赖氨酸的发酵中所用的设备和部件的制作方法

本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵l-赖氨酸的方法及其中所用的设备和部件，如发酵罐及其部件等。

背景技术：

l-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中。当前，l-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。

用于发酵生产的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通过诱变或基因工程获得的产量更高的营养缺陷型、耐药变异型和代谢变异型微生物。对于基因工程获得的性状改良的微生物来说，其中至关重要的就是性质优异的基因。

中国专利cn102234666a公开了一种流加发酵l-赖氨酸的方法，其中利用了酶活性提高的吡啶核苷酸转氢酶。然而令人意外的是，本发明人经过长期艰苦研究，偶然地筛选出了新的吡啶核苷酸转氢酶突变体，其能进一步提高相应的酶活性并在相同条件下进一步提高赖氨酸的发酵量。尽管该突变体在微生物（尤其是棒状杆菌）中表达会带来对消泡剂的一定敏感性，但是结合本发明人未公开使用的发酵罐，可以避免消泡剂的使用，所以完全能够利用其优点，而避免其缺点的影响。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于提供新的流加发酵l-赖氨酸的方法，其包括将包括将表达吡啶核苷酸转氢酶变体的工程菌接入第一发酵罐于培养并将获得的培养液接种于第二发酵罐培养，然后向第二发酵罐持续流加糖，之后再向第二发酵罐持续流加糖和氮源,其中吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的氨基酸序列如seqidno:2所示，和，其中吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体的氨基酸序列如seqidno:3所示。另外，本发明还提供了所述方法生产中所用的设备，如发酵罐等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了持续流加发酵l-赖氨酸的方法，其包括：

（1）将表达吡啶核苷酸转氢酶变体的工程菌接入第一发酵罐于31-38℃培养10-20小时，其中所述吡啶核苷酸转氢酶变体由吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体组成，其中吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的氨基酸序列的第37位为met；

（2）将步骤（1）获得的培养液以3-7%（体积）的接种量接种于第二发酵罐，于36-40℃培养3-8小时；

（3）向第二发酵罐持续流加糖，其中糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.2-0.35%（重量），进行10-18小时；和

（4）向第二发酵罐持续流加糖和氮源，其中糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.3-0.5%（重量），而且氮源的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.1-0.25%（重量），进行30-65小时，优选50-55小时。

在本文中，“第一”和“第二”在修饰发酵罐的时候，是为了区分所修饰的发酵罐，即第一发酵罐和第二发酵罐是不同的，但是不对发酵罐本身结构进行限定。在本文中，接种量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以体积百分比表示的时候，指的是菌体培养液（接入的菌液）体积相对于被接入的培养基体积的百分比量。

优选在本发明第一方面的方法中，第一发酵罐中的培养基配方为：每18立方米培养基中含，葡萄糖500-750公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米浆400-600公斤，kh2po430-80公斤，mgso4·7h2o3-15公斤，feso4·7h2o0.1-1公斤，mnso4·7h2o0.1-1公斤，生物素5-30克，和叶酸3-10克。在本发明的具体实施方式中，第一发酵罐中的培养基配方为：每18立方米培养基中含，葡萄糖600公斤，甘蔗糖蜜200公斤，玉米浆520公斤，kh2po445公斤，mgso4·7h2o7公斤，feso4·7h2o0.5公斤，mnso4·7h2o0.5公斤，生物素12克，和叶酸5克。

优选在本发明第一方面的方法中，第二发酵罐的培养基配方为：每315立方米培养基中含，葡萄糖10000-15000公斤，甘蔗糖蜜50-3000公斤，玉米浆10000-15000公斤，kh2po4700-1200公斤，mgso4·7h2o5-220公斤，feso4·7h2o5-25公斤，mnso4·7h2o5-220公斤，生物素150-300克，和叶酸50-120克。在本发明的具体实施方式中，第二发酵罐的培养基配方为：每315立方米培养基中含，葡萄糖12000公斤，甘蔗糖蜜1000公斤，玉米浆12000公斤，kh2po41000公斤，mgso4·7h2o100公斤，feso4·7h2o12，mnso4·7h2o120公斤，生物素200克，和叶酸85克。

步骤（3）和（4）的部分培养条件（如，温度，ph等）与步骤（2）的可以相同也可以不同。优选步骤（3）和（4）中的温度与步骤（2）中的温度相同，即均为36-40℃，优选均为38-39℃。步骤（2）中，不进行流加操作；而在步骤（3）和（4）中，ph维持在6.5至7.8之间，这可以简单地通过流加碱或酸来实现。

