一株高产柠檬酸的微生物菌株及其发酵淀粉糖质生产柠檬酸的方法与流程

文档序号：16645125发布日期：2019-01-16 08:09阅读：905来源：国知局

本发明属于发酵工程技术领域，涉及基因工程构建高发酵强度的黑曲霉菌株应用淀粉糖质发酵产生柠檬酸的方法。更具体的说是：一株基因工程构建高发酵强度的黑曲霉菌株，以淀粉糖质为发酵碳源添加其它有机和无机氮源，及必须的金属盐成分发酵生产柠檬酸的方法。

背景技术：

柠檬酸（citricacid）是一种常见的有机酸，在食品饮料、医药化工、化妆品行业应用广泛，是目前世界需求量最大的一种有机酸。

1784年c.w.舍勒利用柠檬酸钙沉淀法制得柠檬酸。19世纪末生物发酵法雏形初成。1916年，大多数曲霉菌如米曲霉、泡盛曲霉、绿色木霉和温氏曲霉以及黑曲霉被汤姆和柯里实验证实都可生产柠檬酸，而黑曲霉则居于榜首。20世纪中以前，浅盘发酵法是主流，1923年世界上第一家以黑曲霉浅盘发酵法生产柠檬酸的工厂在美国菲泽公司。1950年后，逐渐建立起深层发酵法。深层发酵相较于浅盘发酵法，周期较短，产率更高，占地面积小，劳动力更省，对于工业化生产十分有利，现已成为柠檬酸生产的主要方法。

中国最早于1942年汤腾汉等人的报告中讲述了发酵法制取柠檬酸。1952年开始用浅盘发酵法制取柠檬酸。1959年轻工业部发酵工业科学研究所的200l规模深层发酵制柠檬酸试验初步成功，1966年后，天津市工业微生物研究所、上海市工业微生物研究所先后采用以薯干粉为原料，深层发酵制取柠檬酸，并相继获得成功，从而确定了中国生产柠檬酸的一条主要工艺路线。2000年以来至今，我国柠檬酸生产以玉米粉经高温喷射液化糖液，应用黑曲霉菌株液态深层发酵生产柠檬酸，采用钙盐法和硫酸酸解分离提取柠檬酸。随着我国发酵工业的技术进步，及对生产过程的环境保护要求日益提高，该工艺生产柠檬酸已经无法达到高强度发酵柠檬酸的要求。

主要原因有以下几个问题：

(1)应用玉米粉液化液并带有部分玉米渣共同发酵，导致发酵醪液粘稠，目前发酵醪液总糖在17%-18%，如果增加醪液的总糖会使料液粘稠度进一步增加，发酵过程为达到溶氧要求通风和搅拌能耗过大，无法实现工业化，这样单罐产酸就被限制在18%左右，无法提升。

（2）玉米液化液中含有糊精、寡糖、低聚糖、麦芽糖、异麦芽糖等多种糖类，并含有不同种类的蛋白质，导致发酵产物复杂，产生多种杂酸。发酵醪液成分多样，为柠檬酸分离提取带来困难，目前柠檬酸提取采用钙盐法，最有利于杂酸的去除，但同时会产生硫酸钙废渣无法处理，形成工业生产废渣。由于发酵醪液难以分离纯化柠檬酸，所以一直沿用钙盐法提取柠檬酸，而硫酸钙已经成为各柠檬酸生产公司的固废隐患。

（3）目前柠檬酸发酵结束，发酵固废中黑曲霉菌丝球与不能利用的玉米渣混合在一起，只能干燥进入饲料市场，而黑曲霉菌丝球完全可以用来提取氨基葡萄糖质和甾醇等高附加值产品。

（4）由于柠檬酸发酵采用玉米粉液化液为原料，受到玉米质量的极大影响，如玉米籽粒烘干温度、玉米产地、玉米品种、玉米贮存时间等都会影响玉米液化液中的碳氮比例，导致发酵过程不稳定，影响柠檬酸生产。

