本发明涉及一种内生真菌次生代谢产物，具体涉及一种木麻黄内生真菌抗细菌和/或抗氧化活性次生代谢产物的制备方法和用途。
背景技术：
木麻黄(casuarinaspp.)，属木麻黄科(casuarinaceae)木麻黄属(casuarina)，常绿乔木或灌木，原产于澳大利亚、太平洋诸岛以及亚洲东南部。木麻黄由于生长迅速、耐干旱、防风固沙、耐盐碱和生物固氮等特殊功能，广泛用于热带和亚热带地区沿海防护林的建设，是我国东南沿海和华南地区不可替代的防护林树种，同时也是重要的经济林和园林绿化树种。
近年来，由于沿海木麻黄树种单一，缺少抗病品种以及自然灾害等因素的影响，木麻黄青枯病的发生日趋严重，严重制约沿海木麻黄防护林的发展，对我国东南沿海的生态环境和生态安全构成严重的威胁。木麻黄青枯病是危害木麻黄最严重的一种细菌性土传病害，作为木麻黄的“癌症”，目前尚无有效的防治方法，而且无对木麻黄内生真菌次生代谢产物的研究。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种木麻黄内生真菌抗细菌和/或抗氧化活性次生代谢产物的制备方法和用途，该方法和用途解决了目前尚无对木麻黄内生真菌次生代谢产物的研究以及对木麻黄青枯病的防治的问题，能够从木麻黄内生真菌中获得具有抗细菌和/或抗氧化活性的次生代谢产物，并获得具有抗木麻黄青枯病菌的次生代谢产物，以用于木麻黄青枯病的防治。
为了达到上述目的，本发明提供了一种木麻黄内生真菌抗细菌和/或抗氧化次生代谢产物的制备方法，该方法包含：
(1)采用组织块分离法从木麻黄中分离内生真菌；
(2)将分离的内生真菌采用大米固体培养基中进行发酵；
(3)待发酵结束，发酵产物用乙酸乙酯和丙酮的混合液冷浸提取，将提取液减压浓缩得到木麻黄内生真菌次生代谢产物；
(4)采用薄层层析-生物自显影法从中筛选具有抗细菌和/或抗氧化活性的次生代谢产物。
其中，具有抗细菌活性次生代谢产物的内生真菌菌株包含：pseudofusicoccumardesiacum、botryosphaeriasp.。
其中，具有抗氧化活性次生代谢产物的内生真菌菌株包含：botryosphaeriasp.。
优选地，在步骤(1)中，洗净木麻黄枝条和果实，用70％乙醇处理，用0.2％氯化汞处理，用无菌水冲洗，置于无菌滤纸上晾干；去除表皮，将枝条分成大小一致的块段，放在pda培养基平板上，在28℃恒温黑暗培养，待内生真菌长出后，从每个菌落的边缘挑取一小段菌丝接种到pda培养基上，连续纯化多次，至菌落形态一致。
优选地，所述pda培养基平板上含500μg/ml的硫酸链霉素。
优选地，所述70％乙醇处理30s，所述0.2％氯化汞处理20min。
优选地，在步骤(1)中，所述鉴定采用its序列测定方法，将测得的内生真菌的rdna-its序列与现有内生真菌对比，以确定内生真菌的种类。
优选地，在步骤(2)中，采用大米固体培养基进行发酵，发酵温度为28℃，发酵时间为60d。
优选地，在步骤(3)中，采用乙酸乙酯和丙酮的混合液进行冷浸提取，冷浸时间为7d。
本发明还提供了一种木麻黄内生真菌抗细菌和/或抗氧化活性次生代谢产物的用途，木麻黄内生真菌的次生代谢产物具有抗细菌和/或抗氧化活性，用于抗细菌和/或清除自由基。
其中，具有抗细菌活性次生代谢产物的内生真菌菌株包含：pseudofusicoccumardesiacum、botryosphaeriasp.。
具有抗氧化活性次生代谢产物的内生真菌菌株包含：botryosphaeriasp.。
优选地，所述pseudofusicoccumardesiacum、botryosphaeriasp.对根癌土壤杆菌、大肠杆菌、青枯病菌、黄瓜角斑病菌、番茄疮痂病菌、枯草芽孢杆菌和溶血葡萄球菌均表现出抑制作用；所述botryosphaeriasp.能够作为抗木麻黄青枯病的生防菌。
优选地，所述botryosphaeriasp.抗氧化活性的ic50值小于1mg/ml。
本发明的木麻黄内生真菌抗细菌和/或抗氧化活性次生代谢产物的制备方法和用途，解决了目前尚无对木麻黄内生真菌次生代谢产物的研究以及对木麻黄青枯病的防治的问题，具有以下优点：