在本文中，流加量具有本领域技术人员所能常规理解的含义，具体在以重量百分比表示的时候，指的是加入物质的重量占被加入物质（如，培养液）的重量的百分比量。优选在本发明第一方面的方法中，步骤（3）和（4）中的糖是葡萄糖。在步骤（3）中，葡萄糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.2-0.35%（重量），优选为0.27-0.33%（重量）。在步骤（4）中，葡萄糖的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.3-0.5%（重量），优选为0.42-0.48%（重量）。

优选在本发明第一方面的方法中，步骤（4）中的氮源是无机氮源，优选是硫酸铵或氯化铵，如硫酸铵。在步骤（4）中，硫酸铵的每小时流加量为第二发酵罐内培养液量的0.1-0.25%（重量），优选为0.17-0.23%（重量）。

在本发明中，野生型吡啶核苷酸转氢酶是本领域技术人员所知晓的，包括α亚基和β亚基，其中α亚基和β亚基的序列分别如ncbi（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）蛋白和基因登录号np416120.1和aac74674.1所示。另外，中国专利cn102234666a公开了一种酶活性提高的吡啶核苷酸转氢酶

优选本发明第一方面的方法中，所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体，即编码吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的多核苷酸位于编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体的多核苷酸的上游。在本发明的具体实施方式中，所述多核苷酸的核苷酸序列如seqidno:1所示。

其中，所述吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的氨基酸序列的第37位为met，即发生了37m突变，优选其氨基酸序列如seqidno:2所示。另外，在本发明的具体实施方式中，所述吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体的氨基酸序列如seqidno:3所示。

所述多核苷酸可以通过各种本领域技术人员所熟知的方式被导入产l-赖氨酸的菌，只要能够使产l-赖氨酸的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶变体即可。所述多核苷酸可以直接被导入，例如利用微粒体、基因枪等导入细胞；也可以间接被导入，例如可以通过构建在质粒载体上导入细胞。导入的所述多核苷酸可以整合在细胞的基因组上表达，也可以游离表达。优选本发明第一方面的方法中，工程菌是棒状杆菌。由于棒状杆菌本身不适于作为克隆宿主菌，因此优选所述多核苷酸是通过穿梭质粒导入棒状杆菌的。其中，所述穿梭质粒优选是大肠杆菌和棒状杆菌的穿梭质粒。这样便能够很方便地在大肠杆菌宿主中进行dna重组操作。在本发明的具体实施方式中，工程菌是corynebacteriumglutamicum。

优选本发明第一方面的方法中，第二发酵罐是本发明第三方面的发酵罐。优选其中，罐体（1）内的培养液的液面处于旋转盘（6）和旋转杆（7）之间。配合使用本发明第三方面的发酵罐，本发明第一方面的方法可以避免消泡剂的使用，从而使得上述工程菌有效发挥其作用。

在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的方法中所用的产品。例如，本发明提供了吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体，其氨基酸序列的第37位为met，优选其氨基酸序列如seqidno:2所示。

本发明还提供了编码该吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的核酸及包含该核酸的载体和菌种等。

在第三方面，本发明提供了本发明第一方面的方法中所用的设备及其部件。例如，本发明提供了发酵罐，其包括罐体（1）、能封闭罐体（1）的罐盖（2）和旋转轴（31），其中，

罐盖（2）上带有加料管（4），用于向罐体（1）内加入流体；加料管（4）带有阀门（41）；

罐体（1）内由上自下依次包括漏斗（5）、旋转盘（6）和旋转杆（7），其中旋转盘（6）水平设置于罐体（1）的上部，旋转杆（7）水平设置于罐体（1）的中部；

漏斗（5）的上部能承接从加料管（4）加入的流体，下部开口对准旋转盘（6）的上表面的开口并深入旋转盘（6）的内腔至旋转盘（6）上下表面间的中部（优选是一半高度处）；

旋转盘（6）的内腔中沿旋转盘（6）的侧表面环形设置筛网（62），筛网（62）垂直设置在旋转盘（6）的下表面上并延伸至旋转盘（6）上下表面间的上部（优选是4/5高度处）；

