冠突散囊菌ls1菌株的制作方法
【专利摘要】一种冠突散囊菌LS1菌株，其分类命名为冠突散囊菌(EurotiumCristatum)LS1，于2015年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015379。该菌株LS1能于葛根上生长并进行生物转化，利用本发明菌株LS1对葛根进行发酵，所得发酵产物对豆角炭疽病、番茄早疫病、油菜菌核及白菜黑斑病均表现出更强的抑制作用，对金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌五种致腐败细菌的抑制作用均比发酵前得到提高。表明，本发明菌株LS1发酵葛根的产物具有广谱抑菌活性，在一定程度上能抑制病原真菌及致腐败细菌，有望开发成为生物农药用以防治农作物病害，并有望作为食品杀菌剂用于食品保藏。CCTCC NO：M 201537920150617
【专利说明】
冠突散囊菌LS1菌株
技术领域
[0001 ]本发明属于微生物领域，涉及一种冠突散囊菌(Eurotium Cristatum)LSl菌株。
【背景技术】
[0002] 食品在原料生产、采后、制作、包装、储藏、运输和销售等各环节均易受到微生物的 污染，长期以来，冷藏、冷冻、腌渍、辐射、化学杀菌剂等成为人们用以防止食品腐败变质的 常用技术，其中化学杀菌剂由于成本低、操作简单、效果明显等优势曾被广泛利用。然而化 学杀菌剂不易分解，长期使用易造成环境污染，引起植物病原菌产生耐药性，且其农药残留 危害人类健康。由于化学杀菌剂的固有缺点和不合理使用，人们已经认识到化学杀菌剂的 潜在危害，并且开始关注开发广谱、高效、安全且便宜的新型天然杀菌剂。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决技术问题是，针对上述现有技术的不足，提供一种冠突散囊菌 (Eurotium Cristatum)LSl菌株。
[0004] 本发明所述的冠突散囊菌(Eurotium Cristatum)LSl菌株，其分类命名为冠突散 囊菌LSI (EurotiumCristatum)LSl，已于2015年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2015379。
[0005] 光学显微镜下，本发明菌株LSI呈现大量菌丝，有隔，且呈不对称分支;子囊果大 量，呈球形，光滑。
[0006] 提取本发明菌株LSl基因组DNA，采用真菌通用引物进行PCR扩增、测序，经BLAST进 行同源性比对，结果表明与冠突散囊菌（Eurotium cristatum)同源性最高，相似性为 100%。结合该菌株的形态学特征，确定本发明菌株为冠突散囊菌Eurotium cristatum，命 名为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)LSl〇
[0007] 将浓度为3 X 106-3 X IO8个/mL的本发明菌株的孢子悬浮液接种1%至葛根发酵培 养基中，于27-2%~恒温培养5-7d，得到发酵产物。所得发酵产物对豆角炭疽病、番茄早疫 病、油菜菌核及白菜黑斑病均表现出了更强的抑制作用，对金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆 菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌五种致腐败细菌的抑制作用均比未发酵材料得到了 提高。表明，本发明菌株LSl发酵葛根的产物具有广谱抑菌活性，在一定程度上能抑制病原 真菌及致腐败细菌，有望开发成为生物农药用以防治农作物病害，从而减少食品原料中化 学农药的残留和化学农药对环境的污染，并有望作为食品杀菌剂用于食品保藏。
【附图说明】
[0008] 图1是本发明菌株LSl发酵产物对豆角炭疽病菌的抑制效果图。
[0009] 图2是本发明菌株LSl发酵产物对番茄早疫病菌的抑制效果图。
[0010] 图3是本发明菌株LSl发酵产物对油菜菌核病菌的抑制效果图。
[0011] 图4是本发明菌株LSl发酵产物对白菜黑斑病菌的抑制效果图。
【具体实施方式】 [0012] 实施例1
[0013] 取用湖南黔阳采集的茶叶制作的茯砖茶，有"发花现象"。挑取茯砖茶上的金黄色 闭囊壳接种于PDA培养基上，28 tC恒温培养5天，挑取菌丝作平板划线，重复3次纯化，得本发 明菌株LSl。
[0014] 实施例2
[0015] 孢子悬浮液的制备：以现有技术制备本发明菌株LSl的孢子悬浮液，浓度为3 X IO7 个/mL，待用。
[0016] 发酵液的制备:吸取浓度为3 X IO7个/mL的上述孢子悬浮液接种1%至葛根发酵培 养基（葛根2.5g及水IOmL)上，28°C恒温培养。7d后，用95%质量浓度的乙醇超声萃取发酵 物，取上清液，通过旋转蒸发仪挥发至恒重，得发酵产物，于该发酵产物中分别加蒸馏水稀 释至发酵液的质量浓度为〇. lmg/mL。
[0017] 未发酵液的制备:葛根粉碎为粉后，加蒸馏水稀释至25mL制得，未发酵液液质量浓 度为0. lmg/mL。
[0018] 上述葛根发酵液和未发酵液待用于实施例3和实施例4。
[0019]实施例3对病原真菌的抑制作用
[0020] 供试病原真菌：豆角炭疽病菌（Colletotrichum)、番前早疫病菌（Alternaria sonali)、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerot iorum)、白菜黑斑病菌（Al ternar ia brassicae)由湖南农业大学食品科技学院微生物实验室提供。
