专利名称：冠突散囊菌快速分离方法
技术领域：
本发明涉及农产品加工技术领域，具体涉及茯砖茶优势菌冠突散囊菌快速分离方 法，冠突散囊菌俗称金花。
背景技术：
一直以来，茯砖茶是作为边疆少数名族日常生活中不可或缺的必备品，在边疆享 有“宁可三日无粮，不可一日无茶”的美誉，其奥妙与茯砖茶的品质风味是不可分割的。发 花是形成茯砖茶独特品质风味的关键工艺，其目的是通过对外界条件(如温、湿度等)的 控制促使茯砖茶中的优势菌种——冠突散囊菌生长繁殖，从而使茯砖茶具备独特的品质风 味。该菌俗称金花，历来边疆少数民族通过判断金花质量和数量来衡量茯砖茶的品质优劣。茯砖茶因具有独特的金花菌以及品质风味而闻名，边疆少数名族更是将金花视为 衡量茯砖茶品质的标志，金花菌慢慢便成为人们研究的焦点，快速分离成品茯砖茶中金花 菌是研究的基础。因此，目前亟待研制一种能在短期内从成品茯砖茶中快速分离金花菌的 方法，基本无杂菌，满足不同品牌茯砖茶金花菌分离需要、操作性强。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是解决上述现有技术存在的问题，而提供一种用于 茯砖茶优势菌冠突散囊菌快速分离方法，实现在短期内从成品茯砖茶中快速分离冠突散囊 菌即金花菌，而且无杂菌，满足不同品牌茯砖茶中金花菌的分离需要，而且可操作性强。本发明采用的技术方案是这种冠突散囊菌快速分离方法，其具体步骤为1)成品茯砖茶的处理；2)冠突散囊菌发酵液的制备；3)冠突散囊菌快速分离培养基的制备；4)冠突散囊菌的培养、纯化；5)冠突散囊菌的保存。上述技术方案中，所述的成品茯砖茶的处理是用植物微型粉碎机将样品粉碎，200 目过筛、65°C干燥2小时后称取Ig样品，定容10mL，配成浓度为10—1、10_2、10_3、10_4、10_5各 IOmL,取10_3、10_4、10_5三个梯度准备涂布改良PDA平板；上述技术方案中，所述的冠突散囊菌发酵液的制备方法为接种实验室已经分离 纯化的冠突散囊菌于PDA液体培养基中，培养至OD值0. 6-0. 8，用0. 2 μ m过滤膜进行 过滤灭菌，即为制备好的发酵液；上述技术方案中，所述的冠突散囊菌快速分离培养基的制备是为改良PDA固体 培养基，改良方法为按照常规方法配制PDA固体培养基，灭菌结束后冷却至50°C左右，按照 培养基量和冠突散囊菌发酵液体积比10 1添加制备好的发酵液，趁热到平板；上述技术方案中，所述的冠突散囊菌的培养、纯化为取浓度10-3、10_4、10-5三个梯 度各0. 5mL涂布于改良PDA平板超净台上吹干，培养2_3天，挑取金黄色优势菌落，画线接种至同样的改良PDA平板上，同样条件继续培养直至纯化；结果判定当冠突散囊菌落 呈现金黄色，菌落形态相同、大小一致，无其它杂菌生长即表示冠突散囊菌已经纯化分离。上述技术方案中，所述的冠突散囊菌的保存为用改良PDA斜面管保存于4°C冰箱 中或用改良PDA液体培养基制成孢子悬液加50%灭菌甘油于-70°C冰箱保存。上述技术方案中，所述的PDA指Potato Dextrose Agar的简称，中文含义为马铃 薯葡萄糖琼脂培养基。PDA液体培养基指将马铃薯洗净去皮，称取200g，切成小块放入烧杯中，加适量蒸 馏水，煮沸1小时，稍冷后用双层纱布过滤，最后加入蔗糖20g，混勻，用量筒定容至IOOOmL, 趁热分装在三角瓶中，在1. lkg/cm2(12rC )中保持20分钟灭菌。PDA平板指培养基灭菌结束后冷却至50 0C左右，在超净工作台上将培养基倒入事 先已经灭菌并干燥的培养皿中，待冷却即为制得的PDA培养基平板。