一种高产脂肪酸破囊壶菌培养基的制作方法

本发明属于培养基技术领域，特别是涉及一种高产脂肪酸破囊壶菌的培养基。

背景技术：

破囊壶菌(thraustochytrium)是一类真核异养原生生物，隶属于网粘菌门(labyrinthulomycota)、网粘菌纲(labyrinthulomycetes)、破囊壶菌目(thraustochytriales)、破囊壶菌科(thraustochytriaceae)。

破囊壶菌广泛分布于全球海域，包括各个大洋、河口、红树林及海洋底泥，在雪水中都曾发现它的踪迹。在不同时期、不同海域破囊壶菌的丰度具有较大的差异，并且在一些海域中其丰度甚至超过细菌^[2]。我国深圳地区受污染的海域，其丰度可达1.57×10⁵个，并且大部分样品中破囊壶菌的丰度均高于浮游细菌，这表明了破囊壶菌在海洋中的重要作用。

破囊壶菌是一种海洋单细胞生物，其菌落在固体培养基中一般为平滑的白色、乳白色或浅粉色，显微镜下观察其细胞形态一般呈圆形或椭圆形，内含多个圆形或椭圆形的游动孢子，孢子具有鞭毛。部分菌株以细胞破裂释放孢子的形式进行繁殖，部分菌株进行二分裂或三分裂的方式进行繁殖。

破囊壶菌具有很高的经济价值，因其高产脂肪酸的能力受到广泛的关注。其代谢产物包括类胡萝卜素、二十二碳六烯酸(dha)、二十碳五烯酸(epa)、角鲨烯等高附加值的多不饱和脂肪酸和十五烷酸(c15：0)、棕榈酸(c16：0)、十八烷酸(c18：0)等饱和脂肪酸。其中dha、epa、角鲨烯是人体重要的多不饱和脂肪酸，dha是大脑和视网膜的重要组分，具有促进大脑发育、视网膜神经成熟、保湿、抗炎、抗癌、抗衰老等作用。棕榈酸是破囊壶菌最主要的饱和脂肪酸，其占比可达70％以上。在大部分菌株中饱和脂肪酸的含量远远大于不饱和脂肪酸的含量，通过甲酯化将饱和脂肪酸转化为脂肪酸甲酯进行生物柴油的制备，是解决能源危机的重要途径。

目前在破囊壶菌的培养中，主要利用通用培养基m4。培养过程中，菌体生长缓慢，生物量低，脂肪酸含量低。选择合适的培养基进行破囊壶菌的培养是提高生物量和脂肪酸的重要途径。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高产脂肪酸的破囊壶菌培养基。

本发明的技术方案概述如下：

一种高产脂肪酸破囊壶菌培养基，包括下述组分：葡萄糖60g/l、酵母提取物5g/l、磷酸二氢钾0.25g/l，人工海盐13.2g/l，余量为水。

所述高产脂肪酸破囊壶菌的培养基，用下述方法制成：称取葡萄糖60g、酵母提取物5g、磷酸二氢钾0.25g、人工海盐13.2g于锥形瓶中，加入超纯水定1l并搅拌均匀，分装至100ml的锥形瓶中，每瓶50ml，115℃灭菌21分钟，即得高产脂肪酸破囊壶菌培养基。

本发明的优点：

本发明的培养基成本低，培养条件简单，操作方便。实验证明，本发明的培养基用于破囊壶菌培养，其生物量和脂肪酸含量均有明显的提高。

附图说明

图1为高产脂肪酸破囊壶菌培养基对thraustochytriidaeg.sp.(atcc：pra-277)生物量和脂肪酸的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种高产脂肪酸破囊壶菌培养基，包括下述组分：葡萄糖60g/l、酵母提取物5g/l、磷酸二氢钾0.25g/l，人工海盐13.2g/l，余量为水。

高产脂肪酸破囊壶菌的培养基，用下述方法制成：

称取葡萄糖60g、酵母提取物5g、磷酸二氢钾0.25g、人工海盐13.2g于锥形瓶中，加入超纯水至1l并搅拌均匀，分装至100ml的锥形瓶中，每瓶50ml，115℃灭菌21分钟，即得高产脂肪酸破囊壶菌培养基。

实施例2

采用实施例1获得的高产脂肪酸破囊壶菌培养基对破囊壶菌进行培养

(1)菌种的活化：在无菌条件下，将破囊壶菌活化，即得活化菌种；

(2)破囊壶菌种子液的制备：于无菌条件下，挑取活化菌种单菌落接种于50ml的m4液体培养基中，于28℃，150rpm的摇床中培养24h，得到种子液；

(3)摇瓶发酵：于无菌条件下，用移液枪取2.5ml步骤(2)获得的种子液于实施例1获得的高产脂肪酸破囊壶菌培养基中,于28℃，150rpm的摇床中培养4天，完成摇瓶发酵培养。

m4液体培养基(破囊壶菌通用培养基)，用下述方法制成：

称取葡萄糖20g、酵母提取物1g、磷酸二氢钾0.25g、蛋白胨1.5g、人工海盐33g于锥形瓶中，加入超纯水至1l并搅拌均匀，分装至100ml的锥形瓶中，每瓶50ml的液体培养基，115℃灭菌21分钟；无菌条件下，将温度降至室温，即得。

对照例

(1)菌种的活化：在无菌条件下，将破囊壶菌活化，即得活化菌种；

(2)破囊壶菌种子液的制备：于无菌条件下，挑取活化菌种单菌落接种于50ml的m4液体培养基中，于28℃，150rpm的摇床中培养24h，得到种子液；

(3)摇瓶发酵：于无菌条件下，用移液枪取2.5ml步骤(2)获得的种子液于m4液体培养基中,于28℃，150rpm的摇床中培养4天，完成摇瓶发酵培养。

生物量的测定：

分别将实施例2和对照例获得的培养液10ml，于已称重的15ml离心管中，4℃、4000rpm离心20min，将上清液倒出，加入10ml已灭菌的超纯水，将下层菌体水洗两次，之后将离心管中的菌体置于-80℃冷冻30分钟，置于冻干机真空冻干，48h后取出称重。见图1。

脂肪酸的测定：

在(生物量的测定过程中)冻干称重后的两个菌体中(对照例和实施例2)先分别加入2ml体积浓度为4％的硫酸-甲醇溶剂，再加入100μl十九烷酸溶液(1mg/ml，正己烷是溶剂)作为内标，于涡旋仪涡旋混匀。置于80℃水浴锅中水浴1h，冷却至室温，加入1ml灭菌超纯水和1ml正己烷，于涡旋仪涡旋混匀。4000rpm离心1min，上层溶液即为脂肪酸甲酯溶液，取上层溶液滤过0.45μm的尼龙膜，即可进行气相色谱测定，根据峰面积及内标的量来计算脂肪酸的含量。见图1。

破囊壶菌：thraustochytriidaeg.sp.(atcc：pra-277)，购买时间2017.04.03，：美国，联系方式https://www.atcc.org/products/all/pra-277.aspx#generalinformation

应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

参考文献

1.李晶晶,刘瑛,成家杨,等.深圳海域6株破囊壶菌的生长特性及油脂成分分析[j].微生物学通报,2015,42(1):17-23.

2，吴克刚,柴向华,杨连生.培养条件对破囊壶菌生长及其产dha的影响[j].广东海洋大学学报,2002,22(4):24-32。