呼吸道病原体快速荧光PCR检测试剂盒及其引物探针组合的制作方法

本发明公开一种呼吸道病原体快速荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合，属于生物技术应用领域。

背景技术：

呼吸道感染是世界范围内最常见的疾病之一，发病率在各国居民发病率总体结构中占据主要地位,每年的流行高峰期约有10％的居民患有呼吸道感染。造成呼吸道感染的主要由各种呼吸道病毒以及一些细菌、支原体、衣原体。病毒中常见的是甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、人博卡病毒、呼吸道腺病毒、鼻病毒等。这些呼吸道病毒大都具有很强的感染力而且传播快、潜伏期短、发病急。并且有越来越多的新的致病性呼吸道病毒被发现，给口岸检验检疫机构预防和控制造成极大的困难。而且由于近些年，呼吸道病毒所引发的疫情不断发生，一些呼吸道病毒如甲型流感病毒、呼吸道腺病毒以及不断变异的新型病毒所导致爆发的疫情成为公共卫生领域面临的一个重要的问题,带来了很大的经济损失及社会危害。

对呼吸道病毒的实验室检测还很大程度依赖传统分离培养和生化鉴定，敏感性低、费时费力，需要一周左右才能完成，难以达到暴发流行时快速检测的要求，而且有的病原体目前还没有合适的细胞体系和动物模型进行培养。当然，也有一些免疫学方法也被广泛的应用到呼吸道病毒的检测,但其敏感性低，假阴性率高，容易造成漏检，难以达到快速检测的要求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种呼吸道病原体快速荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合，来解决现有技术中呼吸道发热病原体检测灵敏度低、检测周期长、检测通量低的问题。

为了实现上述目的，发明的技术方案如下：本发明公开了一种呼吸道病原体快速荧光pcr检测试剂盒，包括扩增芯片和对照试剂，所述的扩增芯片由预分装并冻干在微流控芯片孔内的检测试剂构成；所述的对照试剂包含阴性对照和阳性对照；

所述的检测试剂包括成分为rt-pcr反应液，成分为buffer、2.0mmdntps、1u/μltaqdna聚合酶，2u/μlm-mlv反转录酶，0.3u/μlrri和9种呼吸道病原体16个型别检测引物探针。

本发明相比现有技术具有以下优点：

1、快速便捷、无污染，试剂盒采用试剂预分装技术，将每种病原体检测的pcr反应mix预分装于微流体反应孔中，扩增时仅需加入核酸模板，扩增结束后根据相应孔内有无荧光信号判断是否有相应病原体感染。

2、准确性好、灵敏度高，采用taqman探针法荧光定量pcr检测，所有致病菌均根据其特异性基因设计引物探针，保证检测结果的可靠性；化学热启动dna聚合酶具有低温抑制，耐高温扩增能力，检测灵敏度高，最低检测限为10³copies/ml。

3、通量大，一次扩增可筛选9种呼吸道病原体的16个型别，检测通量大。

4、快速，采用快速cdna合成的反转录酶和快速聚合延伸的taqdna聚合酶，配套微流体快速实时荧光pcr仪器可在30min内实现病原体扩增检测副流感病毒(hpiv1/2/3/4)、冠状病毒(nl63/oc43/229e/hku1/mers-cov)、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、人博卡病毒和鼻病毒。

本发明试剂盒采用试剂冻干预分装方法将9种呼吸道病原体的16个型别检测引物探针混合液预分装于16孔道微流体扩增管中，结合快速微流控实时荧光pcr扩增仪进行扩增检测，可一次性筛查与呼吸道发热症状相关的9种传染病16个型别，解决了口岸突发呼吸道传染病应急过程中对传染病的及时控制和消除，防止突发呼吸道传染病进一步扩散，有效开展突发传染病感染卫生防控工作，为国境安全保驾护航。