（5）目前柠檬酸发酵采用玉米粉液化液为原料，导致发酵过程中溶氧和ph测定和控制困难，发酵过程自动化控制和连续化生产无法实现。

综合上述原因，发展以淀粉糖质为原料的柠檬酸发酵势在必行。

基于淀粉糖质发酵柠檬酸工艺有以下优势：

（1）粉糖质为原料发酵液中物固形物，发酵醪液粘度低，并可以增加初糖浓度达到25%，实现单罐产酸在25%以上，提高劳动生产效率。

（2）淀粉糖质可以完全溶于水，发酵醪液粘度低，有利于溶氧，发酵过程通气和搅拌能耗大幅下降，实现柠檬酸发酵过程的节能目标。

（3）淀粉糖质发酵柠檬酸产生的杂酸少柠檬酸纯度高，其它易碳化合物浓度低，有利于柠檬酸分离提取，可以采用发酵液处理后直接浓缩结晶提取柠檬酸，彻底替代钙盐法，消除钙盐法产生的硫酸钙废渣。

（4）淀粉糖质发酵柠檬酸产生的黑曲霉菌丝球可直接从发酵醪液中分离，用于氨糖和甾醇等提取，实现高附加值产品。

（5）淀粉糖质发酵柠檬酸发酵液除黑曲霉菌丝球外，无其它固形物，有利于发酵过程对菌丝球的在线观察，对发酵液可以进行在线成分检测，从而实现自动化控制和发酵过程的准确优化，最终实现淀粉糖质流加，菌丝球切割复制等连续化发酵工艺的实现。

实现淀粉糖质发酵柠檬酸的关键技术难点：

（1）淀粉糖质发酵柠檬酸过程中添加的有机氮源种类和浓度是实现柠檬酸发酵高转化率的关键。

（2）淀粉糖质发酵柠檬酸过程中能形成较好的菌丝球。

（3）用于淀粉糖质发酵柠檬酸的高转化率菌株。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一黑曲霉菌株aspergillusniger101-hac11（cgmccno.12480）以淀粉糖质为碳源发酵生产柠檬酸的培养基配方及发酵过程控制工艺。

本发明的另一个目的是提供一株微生物发酵淀粉糖质高产柠檬酸的菌株黑曲霉菌株aspergillusniger101-hac11，其分类属黑曲霉菌（aspergillusniger）,保藏号为cgmccno.12480。

本发明还一个目的是公开了的采用黑曲霉菌株aspergillusniger101-hac11（cgmccno.12480）菌种，发酵淀粉糖质生产柠檬酸的方法。

为实现上述目的，本发明公开如下的技术内容：

基因工程构建黑曲霉aspergillusniger101-hac11微生物发酵菌株，其分类属黑曲霉（aspergillusniger）,保藏号为cgmccno.12480。

本发明提供的cgmccno.12480菌株是一株能利用淀粉糖质发酵柠檬酸，通过基因工程构建的黑曲霉新菌株，用该菌株发酵糖质原料生产柠檬酸，其分类属黑曲霉（aspergillusniger）,保藏号为cgmccno.12480，保藏日期2016年6月12日。保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号）。该菌株是以柠檬酸生产菌株黑曲霉aspergillusnigerwlgcgmccno.10142,保藏日期2014年12月11日,保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号）。aspergillusnigerwlgcgmccno.10142为出发菌株，通过基因工程构建过表达aox1基因、丙酮酸羧化酶基因、丙酮酸脱氢酶基因获得的高发酵强度柠檬酸菌株。

黑曲霉aspergillusniger101-hac11微生物发酵菌株,保藏号为cgmccno.12480的理化性质如下：能够高效表达柠檬酸合成过程中关键的酶丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、交替氧化酶。

本发明利用诱导型启动子pgla启动pc蛋白在黑曲霉中表达，进而利用组成型启动子pgpda启动丙酮酸脱氢酶pd基因，交替氧化酶aox1基因，通过增强丙酮酸羧化酶pc基因表达量以及活性，提高丙酮酸含量。进一步增强乙酰coa、nadh氧化代谢流，从而提高柠檬酸的产量，糖酸转化率。