改良PDA固体培养基指将马铃薯洗净去皮，称取200g，切成小块放入烧杯中，加适 量蒸馏水，煮沸1小时，稍冷后用双层纱布过滤，在滤液中加IOOmL制备好的茶汁，然后加入 15g琼脂，加热熔化，最后加入蔗糖20g，混勻，用量筒定容至IOOOmL,趁热分装在三角瓶中， 在1. lkg/cm2(121°C)中保持20分钟灭菌。灭菌结束后冷却至50°C左右，在超净工作台上 将10%茶汁的PDA琼脂固体培养基倒入事先已经灭菌并干燥的培养皿中，待冷却即为制得 的10%茶汁的PDA琼脂固体培养基平板。改良PDA固体培养基在冠状散囊菌快速分离技术指10%茶汁的PDA培养基按照 上述方法制备，灭菌结束后冷却至50°C左右，按照培养基量和冠状散囊菌发酵液体积比 10 1添加制备好的冠状散囊菌发酵液，趁热到平板，即为冠状散囊菌快速分离培养基平 板，亦即改良PDA固体培养基平板。画线接种指用灭菌的接种针在超净台中将已经生长好的菌落挑取，在新的固体培 养基平皿画线分离相应微生物。金花菌落指金花菌在10% PDA培养基平板上生长到一定时候形成的一个菌落集 合体，菌落是指聚集在一起的微生物团。茶汁的制备方法制按照Ig茯砖茶样本比30mL蒸馏水的比例称取20g茯砖茶，加 入600mL蒸馏水，100水浴2小时，待稍冷却后用量筒定容至600mL即为制备好的茶汁。冠状散囊菌的发酵液的制备接种实验室已经分离纯化的冠状散囊菌于添加 10%茶汁的PDA液体培养基中，培养至OD值0. 6-0. 8，用0. 2 μ m过滤膜进行过滤灭菌， 即为制备好的冠状散囊菌发酵液，OD值即吸光值。本发明能在短期4-5天内从成品茯砖茶中快速分离冠突散囊菌，而且基本无其他 杂菌生长，满足从不同品牌茯砖茶中金花菌的分离需要，可操作性强，为金花菌的研究奠定 了基石出。
图1为PDA培养基3天分离、纯化成品湘益牌茯砖茶样本中冠突散囊菌验证结果 照片。图2为改良PDA培养基3天分离、纯化成品湘益牌茯砖茶样本中冠突散囊菌验证 结果察照片。
图3为改良PDA培养基分离、纯化成品湖南益阳茶厂茯砖茶样本中冠突散囊菌的 验证结果照片，图中只显示了浓度为10_4梯度照片。图4为改良PDA培养基分离、纯化成品湖南安化利源隆茶厂茯砖茶样本中冠突散 囊菌的验证结果照片，图中只显示了浓度为10_4梯度照片。图5为改良PDA培养基分离、纯化成品永泰福茶厂茯砖茶样本中冠突散囊菌的验 证结果照片，图中只显示了浓度为10_4梯度照片。图6为改良PDA培养基分离、纯化成品湖南安化华茗茶厂茯砖茶样本中冠突散囊 菌的验证结果照片，图中只显示了浓度为10_4梯度照片。图7为改良PDA培养基分离、纯化成品湖南久杨茶叶有限公司茯砖茶样本中冠突 散囊菌的验证结果照片，图中只显示了浓度为10_4梯度照片。图8为改良PDA培养基分离、纯化成品白沙溪茶叶有限公司茯砖茶样本中冠突散 囊菌的验证结果照片，图中只显示了浓度为10_4梯度照片。
具体实施例方式1、成品茯砖茶的处理用植物微型粉碎机将样品粉碎，200目过筛、65°C干燥2小时后称取Ig样品，定容 10mL，配成浓度为川入川人川穴川入^^各川！^，取10-3、10_4、10-5三个梯度准备涂布改良 PDA平板。2、冠突散囊菌发酵液的制备用接种环挑取实验室已经分离纯化的冠突散囊菌接种于PDA液体培养基中，28°C 培养至OD值0. 6-0. 8，用0. 2 μ m过滤膜进行过滤灭菌，即为制备好的发酵液。3、冠突散囊菌快速分离培养基的制备冠突散囊菌快速分离培养基为改良PDA固体培养基，改良方法为按照常规方法配 制PDA固体培养基，灭菌结束后冷却至50°C左右，按照培养基量和冠突散囊菌发酵液体积 比10 1添加制备好的发酵液，趁热到平板。4、冠突散囊菌的培养、纯化取10_3、10_4、10_5三个梯度各0. 5mL涂布改良PDA平板超净台上吹干，28 V培养 2-3天，挑取金黄色优势菌落，画线接种至同样的改良PDA平板上，同样条件继续培养直至纯化。5、冠突散囊菌的保存用改良PDA斜面管保存于4°C冰箱中或用改良PDA液体培养基制成孢子悬液加 50%灭菌甘油于_70°C冰箱保存。实施例1 :PDA培养基与改良PDA培养基分离、纯化成品湘益牌茯砖样本中冠突散 囊菌的验证将成品湘益牌茯砖样本按照具体实施方式