旋转盘（6）的内腔的筛网（62）内设置有多根扰流柱（61），每根扰流柱（61）垂直设置在旋转盘（6）的下表面上并延伸至旋转盘（6）上下表面间的中部或上部（优选是2/3高度处）；

旋转盘（6）的侧表面均匀设置多个孔，每个孔连接一根旋转盘（6）的侧表面外设置的离心排液管（63）（优选离心排液管（63）是柔性伸缩的），用于将旋转盘（6）的内腔内的流体排出（优选从离心排液管（63）的开口向下的开口（631）处排出）；

旋转杆（7）上均匀垂直设置有多根栅（71）；

旋转轴（31）从罐盖（2）上通入罐体（1）内并与旋转盘（6）的下表面中心点和旋转杆（7）的中心点固定，从而旋转轴（31）旋转时带动旋转盘（6）和旋转杆（7）旋转。

在本文中，为了清楚起见，术语“上部”指的是物体上下底面之间或上底面中的最高点和下底面中的最低点之间的高度的最上面的1/3部分；术语“下部”指的是物体上下底面之间或上底面中的最高点和下底面中的最低点之间的高度的最下面的1/3部分；术语“中部”为上部最低点和下部最高点之间的1/3部分。

本发明的旋转盘（6），其为带内腔的盘形结构，即其包括圆形的上表面、圆形的下表面、环形的侧表面以及由这三个表面围成的内腔。

上表面带有开口。这样可以让流体通过漏斗（5）或者管道流入内腔。下表面不带有孔或开口，其中心点能固定在旋转轴（31）上，从而在旋转轴（31）的旋转下带动整个旋转盘（6）旋转。侧表面均匀设置多个孔，每个孔连接一根旋转盘（6）的侧表面外设置的离心排液管（63）（优选离心排液管（63）是柔性伸缩的），用于将旋转盘（6）的内腔内的流体排出（优选从离心排液管（63）的开口向下的开口（631）处排出）。内腔中沿旋转盘（6）的侧表面环形设置筛网（62），筛网（62）垂直设置在旋转盘（6）的下表面上并延伸至旋转盘（6）上下表面间的上部（优选是4/5高度处）。筛网（62）内设置有多根扰流柱（61），每根扰流柱（61）垂直设置在旋转盘（6）的下表面上并延伸至旋转盘（6）上下表面间的中部或上部（优选是2/3高度处）。

优选本发明的旋转盘（6）包括圆形的上表面、圆形的下表面、环形的侧表面以及有这三个表面围成的内腔，其中，

上表面带有开口；

侧表面均匀设置多个孔，每个孔连接一根旋转盘（6）的侧表面外设置的离心排液管（63）（优选离心排液管（63）是柔性伸缩的），用于将旋转盘（6）的内腔内的流体排出（优选从离心排液管（63）的开口向下的开口（631）处排出）；

内腔中沿旋转盘（6）的侧表面环形设置筛网（62），筛网（62）垂直设置在旋转盘（6）的下表面上并延伸至旋转盘（6）上下表面间的上部（优选是4/5高度处）；

筛网（62）内设置有多根扰流柱（61），每根扰流柱（61）垂直设置在旋转盘（6）的下表面上并延伸至旋转盘（6）上下表面间的中部或上部（优选是2/3高度处）。

本发明的旋转杆（7），其上均匀垂直设置有多根栅（71）。

本发明还可以提供本发明的旋转盘（6）和本发明的旋转杆（7），尤其是从上到下设置的本发明的旋转盘（6）和本发明的旋转杆（7），联合在制备发酵罐（如用于赖氨酸发酵的发酵罐）中的应用。

优选在本发明第三方面的发酵罐中，罐体（1）底面呈倒锥形，锥形顶点设置有孔，该孔连接有带有阀门（111）的排料管（11）。

也优选在本发明第三方面的发酵罐中，多根扰流柱（61）呈十字形围绕旋转盘（6）的下表面中心点分布；和/或，扰流柱（61）的高度低于筛网（62）的高度。

本发明具有以下有益效果：吡啶核苷酸转氢酶变体能提高赖氨酸产量；设备上的改进使得表达该吡啶核苷酸转氢酶变体的工程菌的发酵过程中能避免对其有害的物质的添加；可以适用现有的发酵过程和参数，生产中的改动小。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1显示了本发明的发酵罐的垂直截面图。