本发明的方法能够从木麻黄内生真菌中获得具有抗氧化和/或抗菌活性的次生代谢产物，并获得具有抗木麻黄青枯病菌的次生代谢产物，以用于木麻黄青枯病的防治。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1木麻黄内生真菌的分离和鉴定
(1)木麻黄内生真菌的分离
将木麻黄枝条和果实用清水洗净，用70％乙醇处理30s后，再用0.2％氯化汞处理20min，最后用无菌水冲洗3次，每次5min，置于无菌滤纸上晾干。去除表皮后，将枝条分成约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的块段，放在pda培养基平板上(含500μg/ml的硫酸链霉素，硫酸链霉素购自美国sigma公司，99％)，3块/皿，在28℃，恒温培养箱内暗培养，待内生真菌长出后，从每个菌落的边缘挑取一小段菌丝接种到pda培养基上，连续纯化多次，至菌落形态一致为止。4℃保存，备用。
(2)木麻黄内生真菌的鉴定
(2.1)生物学鉴定
将内生真菌菌株接种于pda(potatodextroseagar，马铃薯葡萄糖琼脂)平板上，28℃恒温培养5～10d，观察、记录菌落形态并拍照，在光学显微镜下观察菌丝和产孢情况。
从木麻黄枝条和果实中共分离得到12株形态各异的内生真菌，分别命名为cef-1～cef-12。
木麻黄内生真菌菌落规则圆形，气生菌丝发达，多为白色，cef-6为灰色，cef-5边缘白色，中间灰色；除cef-3、cef-5和cef-6外，其他内生真菌生长迅速，尤其是cef-4，3天即可长满培养皿(直径为7.5cm)，后期在菌落表面产生淡绿色的霉层，为分生孢子。
光学显微镜下发现所有内生真菌菌丝均有隔膜，为有隔菌丝，但多数内生真菌未见产孢，通过形态学很难进行鉴定，因此采用分子生物学方法对筛选出的形态各异的内生真菌进行进一步鉴定。
(2.2)病原菌its序列鉴定
将纯化后的菌株(在pda生长5d)接种到pdb培养基中，然后28℃150rpm振荡培养5d，四层纱布过滤并用无菌水冲洗掉残留pdb，然后用滤纸吸干获得其菌丝。
用液氮将菌丝充分研磨至粉末状，采用试剂盒法(上海生工dna抽提取试剂盒)提取其dna。
扩增its序列的引物为：
its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′；
its5：5′-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3′。
反应体系为：pcr反应液总体积为50μl，其中2×taqpcrmastermix(含染料)25μl，上下游引物各1μl，dna模版3μl，双蒸水补足到50μl，混匀。
pcr扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存。
所得序列使用dnaman软件进行互补，将正向与反向引物互补序列两端加上引物序列拼接成完整序列，所得的rdna-its序列提交到genbank数据库(nationalcenterforbiotechnologyinformationwebsite[http://www.ncbi.nlm.nih.gov])，获得其登录号。
cef-1为：pseudofusicoccumardesiacum(genbank登录号：kx960802)；cef-2为：botryosphaeriasp.(genbank登录号：kx960803)；cef-3为：pestalotiopsissp.(genbank登录号：kx960804)；cef-4为：trichodermalixii(genbank登录号：kx960805)；cef-5为：aspergillussp.(genbank登录号：kx960806)；cef-6为：rhytidhysteronsp.(genbank登录号：kx960807)；cef-7为：pestalotiopsissp.(genbank登录号：kx960808)；cef-8为：phomopsissp.(genbank登录号：kx960809)；cef-9为：fusariumsp.(genbank登录号：kx960810)；cef-10为：botryosphaeriamamane(genbank登录号：kx960811)；cef-11为：colletotrichumgloeosporioides(genbank登录号：kx960812)；cef-12为：botryosphaeriadothidea(genbank登录号：kx960815)。cef-1～cef-12均为已知菌种。