附图说明

图1为试剂盒检测甲型流感病毒灵敏度结果；

图2为试剂盒检测乙型流感病毒灵敏度结果；

图3微流控芯片pcr仪器运行程序界面图。

具体实施方式

本发明公开一种口岸常发的9种呼吸道病原体快速荧光pcr检测试剂盒及其引物、探针组合，涵盖口岸常发的呼吸道病原体类别。9种呼吸道病原体包含甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒(hpiv1/2/3/4)、冠状病毒(nl63/oc43/229e/hku1/mers-cov)、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、人博卡病毒和鼻病毒；试剂盒由微流体芯片和rt-pcr(扩增)反应液组成，试剂盒采用扩增试剂预分装后冻干。其中，微流体芯片含有16个反应孔，每孔可检测一种病原体型别，由相应的病原体检测引物探针和内参基因引物探针(或者叫内标基因检测引物探针)构成，rt-pcr(扩增)反应液由buffer、mg²⁺、dntps、taqdna聚合酶、反转录酶m-mlv、rna酶抑制剂rri和引物探针构成。所述的taqdna聚合酶和反转录酶m-mlv分别具有快速聚合延伸和快速反转录的功能；所述的病原体和内标检测探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。利用本发明的试剂盒可对口岸入境发热人员疑似感染呼吸道病原体感染的快速检测，具有通量大、检测周期短、灵敏度高、检测结果准确可靠等优点。

以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。

实施例1扩增体系优化，以甲型流感病毒为例

一、引物浓度优化

pcr体系中，引物浓度过高可能会引发错配，导致非特异扩增，而浓度过低时，会影响pcr产物的生成，因此有必要对引物浓度进行优化。在实验中，我们设置了3个不同引物浓度，用质粒菌(1×10⁵copies/ml和1×10³copies/ml)及阴性对照作为检测样本，模板用量为3μl，每个反应体系终体积均为10μl，检测不同浓度的扩增差异。当引物浓度低时，扩增效率稍差，而且荧光响应强度也较低。当flua基因引物(10μmol/l)用量为1.0μl以上时，其扩增效率无显著差异。综合考虑，选用1000nmol/l作为引物终浓度。

表2-1ss基因引物浓度的确定

二、探针浓度优化

荧光探针是整个定量pcr体系的核心，直接影响着荧光pcr检测结果的好坏。在实验中共设置了三个浓度进行比较。用flua质粒菌(1×10⁵copies/ml和1×10³copies/ml)及阴性对照作为检测样本，模板用量为3μl，每个反应体系终体积均为10μl。实验结果见下表3-1，不同的探针浓度对ct值和荧光高度有影响，当flua基因荧光探针(10μmol/l)用量为0.5μl时整体能达到理想的试验效果。

表2-2ev71探针的浓度对荧光pcr检测的影响

三、热启动taq酶用量的优化

热启动taq酶是pcr反应中的重要成份，其用量多少直接影响到pcr的扩增效率，因此本次实验配制了4种不同热启动taq酶用量的pcr反应液，热启动taq酶用量分别是1.5u/人份，2.0u/人份，2.5u/人份，3.0u/人份；用flua基因质粒菌(1×10⁵copies/ml和1×10³copies/ml)和阴性对照作为检测样本，模板用量为5μl,每个反应体系终体积均为25μl。实验结果表明，适当增加热启动taq酶的用量有利于pcr扩增检测，每个体系中加入1.0u/人份体系热启动taq酶就能达到较为理想的扩增效果，见表2-3。

表2-3热启动taq酶用量对ss扩增效率的影响

四、反转录酶m-mlv用量优化

逆转录酶(m-mlv)用量多少直接影响到转录效率。因此本实验配制了4种不同m-mlv用量的pcr反应液，m-mlv用量分别是10u/人份，15u/人份，20u/人份，25u/人份；用flua质粒菌(1×10⁵copies/ml和1×10³copies/ml)和阴性对照作为检测样本，模板用量为3μl，每个反应体系终体积均为10μl。实验结果表明，适当增加m-mlv的用量有利于pcr扩增检测，每个体系中加入15u/人份体系m-mlv就能达到较为理想的扩增效果，见表2-4。

表2-4m-mlv用量对flua扩增效率的影响

实施例2呼吸道传染病检测操作规范

一、核酸提取

1.1核酸提取：试剂盒配套dna/rna一步裂解提取试剂，采用200μl血清或者咽拭子样本加入50ul裂解液，95℃2min后5000rpm离心2min，取50μl上清作为模板，具体提取步骤请参照相应提取试剂盒说明书。