图2显示了本发明的发酵罐中的旋转盘（部件）的横截面图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南（第3版）》（科学出版社）、《微生物学实验（第4版）》（高等教育出版社）以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。

实施例1新的吡啶核苷酸转氢酶变体的发现

在对本公司菌种进行诱变筛选试验中，发现一株棒状杆菌工程菌的诱变体的赖氨酸发酵水平有显著上升，对其可能的12个赖氨酸代谢途径上的靶位进行pcr扩增并进行测序比较，发现其中原先导入的吡啶核苷酸转氢酶变体基因发生了新的突变，相应核苷酸序列如序列表的seqidno:1所示，顺序编码了如seqidno:2和seqidno:4所示的两个吡啶核苷酸转氢酶亚基变体的完整orf，其中第37位ser突变为met。然后，用如序列表的seqidno:6所示（引入了ecori内切酶位点）的正向引物和如序列表的seqidno:7所示（引入了xbai内切酶位点）的反向引物以94°c变性30秒、63°c退火60秒并72°c延伸30秒进行35个循环，对该带有新突变的基因进行pcr扩增。约2.9kb大小的pcr扩增产物用琼脂糖凝胶电泳回收，用ecori和xbai双酶切，与经这两个内切酶酶切的pms2质粒（可购自美国典型微生物保藏中心（atcc），商品编号atcc67189）用t4dna连接酶进行连接，并转化入大肠杆菌top10f’中，挑出阳性克隆，抽提出其中的质粒，测序验证正确。该构建的质粒命名为pms2-cispntm37，相应的大肠杆菌转化株命名为e.coli-cispntm37。

根据转氢酶活性测定方法（可参见clarkedm等.cloningandexpressionofthetranshydrogenasegeneofescherichiacoli.j.bacteriol.,162:367-373），对转化有pms2-cispntm37质粒的e.coli-cispntm37菌株与作为对照的阴性top10f’菌株分别测定转氢酶活性，发现的e.coli-cispntm37菌株的酶比活性比阴性top10f’菌株的酶比活性提高了215%，也较现有的转化有pms2-cispnt质粒的e.coli-cispnt菌株的酶比活性高了32%。

然后，通过电转化法将pms2-cispntm37质粒转入l-赖氨酸发酵的棒状杆菌工程菌（可购自美国典型微生物保藏中心（atcc），商品编号atcc31269）中，同时将pms2-cispnt质粒电转化入l-赖氨酸发酵的棒状杆菌工程菌，形成对照菌。将上述电转化的阳性棒状杆菌工程菌和对照菌分别在液体lb培养基中振荡培养至od500达到0.5，以5%的接种量接入赖氨酸发酵培养基（每升培养基配方为：40g蔗糖，20gnh4cl，2gcacl2,1gkh2po4，1g蛋白胨,500mgmgso4·7h2o,15mgfeso4·7h2o,10mgmnso4·7h2o,200μg生物素,和50μg叶酸，用tris-hcl调节至ph7.3）中以30℃振荡（150rpm）培养72小时。离心收集培养基上清液（即，发酵液），用纸层析法分离并定量培养基中的l-赖氨酸。结果发现，阳性棒状杆菌工程菌的发酵培养基中l-赖氨酸的含量达到了16.5g/l，而现有的对照菌的发酵培养基中l-赖氨酸的含量仅为14.8g/l，表明新的突变能够使产量提高了11.5%。

实施例2免用消泡剂的发酵罐

如图1和图2所示，本发明的发酵罐包括罐体1、能封闭罐体1的罐盖2和旋转轴31，其中，

罐盖2上带有加料管4，用于向罐体1内加入流体；加料管4带有阀门41；

罐体1内由上自下依次包括漏斗5、旋转盘6和旋转杆7，其中旋转盘6水平设置于罐体1的上部，旋转杆7水平设置于罐体1的中部；

漏斗5的上部能承接从加料管4加入的流体，下部开口对准旋转盘6的上表面的开口并深入旋转盘6的内腔至旋转盘6上下表面间的一半高度处，从而能将流体稳定地输送入旋转盘6的内腔中；

旋转盘6的内腔中沿旋转盘6的侧表面环形设置一圈筛网62，筛网62垂直设置在旋转盘6的下表面上并延伸至旋转盘6上下表面间的4/5高度处；

旋转盘6的内腔的筛网62内设置有12根扰流柱61，每根扰流柱61垂直设置在旋转盘6的下表面上并延伸至旋转盘6上下表面间的2/3高度处，这12根扰流柱61呈十字形围绕旋转盘6的下表面中心点分布，十字形的每一分支上有3根；