本发明方法是以柠檬酸生产菌株黑曲霉aspergillusnigerwlgcgmccno.10142为出发菌株进行基因工程改造，该出发菌株的柠檬酸产量为166.8g/l，与现有技术相比，该重组黑曲霉菌株柠檬酸产量为220.34g/l，产量提高32.10%。

本发明公开的采用cgmccno.12480菌株发酵淀粉糖质生产柠檬酸的方法，其特征在于：

（1）采用的发酵菌株为黑曲霉菌株aspergillusniger101-hac11保藏号cgmccno.12480，发酵培养基组成为（g/l）：淀粉糖质原料200~260g，玉米浆60~80g/l，(nh4)2so49~11g/l,mgso4·7h2o0.05~0.15g/l，k2hpo,4~6g/l，cuso40.8mg/lznso40.02g/l，cacl22.0g/l，kcl0.1g/l，feso40.34mg/lph5.0～5.5；

（2）发酵培养控制条件：按10%~15%（v/v）的接种量控制在，种龄控制在27小时，将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30~40℃，发酵通气量为0.1~0.15m³/m³.min，罐压0.07~0.12mpa，搅拌速度80~100转/分钟，发酵时间50~60小时，发酵过程中通入无菌空气，发酵结果柠檬酸产量为220~260g/l,糖酸转化率在102%以上。具有快速，生产工艺流程简单、生产工艺流程简单、糖酸转化率高，适应自动化大规模工业化生产，生产效率高，产品易分离等特点。

本发明所述的制备方法，其中淀粉糖质原料包括：淀粉（包括：玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉）经过液化、糖化后过滤的含糖质溶液，其中糖质包括：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、不显色糊精。

本发明更加详细的描述如下：

一株高产柠檬酸微生物的发酵菌株，其分类黑曲霉菌株aspergillusniger101-hac11，保藏号cgmccno.12480，该菌株的构建方法是：将黑曲霉中的丙酮酸羧化酶pc基因、丙酮酸脱氢酶pd基因及交替氧化酶aox1基因多拷贝整合到黑曲霉基因组上，利用该重组黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸；所述丙酮酸羧化酶pc基因的表达受pgla启动子的调控，丙酮酸脱氢酶pd基因及交替氧化酶aox1基因受pgpda启动子调控。

所述丙酮酸羧化酶pc基因的核苷酸序列如seqidno.1，所述pgla启动子为诱导型启动子，该启动子的核苷酸序列如seqidno.2所示。

一种丙酮酸羧化酶pc基因表达框，所述表达框包含pgla启动子、丙酮酸羧化酶pc基因，hyg抗性标记及trp终止子，按照pgla-pc-hyg-trp的顺序排布。所述trp终止子的核苷酸序列如seqidno.3所示。所述丙酮酸脱氢酶pd基因的核苷酸序列如seqidno.4；所述交替氧化酶aox1基因的核苷酸序列如seqidno.5，所述pgpda启动子为组成型启动子，该启动子的核苷酸序列如seqidno.6所示。hyg基因的核苷酸序列为seqidno:7。

本发明所述重组黑曲霉菌的制备方法包括如下步骤：

②构建丙酮酸羧化酶pc基因表达框pgla-pc-hyg-trp；

②构建丙酮酸脱氢酶pd基因及交替氧化酶aox1基因表达框pgpda-pd-aox1-hyg-trp；

③将步骤①和步骤②制得的基因表达框转化黑曲霉，经抗性筛选和pcr鉴定获得所述重组黑曲霉菌。

所述步骤①中所述抗性表达框中hyg基因的核苷酸序列如seqidno.7所示。

（2）液态深层发酵黑曲霉aspergillusniger101-hac11生产柠檬酸的培养基和发酵过程控制：

a.不同有机氮源种类对黑曲霉aspergillusniger101-hac11淀粉糖质柠檬酸发酵的影响；不同有机氮源对黑曲霉aspergillusniger101-hac11柠檬酸发酵，糖酸转化率等具有显著的影响，结果如图1所示。