二、试剂准备

2.1根据待检样品数量(n)，取出相应数目的16孔芯片版，阴阳性对照试剂，于室温融化后简短离心；

2.2将上述16孔芯片版移至样本处理区。

三、加样

用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样本上清50μl分别加到装有pcr反应液的16孔pcr反应微孔板的加样孔中，每孔自动移入3μl模板；

四、扩增检测

4.1将pcr反应管放入荧光pcr扩增仪中进行扩增检测，；

4.2循环参数设定：(v280)：

50℃5min；95℃8s；95℃7s，60℃14s，40个循环；

4.3选择fam和cy5通道进行荧光检测

以上显示和描述了发明的基本原理、主要特征和发明的优点。本行业的技术人员应该了解，发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是发明的原理，在不脱离发明精神和范围的前提下发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的发明的范围内。发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110>南通国际旅行卫生保健门诊部

<120>9种呼吸道病原体快速荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合

<140>

<141>

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<223>用于检测甲型流感病反向引物

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<212>dna

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<223>用于检测甲型流感病寡核苷酸探针

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<223>用于检测乙型流感病毒正向引物

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<223>用于检测乙型流感病毒反向引物

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<223>用于检测乙型流感病毒寡核苷酸探针

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<223>用于检测副流感病毒1型反向引物

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<223>用于检测副流感病毒1型寡核苷酸探针

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<223>用于检测副流感病毒2型反向引物

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<223>用于检测副流感病毒2型寡核苷酸探针

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<212>dna

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<223>用于检测副流感病毒3型正向引物

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<223>用于检测副流感病毒3型反向引物

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<212>dna

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<223>用于检测副流感病毒3型寡核苷酸探针

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<223>用于检测副流感病毒4型反向引物

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<223>用于检测副流感病毒4型寡核苷酸探针

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<223>用于检测冠状病毒nl63反向引物

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<223>用于检测冠状病毒nl63寡核苷酸探针

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<223>用于检测冠状病毒oc43反向引物

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<223>用于检测冠状病毒oc43寡核苷酸探针

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<223>用于检测冠状病毒229e寡核苷酸探针

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<223>用于检测冠状病毒hku1反向引物

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<223>用于检测中东呼吸综合症mers-cov反向引物

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<223>用于检测中东呼吸综合症mers-cov寡核苷酸探针

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<223>用于检测呼吸道合胞病毒正向引物

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<223>用于检测呼吸道合胞病毒反向引物

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<223>用于检测呼吸道合胞病毒寡核苷酸探针

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<223>用于检测呼吸道腺病毒正向引物

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<223>用于检测呼吸道腺病毒反向引物

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<223>用于检测呼吸道腺病毒寡核苷酸探针

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tacatgcacatcgccgg

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<223>用于检测人偏肺病毒正向引物

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<223>用于检测人偏肺病毒反向引物

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cctatytctgcagcatatttgtaatc

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<213>人工序列

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<223>用于检测人偏肺病毒寡核苷酸探针

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caachgcagtgacaccytcatcattgca

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<223>用于检测人博卡病毒正向引物

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gaagagacactggcagacaac

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<223>用于检测人博卡病毒反向引物

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<223>用于检测人博卡病毒寡核苷酸探针

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<223>用于检测鼻病毒正向引物

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<223>用于检测鼻病毒反向引物

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<223>用于检测人内参基因β-actin基因正向引物

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<223>用于检测人内参基因β-actin基因反向引物

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<223>用于检测人内参基因β-actin基因寡核苷酸探针

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序列表

<110>南通国际旅行卫生保健门诊部

<120>呼吸道病原体快速荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

aattttcctkgcatctgtttg21

<210>18

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

tcyaacatcctrccctgctgcttgt25

<210>19

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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attcccaggaatcttgtcccta22

<210>20

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

ctttaggaggcaaatcaacacg22

<210>21

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cgccaacgctcttgaacattcc22

<210>22

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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accgtatgctaaagaccag19

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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cctcatcgctacttgggtcc20

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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ctgatgtcaataccccggctg21

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tgaaggtgttgtctgggttgct22

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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gattgaagtgtggtatctctg21

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<212>dna

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cttgcgcctaacaccgtaacc21

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<211>21

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<212>dna

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