旋转盘6的侧表面均匀设置45个孔，每个孔连接一根旋转盘6的侧表面外设置的可柔性伸缩的离心排液管63，用于将旋转盘6的内腔内的流体排出；

离心排液管63是柔性可伸缩的，在旋转盘6旋转时受离心力的作用时能与旋转盘6平行并伸长，而且此时离心排液管63的远离旋转盘6的侧表面一侧的开口631向下；

旋转杆7上均匀垂直设置24根栅71；

旋转轴31的一端连接罐体1外的电动机3，另一端从罐盖2上通入罐体1内并与旋转盘6的下表面中心点和旋转杆7的中心点固定，从而在电动机3启动时带动旋转轴31旋转，旋转轴31旋转时带动旋转盘6和旋转杆7旋转；

罐体1底面呈倒锥形，锥形顶点设置有孔，该孔连接有带有阀门111的排料管11。

该发酵罐不但集加料、排料、排气和搅拌等于一体，而且当罐体1内的发酵液液面处于旋转盘6和旋转杆7之间时，能有效避免液面的泡沫产生，可以在无需添加消泡剂的情况下进行发酵。

实施例3l-赖氨酸的流加发酵实例1

将实施例1的转化有pms2-cispntm37质粒的棒状杆菌工程菌以0.5%的接种量接入20立方米发酵罐（其中的培养基配方为：葡萄糖600公斤，甘蔗糖蜜200公斤，玉米浆520公斤，kh2po445公斤，mgso4·7h2o7公斤，feso4·7h2o0.5公斤，mnso4·7h2o0.5公斤，生物素12克，和叶酸5克，用水定容至18立方米），于35℃饱和通气培养15小时，提高菌体密度。

然后，将20立方米发酵罐的培养液直接注入实施例2所示的350立方米发酵罐（其中的培养基配方为：葡萄糖12000公斤，甘蔗糖蜜1000公斤，玉米浆12000公斤，kh2po41000公斤，mgso4·7h2o100公斤，feso4·7h2o12公斤，mnso4·7h2o120公斤，生物素200克，和叶酸85克，用水定容至315立方米），于38℃饱和通气培养5小时。然后，每小时流加1000公斤葡萄糖，持续15小时，期间排出蒸汽以保持体积；之后，每小时流加1500公斤葡萄糖和650公斤硫酸铵，持续发酵50小时，期间排出蒸汽以保持体积。流加期间，加入naoh和浓盐酸使ph维持在6.5至7.8之间，即低于低限时加碱，高于高限时加酸。流加时，可以放出1立方米培养液溶解100公斤葡萄糖或硫酸铵，流加入。发酵完毕，薄层层析检测其中产l-赖氨酸109g/l，在工业应用中较现有的pms2-cispnt在同等条件下的产量进一步提升了。

实施例4l-赖氨酸的流加发酵实例2

基本同实施例3，所不同的是，将20立方米发酵罐的培养液直接注入实施例2所示的350立方米发酵罐，于39℃饱和通气培养3小时。然后，每小时流加1100公斤葡萄糖，持续15小时；之后，每小时流加1500公斤葡萄糖和700公斤硫酸铵，持续发酵55小时，薄层层析检测其中产l-赖氨酸142g/l，较现有的pms2-cispnt在同等条件下的产量进一步提升了。

实施例5l-赖氨酸的流加发酵实例3

基本同实施例3，所不同的是，将实施例1的转化有pms2-cispntm37质粒的棒状杆菌工程菌以0.5%的接种量接入20立方米发酵罐，于31℃饱和通气培养18小时。最终薄层层析检测其中产l-赖氨酸120g/l，较现有的pms2-cispnt在同等条件下的产量进一步提升了。

序列表

<110>宁夏伊品生物科技股份有限公司

<120>赖氨酸的发酵中所用的设备和部件

<160>5

<210>1

<211>2922

<212>dna

<213>artificial

<223>吡啶核苷酸转氢酶变体基因构建体

<400>1

atgcgaattggcataccaagagaacggttaaccaatgaaacccgtgttgcagcaacgcca60

aaaacagtggaacagctgctgaaactgggttttaccgtcgcggtagagatgggcgcgggt120

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