由图1可知，4种氮源对于产酸的影响先后顺序为玉米浆＞大豆蛋白胨＞蛋白饲料＞酵母粉，添加玉米浆时产酸最高可达9.27%，糖酸转化率均高于其它氮源，并且残还原糖相对较少，大豆蛋白胨次之，添加玉米浆和大豆蛋白胨发酵性能优于添加其他有机氮源。综合以上产酸、转化率、残还原糖以及菌球形态考虑，四种有机氮源中，最终选取玉米浆为柠檬酸玉米清液发酵最适有机氮源。

b.玉米浆加入量的确定

确定玉米浆为最佳有机氮源，玉米浆的浓度是关系柠檬酸是否能够高效发酵的重要因素之一，通过测定最后的产酸以及糖酸转化率的计算，从而确定玉米浆最适浓度。结果如图2所示。由图2可知，当玉米浆浓度为0.7%时黑曲霉产酸及糖酸转化率均最高，继续增加玉米浆产酸不再增加。综合比较产酸和转化率指标，选取0.7%玉米浆作为发酵培养基的最佳有机氮源。

c.不同浓度(nh4)2so4对柠檬酸清液发酵的影响

在发酵培养基中添加0.7%玉米浆后加不同终浓度的(nh4)2so4，通过测定最后的产酸，从而确定清液发酵培养基中(nh4)2so4的最适浓度，结果如图3。由图3可知，发酵液中(nh4)2so4的总浓度0.1%时，产酸量及糖酸转化率均为最高。在添加其他浓度的(nh4)2so4时，产酸量及糖酸转化率均不理想，所以选择0.1%作为(nh4)2so4的最适总浓度。

d.不同浓度营养因子肌醇对柠檬酸清液发酵的影响

在发酵培养基中添加不同浓度的肌醇，最终测定最后的产酸并观察菌丝体形态从而确定清液发酵培养基中肌醇的最适添加量，结果如图4。图4可知，从产酸以及糖酸转化率方面看，添加一定量的肌醇对提高产酸有明显作用，添加一定量肌醇的发酵产酸均高于未添加肌醇的发酵产酸，其中添加总浓度0.007%的肌醇时产酸以及糖酸转化率最高，继续增加肌醇浓度时，产酸不再增加且菌丝球一致性下降，菌丝扩散较多。综合以上因素考虑选取0.007%的肌醇为最优浓度。

e.金属离子的浓度对发酵的影响

选取mgso4、cuso4、znso4、cacl2、kcl、feso4多种浓度进行正交试验，正交试验结果见表1。

表1正交试验结果

表2正交试验方差分析

由表2可知，mgso4、cuso4、znso4、cacl2、kcl、feso4这六个因素的不同水平中，通过极差分析可知，影响因子的主次顺序为：cacl2＞mgso4＞kcl＞feso4＞znso4＞cuso4，最优组合为a1b1c1d1e1f3，优化后的最优浓度：mgso40.1g/l，cuso40.8mg/lznso40.02g/l，cacl22.0g/l，kcl0.1g/l，feso40.34mg/l。

在最优浓度培养条件下，对优化结果进行验证试验，500ml三角瓶装液量50ml，36.5℃，330r/min进行柠檬酸发酵72h。验证结果产酸为9.96%，高于正交实验中任何一组产酸，验证了最佳组合的优势效应。