实验例2内生真菌次生代谢产物的制备
内生真菌的发酵培养采用大米固体培养基。先将内生真菌菌株活化3～5d，采用马铃薯葡萄糖液体(pdb)培养基培养种子，将培养好的种子接入已灭菌的大米培养基中，培养温度为28℃，培养时间为60d。发酵产物用乙酸乙酯和丙酮的混合液冷浸提取3次，每次7d。将提取液减压浓缩得到其次生代谢产物，4℃保存备用。
实验例3内生真菌次生代谢产物的抗细菌活性的测定
供试细菌分别如下表1：
将次生代谢产物溶解，用直径为0.5mm的毛细管在薄层层析板上点样，点样量为5μl。采用二氯甲烷和甲醇作为展开剂进行薄层层析，薄层层析后在薄层板的一侧原点处点5μl浓度为0.2mg/ml的硫酸链霉素作为阳性对照。向灭菌的lb半固体培养基(琼脂浓度为0.5％)中加入一定量准备好的菌液(45mllb+5ml菌液)，将其浓度调至约108cfu/ml，振荡、均匀。用喷样器将制备好的菌悬液均匀喷洒到层析后的硅胶板上；待培养基在硅胶板上冷却后，将硅胶板置于培养皿中于4℃冰箱中放置4h，以利于抗菌成分的扩散；而后将培养皿置于28℃下保湿培养，12h后取出硅胶板，在其上均匀喷洒噻唑蓝(mtt，购自amresco公司)，约10min后即可观察实验结果。有抗菌活性成分处，供试细菌由于受到活性成分的抑制而出现抑菌斑；无抗菌活性成分处，供试细菌正常生长，mtt显色后显蓝色。通过抑菌斑的迁移率(即rf值)来初步评价样品中抗菌化合物的极性，根据抑菌斑的大小和多少来初步评价活性化合物的抑菌活性和数量。
表2cef-1～cef-12的抗细菌活性表
注：“－”表示无抗菌活性；“+”表示抗菌斑最大直径d＜5mm，“++”表示5mm≤d＜10mm，“+++”表示d≥10mm；阳性对照硫酸链霉素。
从上述表1可以看出，内生真菌cef-2的抑制活性最强，其次是内生真菌cef-1，抑菌斑直径在5-10mm之间，rf值为0.0-0.18。
实验例4内生真菌次生代谢产物的抗氧化活性的测定
用dmso配制浓度为100mg/ml的母液，然后采用倍半稀释法依次稀释成浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625mg/ml的样品溶液。阳性对照为bht，初始浓度为2.0mg/ml，采用倍半稀释法依次稀释成1mg/ml～0.03125mg/ml的阳性对照溶液。
向96微孔板中加入80μl浓度为0.2mg/ml的dpph无水乙醇溶液，而后加入20μl系列浓度的待测样品溶液或阳性对照溶液，震荡摇匀。在37℃下水浴30min，517nm下测定吸光值。以20μldmso溶液代替样品溶液作为空白对照，每个处理3个重复，以ic50值来表示内生真菌次生代谢产物的抗氧化能力，供试样品对dpph清除率的有效中浓度(ic50)计算公式如下：
所得数据作图分析，供试样品浓度取对数(x)，抑制率换算成机率值(y)，初步求得抗氧化活性的回归方程(y＝ax+b)和ic50。
其中，内生真菌cef-2的抗氧化活性最好，ic50值为0.80±0.01mg/ml，但仍弱于阳性对照bht(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，ic50值为0.18±0.00mg/ml)。
综上所述，本发明的木麻黄内生真菌抗细菌和/或抗氧化活性次生代谢产物的制备方法能够从木麻黄内生真菌中获得具有抗氧化和/或抗菌活性的次生代谢产物，并获得具有抗木麻黄青枯病菌的次生代谢产物，以用于木麻黄青枯病的防治。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。