[0021 ]化学杀菌剂恶霉灵:购自郑州雨康生物科技公司，有效成分含量为80.1 % ;恶霉灵 无菌水稀释1000倍，作为阳性对照。
[0022]处理组(葛根发酵液、葛根未发酵液)和阳性对照组的处理:采用平板对峙法，先在 直径为90mm的培养皿中倒入5mLPDA，凝固后加入2mL处理组或恶霉灵液，摇匀后再加入 15mLPDA。空白对照组的培养基中是加入2mL无菌水。待凝固后，在平板中接入3mm致病菌菌 饼，28°C培养72h后测量菌落直径，计算抑制率。每处理3次重复。抑制率=(Dck-D0)/DckX 100%，其中，Dck为空白对照组菌饼直径，DO实验组菌饼直径，单位为mm。
[0023]由图1可知，各处理组对豆角炭疽病菌均有一定的抑制效果。葛根发酵后处理对豆 角炭疽病菌的抑制效果均优于发酵前。与阳性对照组恶霉灵相比，葛根发酵液的抑制效果 均优于恶霉灵，且差异显著(P<〇.05);葛根未发酵液的抑制效果与恶霉灵相比较弱，但差 异不显著(P>〇.05)。因此，葛根有一定的抑制豆角炭疽病菌的能力，经本发明菌株LSl发酵 后，发酵产物对豆角炭疽病菌的抑制效果得到了显著提高。
[0024]由图2可知，各处理组均对番茄早疫病有一定的抑制效果。葛根发酵后处理对番茄 早疫病菌的抑制效果均优于发酵前。与阳性对照组恶霉灵相比，葛根发酵液对番茄早疫病 菌的抑制效果优于恶霉灵。由此可知，葛根有一定的抑制番茄早疫病菌的能力，经本发明菌 株LSl发酵后的发酵产物对番茄早疫病的抑制效果得到了一定的提高。
[0025]由图3可知，各处理组对油菜菌核病菌均有一定的抑制效果，且葛根发酵后处理对 油菜菌核病菌的抑制效果均优于发酵前。与阳性对照组相比，各处理组对油菜菌核病菌的 抑制效果均弱于恶霉灵。故可以得知，葛根经本发明菌株LSl发酵后有一定的抑制油菜菌核 病菌的能力，但抑制率与恶霉灵无显著性差异(P>〇. 05)。
[0026]由图4可知，葛根及其发酵产物对白菜黑斑病菌均有一定的抑制效果。葛根发酵后 处理对白菜黑斑病菌的抑制效果均优于发酵前。各处理组与阳性对照恶霉灵相比，对白菜 黑斑病的抑制效果无显著性差异。
[0027]上述试验表明，葛根具有广谱抑菌活性，可在一定程度上抑制病原真菌及致腐败 细菌。经本发明菌株LSl生物转化后，对豆角炭疽病、番茄早疫病、油菜菌核及白菜黑斑病均 表现出了更强的抑制作用，可见，通过微生物的转化作用可成为改变物质的抑菌有效性的 有效途径，有望开发成为生物农药用以防治农作物病害。
[0028] 实施例4对致腐败细菌的抑制作用
[0029] 供试细菌:金黄色葡萄球菌（Stahylococlus aureus)、錯样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、大肠杆菌(Escherichea col i )、枯草芽抱杆菌(Baci Ilus sub til is)、沙门氏菌 (Salmonella)由湖南农业大学食品科技学院微生物实验室提供。
[0030] 采用滤纸圆片法，用打孔器将滤纸制成直径为6_的小圆片，放在小烧杯中，121°C 湿热灭菌〇.5h，烘干备用;于无菌条件下将灭菌滤纸片分别放入制备的含IOOyL细菌菌液的 平板上，每皿中分别放置3个滤纸片，其中1个发酵液、1个未发酵液及1个空白对照（无菌 水），每处理3次重复，用移液枪在滤纸片中心分别加入各样液15yL; 37°C培养l-2d，观察菌 落生长情况，测量抑菌圈直径。葛根及其发酵产物对5种致腐败细菌的抑制作用结果见下表 1〇
[0031] 表1发酵产物对致腐败细菌的抑制作用
[0033] 抑菌圈试验结果的鉴定标准为:抑菌圈直径大于15mm为高度敏感、10-15mm为中度 敏感、7-9mm为低度敏感、无抑菌圈为不敏感。
[0034] 由上表1可知，葛根发酵后处理对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、沙门 氏菌及枯草芽孢杆菌为中度敏感。未发酵处理组对金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌及枯草 芽孢杆菌为低度敏感，对大肠杆菌和沙门氏菌为中度敏感，但，葛根发酵液的抑制效果明显 比未发酵液的抑制效果要好。
[0035] 由对致腐败细菌的抑制作用结果显示，葛根发酵前后对5种细菌均有一定的抑制 作用。葛根经本发明菌株LSl生物转化后，对五种致腐败细菌的抑制作用均得到了提高，有 望作为食品杀菌剂用于食品保藏。
【主权项】
1. 一种冠突散囊菌化111*〇1:;[11111〇18七31：11111)1^1菌株，于2015年6月17日保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015379。2. -种发酵葛根的方法，其特征在于，该方法是将浓度为3 X 106-3 X 108个/mL的权利要 求1所述LSI菌株的孢子悬浮液接种1%至葛根发酵培养基中，于27-2%~恒温培养5-7d。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述葛根发酵培养基组成为葛根2.5g及水 10mL〇4. 权利要求2或3所述方法制得的发酵产物在抑制豆角炭疽病、番茄早疫病、油菜菌核 病或白菜黑斑病中的应用。5. 权利要求2或3所述方法制得的发酵产物在抑制金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、大 肠杆菌、枯草芽孢杆菌或沙门氏菌中的应用。
【文档编号】A01N63/04GK105861333SQ201610423877
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】易有金, 王璐, 夏菠, 曹熙, 胡谢欣
【申请人】湖南农业大学