f.淀粉糖质清液最佳发酵条件

（1）不同初糖浓度对柠檬酸发酵的影响

选取不同淀粉糖质清液进行发酵后，测定柠檬酸产量，残糖结果见表3。

表3发酵结束柠檬酸产量

由表3可知，当初糖浓度为20%-22%时发酵结束时糖酸转化率达到100%以上，且残糖浓度处于较低水平。

(2)种龄对柠檬酸清液发酵的影响

接种不同种龄的种子液进行发酵实验，测定最终柠檬酸含量，残还原糖并记录相应发酵周期，结果见表4。

表4种龄对柠檬酸发酵的影响

由表4可知，随着种龄的增大，柠檬酸酸产量逐渐增大，其中菌龄27h时产酸最高，因此选择种龄27h为黑曲霉菌种最佳移种时间。

(3)不同工艺控制对柠檬酸清液发酵的影响

不同工艺控制，使发酵过程发酵液中溶氧浓度差异较大，而溶氧浓度对柠檬酸发酵有极大的影响。从发酵开始每隔8h取样，测定发酵液中柠檬酸浓度、ph值的变化情况。结果如图5所示。由图5可知，0-16h时，大通风量溶氧优于分段通风；16-64h时，方案a溶氧高于方案b。结合图5来看，方案b中，发酵前期溶氧过高，易引起菌体增殖过剩，导致黑曲霉过早进入柠檬酸累积期，ph值下降过快。低ph会影响糖化酶活性，进而影响原料的利用率，使发酵液残糖含量过高，故发酵后期方案b产酸不如方案a。最终选取方案a三段式通风量。

由图5可知，在发酵前期（0~16h）控制通风量为0.15m³/m³.min，菌体大量增殖，代谢正常，发酵液ph为3.5，该ph值有利于保持发酵液糖化酶活力，使还原糖含量上升，发酵16h之后黑曲霉进入快速产酸期，17~48h通风量调整为：0.225m³/m³.min，转速90~100r/min，此时黑曲霉菌丝球代谢更加旺盛，更多的还原糖转化为柠檬酸，此时还原糖含量开始大幅度下降，产酸量开始大量增加；48h以后接近发酵结束，49~58h通风量调整为：通风0.10m³/m³.min，转速85~95r/min，此时还原糖处于较低水平，溶氧较高，ph值相对稳定，可降低通风和转速。在58h发酵结束时，柠檬酸产量为220.3g/l，糖酸转化率为102.8%，残还原糖量为0.1%。

本发明公开的产柠檬酸的微生物发酵菌株及其制备方法所具有的积极效果在于：

（1）粉糖质为原料发酵醪液粘度低，并可以增加初糖浓度达到25%，实现单罐产酸在25%以上，提高劳动生产效率。

（2）淀粉糖质可以完全溶于水，有利于溶氧，发酵过程通气和搅拌能耗大幅下降，实现柠檬酸发酵过程的节能目标。

（3）淀粉糖质发酵柠檬酸产生的柠檬酸纯度高，可以采用发酵液处理后直接浓缩结晶提取柠檬酸，彻底替代钙盐法，消除钙盐法产生的硫酸钙废渣。

（4）淀粉糖质发酵柠檬酸产生的黑曲霉菌丝球用于氨糖和甾醇等提取，实现高附加值产品。

（5）淀粉糖质发酵柠檬酸发酵可以进行在线成分检测，从而实现自动化控制和发酵过程的准确优化，最终实现淀粉糖质流加，菌丝球切割复制等连续化发酵工艺的实现。

本发明的sequencelisting如下：

pc基因的核苷酸序列seqidno:1

pgla启动子的核苷酸序列seqidno:2

trp终止子的核苷酸序列seqidno:3

pd基因的核苷酸序列seqidno4

aox1基因的核苷酸序列seqidno:5

pgpda启动子的核苷酸序列seqidno:6

hyg基因的核苷酸序列seqidno:7

附图说明

图1不同有机氮源对柠檬酸发酵的影响；

图2不同玉米浆含量对柠檬酸发酵的影响；

图3不同(nh4)2so4含量对柠檬酸发酵的影响；

图4不同肌醇含量对柠檬酸发酵的影响；

图5不同工艺对8小时柠檬酸积累的影响；a：方案a三段式通风量b：方案b大通风量产酸曲线。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

实施例1

高产柠檬酸微生物的发酵菌株的构建方法，该菌株是将黑曲霉中的丙酮酸羧化酶pc基因、丙酮酸脱氢酶pd基因及交替氧化酶aox1基因多拷贝整合到黑曲霉基因组上，利用该重组黑曲霉菌株发酵生产柠檬酸；所述丙酮酸羧化酶pc基因的表达受pgla启动子的调控，丙酮酸脱氢酶pd基因及交替氧化酶aox1基因受pgpda启动子调控。

实施例2