1-4步实验，结果证明能有效分离冠突 散囊菌。分离纯化的金花菌落见附图1和附图2。实施例2 改良PDA培养基分离、纯化成品湖南益阳茶厂、湖南安化利源隆茶厂、湖 南安化华茗茶厂、永泰福茶厂、湖南久杨茶叶有限公司、白沙溪茶叶有限公司生产的茯砖样本中冠突散囊菌的验证将湖南益阳茶厂、湖南安化利源隆茶厂、湖南安化华茗茶厂、永泰福茶厂、湖南久 杨茶叶有限公司、白沙溪茶叶有限公司生产的茯砖样本按照具体实施方式
1-4步实验，结 果证明能有效分离冠突散囊菌。分离纯化的金花菌落见附图2和附图3、4、5、6、7、8。
权利要求
1.一种冠突散囊菌快速分离方法，其特征在于其具体步骤为1)成品茯砖茶的处理；2)冠突散囊菌发酵液的制备；3)冠突散囊菌快速分离培养基的制备；4)冠突散囊菌的培养、纯化；5)冠突散囊菌的保存。
2.根据权利要求1所述的冠突散囊菌快速分离方法，其特征在于所述的成品茯砖茶 的处理是用植物微型粉碎机将样品粉碎，200目过筛、65°C干燥2小时后称取Ig样品，定容 10mL，配成浓度为川入川人川穴川入^^各川！^，取10-3、10_4、10-5三个梯度准备涂布改良 PDA平板。
3.根据权利要求1所述的冠突散囊菌快速分离方法，其特征在于所述的冠突散囊菌 发酵液的制备方法为接种实验室已经分离纯化的冠突散囊菌于PDA液体培养基中二8°C 培养至OD值0. 6-0. 8，用0. 2 μ m过滤膜进行过滤灭菌，即为制备好的发酵液；
4.根据权利要求1所述的冠突散囊菌快速分离方法，其特征在于所述的冠突散囊菌 快速分离培养基的制备是为改良PDA固体培养基，改良方法为按照常规方法配制PDA固体 培养基，灭菌结束后冷却至50°C左右，按照培养基量和冠突散囊菌发酵液体积比10 1添 加制备好的发酵液，趁热到平板；
5.根据权利要求1所述的冠突散囊菌快速分离方法，其特征在于所述的冠突散囊菌 的培养、纯化为取浓度10_3、10_4、10_5三个梯度各0. 5mL涂布于改良PDA平板超净台上吹 干，培养2-3天，挑取金黄色优势菌落，画线接种至同样的改良PDA平板上，同样条件继 续培养直至纯化；结果判定当冠突散囊菌落呈现金黄色，菌落形态相同、大小一致，无其 它杂菌生长即表示冠突散囊菌已经纯化分离。
6.根据权利要求1所述的冠突散囊菌快速分离方法，其特征在于所述的冠突散囊菌 的保存为用改良PDA斜面管保存于4°C冰箱中或用改良PDA液体培养基制成孢子悬液加 50%灭菌甘油于_70°C冰箱保存。
全文摘要
一种冠突散囊菌快速分离方法，其特征在于其具体步骤为1)成品茯砖茶的处理；2)冠突散囊菌发酵液的制备；3)冠突散囊菌快速分离培养基的制备；4)冠突散囊菌的培养、纯化；5)冠突散囊菌的保存。本发明实现了在短期内从成品茯砖茶中快速分离冠突散囊菌即金花菌，而且无杂菌，满足不同品牌茯砖茶中金花菌的分离需要，而且可操作性强。
文档编号C12N1/14GK102120963SQ20101059820
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者刘石泉, 赵运林 申请人:湖南城市学院