针cr-hclo随次氯酸钠加入荧光的变化

取实施例1制备的cr-hclo荧光探针溶于n，n-二甲基甲酰胺（dmf）中，制成1mmol/l储备液。从储备液中取出30μl加入到5ml的离心管当中，加入不同当量（0-60eq）的naclo标准溶液，用pbs缓冲溶液（0.1mol/l，ph=7.5）与dmf体积比为1:1的溶液稀释至3ml，测量其荧光性质（激发波长550nm）。荧光光谱如图2所示。由图2可见，随着次氯酸钠加入当量的增加，荧光强度逐渐增强。

实施例3荧光探针cr-hclo对不同分子或离子的选择性

从实施例2中荧光探针储备液中取出30μl加入到5ml的离心管当中，分别加入等摩尔量的竞争分子标准溶液，其中一个加入等摩尔量的次氯酸钠标准溶液，5min后检测溶液的荧光发射光谱变化，由图3图4可以发现，其他离子对化合物cr-hclo的荧光几乎没有影响，而次氯酸钠溶液的加入使化合物cr-hclo的荧光显著增强。

实施例4荧光探针cr-hclo对次氯酸的可视化检测

从实施例2中荧光探针储备液中取出30μl加入到5ml的样品管当中，加入50摩尔量的次氯酸钠标准溶液如图5所示，次氯酸钠可以使合物cr-hclo荧光探针的pbs：dmf体积比为1:1的缓冲溶液溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从淡黄色变成橙色。伴随着紫外灯下肉眼可视的次氯酸诱导荧光探针发出明亮的橙红色荧光（图6），说明是一种具有生色传感功能的荧光探针。

实施例5荧光探针cr-hclo对细胞外源性次氯酸荧光成像

将实施例1获得的探针应用于hela细胞中对外源性的次氯酸进行荧光成像应用具体操作步骤如下：将10μm探针dmf溶液加入到育有hela细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30min后用共聚焦显微镜进行成像，结果如图7所示，其中，（a）为探针浓度为10μm加入到hela细胞中培养30min后明场图，（b）为hclo加入前蓝通道荧光成像图，（c）为hclo加入前红通道的荧光成像图，（d）为hclo加入前明场与荧光成像图重合图，（e）为10μmhclo加入30min后明场图，（f）为10μmhclo加入30min后蓝通道荧光成像图，（g）为hclo加入后红通道荧光成像图，（h）为10μmhclo加入后30min后明场与荧光成像重合图。

由图7可以看出，明场成像后可以看到细胞大致的轮廓。然后用蓝光和红光进行激发观察在未加入次氯酸钠前的荧光成像情况，此时观察到蓝色荧光。向体系中加入50μm次氯酸钠水溶液后，10min后再进行荧光检验，红光增强，说明此荧光探针可以对细胞内cr-hclo荧光探针进行细胞成像。

实施例6荧光探针cr-hclo对细胞内源性次氯酸荧光成像

将实施例1获得的探针应用于raw264.7巨噬细胞中对内源性的次氯酸进行荧光成像应用（图8）。利用pma（丙二醇甲醚醋酸酯）和lps（脂多糖）刺激体内次氯酸产生；4-氨基苯甲酸酰肼（abh）为抑制髓过氧化物酶（mpo）的活性抑制剂，能够降低细胞内的mpo形成次氯酸。具体操作步骤如下：将10μm探针dmf溶液加入到育有raw264.7巨噬细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养30min后，第2组加入pma（2μg/ml）和lps（2μg/ml）孵育10分钟，第3组加入pma（2μg/ml）和lps（2μg/ml）孵育10分钟后，再加入abh（200μm）孵育10min，用共聚焦显微镜进行成像，结果如图8所示，其中，（a）-（d）分别为探针浓度为10μm加入到raw264.7细胞中培养30min后明场成像图、蓝色通道荧光成像图、红色通道荧光成像图、红蓝通道的叠加场荧光成像图；（e）-（h）分别为用pma和lps与探针作用刺激巨噬细胞raw264.7的明场、蓝通道、红通道和红蓝通道叠加场图像；（i）-（l）分别为用lps，pma和abh与探针作用，刺激raw264.7巨噬细胞的明场、蓝通道、红通道和红蓝通道叠加场图像。

由图8可以看出，明场成像后可以看到细胞大致的轮廓。在蓝光和红光通道中观察细胞成像情况，raw264.7巨噬细胞仅用探针cr-hclo（10mm）孵育的(c)组细胞红色通道中几乎没有荧光。但是(g)组细胞明显的荧光成像出现在红色通道，而(g)组相比，(k)组细胞红色通道荧光明显减弱，abh作为抑制活性抑制剂，可降低细胞内的mpo酶形成次氯酸。由此说明，此荧光探针可以对细胞内cr-hclo荧光探针进行细胞内源性次氯酸荧光成像。