一种检测多种呼吸道病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种检测多种呼吸道病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用。
背景技术：
：急性呼吸道感染是世界范围内导致儿童患病和死亡的重要原因。引起急性呼吸道感染的病原微生物十分复杂，包括：细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，其中病毒最为常见。而呼吸道病毒感染所引起的症状没有特异性，无法依靠临床症状来确诊。目前，临床上较为常见的检测方法包括培养方法、生化方法和免疫方法等。其中，培养法操作复杂，检测周期长、费用高，不适合作为临床样品的常规检测。生化检测方法操作简单、快速，费用低，但该方法灵敏度和特异性不高，影响因素多，不能区分病毒的具体种类。免疫检测方法快速简便，但一个检测只能针对其中一种病毒。核酸序列依赖扩增(nasba)技术，于1990年由guatelli等首先报道，主要用于特异性地等温扩增rna。相比较而言，传统的pcr技术每次循环只产生双倍的复制子，而nasba每次扩增可产生10-100倍的rna分子，且可在30分钟产生多达1012个复制子，扩增效率明显高于普通pcr。目前nasba技术已经被广泛应用于检测细菌和病毒的感染，其中包括弯曲杆菌，李斯特菌，沙门菌，hiv，hcv，禽流感病毒等。目前国际上对nasba扩增产物的检测绝大多数采用开放式的核酸杂交探针检测体系，如采用酶联显色或化学发光进行结果评价，这就存在操作较为复杂及扩增产物污染易产生假阳性及假阴性的缺点与不足。技术实现要素：本发明目的是为了解决现有技术中核酸杂交探针检测体系操作复杂且扩增产物污染易产生假阳性及假阴性的问题，提出一种检测多种呼吸道病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用。一种检测多种呼吸道病毒的引物组，所述引物组包括以下至少两个引物对：由序列表中seqidno.1和seqidno.2所示的两条序列组成的针对甲型流感病毒的引物对；由序列表中seqidno.3和seqidno.4所示的两条序列组成的针对乙型流感病毒的引物对；由序列表中seqidno.5和seqidno.6所示的两条序列组成的针对副流感病毒1型的引物对；由序列表中seqidno.7和seqidno.8所示的两条序列组成的针对副流感病毒2型的引物对；由序列表中seqidno.9和seqidno.10所示的两条序列组成的针对副流感病毒3型的引物对。优选地，所述引物对中的正向引物均在5’端添加t7rna聚合酶识别的启动子序列，所述启动子序列为taatacgactcactataggg。本发明还提供一种检测多种呼吸道病毒的探针组，所述探针组包括以下至少2条分子信标荧光探针：由序列表中seqidno.12所示的序列针对甲型流感病毒的分子信标荧光探针；由序列表中seqidno.13所示的序列针对乙型流感病毒的分子信标荧光探针；由序列表中seqidno.14所示的序列针对副流感病毒1型的分子信标荧光探针；由序列表中seqidno.15所示的序列针对副流感病毒2型的分子信标荧光探针；由序列表中seqidno.16所示的序列针对副流感病毒3型的分子信标荧光探针。优选地，每一条所述分子信标荧光探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团。优选地，所述荧光基团选自alex-350、fam、vic、tet、cal、fluorgold540、joe、hex、calflourorange560、tamra、calfluorred590、rox、calfluor、red610、texasred、calflourred635、quasar670、cy3、cy5、cy5.5或quasar705中的至少一种，所述淬灭基团选自dabcyl、bhq、eclipse或tamra中的一种。本发明还提供一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：(a)引物组；(b)探针组。优选地，所述试剂盒还包括2×nasba反应液、5×nasba反应酶混合液。优选地，所述2×nasba反应液包括：tris-hcl、kcl、mgcl2、dntp、rntp、dtt、甜菜碱和dmso；所述5×nasba反应酶混合液包括：amv反转录酶、t7rna聚合酶、rnaseh、rna酶抑制剂和bsa。优选地，所述2×nasba反应液中溶质溶度如下：150mmph8.3的tris-hcl，200mmkcl，30mmmgcl2，1mmdntp，4mmrntp，20mmdtt，0.5mm甜菜碱，体积分数为20％的dmso；所述5×nasba反应酶混合液中溶质溶度如下：1.6u/μlamv反转录酶，10u/μlt7rna聚合酶，rnaseh0.05u/μl，3u/μlrna酶抑制剂，30mg/mlbsa。本发明还提供一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒的应用，以鼻咽拭子样本的rna为模板，利用扩增两种或两种以上的呼吸道病毒的引物组和对应的探针组及2×nasba反应液和5×nasba反应酶混合液进行pcr反应，再以扩增产物为样品进行熔解曲线分析检测。本发明的有益效果包括：1、本发明设计的引物组和探针组特异性好且检测灵敏度高；探针采用多色荧光分子信标探针设计，可以实现对不同的nasba扩增产物进行区分和鉴别，从而极大提高了检测通量。2、本发明提供的试剂盒可用于同时检测多种呼吸道病毒。3、本发明利用特异性引物组及探针组配合2×nasba反应液和5×nasba反应酶混合液对待测样本进行扩增，再结合熔解曲线分析技术来判定扩增产物的存在，操作简便，结果易于判读，检测特异性高。附图说明图1为本发明实施例1中的甲型流感病毒的荧光熔解曲线图。图2为本发明实施例1中的乙型流感病毒的荧光熔解曲线图。图3为本发明实施例1中的副流感病毒1型的荧光熔解曲线图。图4为本发明实施例1中的副流感病毒2型的荧光熔解曲线图。图5为本发明实施例1中的副流感病毒3型的荧光熔解曲线图。图6为本发明实施例2中的乙型流感病毒的灵敏度荧光熔解曲线图。图7为本发明实施例3中的临床样本中乙型流感病毒和副流感病毒1型病毒的检测结果图。具体实施方式下面结合具体实施方式并对照附图对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。本发明用于以下5种呼吸道病毒中的至少2种的检测，分别是：甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型。本发明提供一种检测多种呼吸道病毒试剂盒，该试剂盒包括引物组和探针组；优选地，试剂盒还包括2×nasba反应液和5×nasba反应酶混合液；其中，2×nasba反应液包括tris-hcl、kcl、mgcl2、dntp、rntp、dtt、甜菜碱和dmso；5×nasba反应酶混合液包括：amv反转录酶、t7rna聚合酶、rnaseh、rna酶抑制剂和bsa。优选地，在一些实施例中，2×nasba反应液包括150mmtris-hcl(ph8.3)，200mmkcl，30mmmgcl2，1mmdntp，4mmrntp，20mmdtt，0.5mm甜菜碱，体积分数为20％的dmso；5×nasba反应酶混合液包括：1.6u/μlamv反转录酶，10u/μlt7rna聚合酶，rnaseh0.05u/μl，3u/μlrna酶抑制剂，30mg/mlbsa。在一些实施例中，引物组包括以下至少两个引物对，引物对序列如表1所示：表1优选地，上述每种病毒的正向引物均在其5’端添加有能够被t7rna聚合酶识别的启动子序列，启动子序列为序列表中seqidno.11所示的序列taatacgactcactataggg。在一些实施例中，探针组采用以下5条分子信标荧光探针中的至少2条，探针序列如表2所示，探针的序列编号分别为seqidno.12～seqidno.16：表2上述每条分子信标荧光探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中，除上表2中所带的荧光基团fam、rox、cy5、hex外，在其他实施方式中，所述荧光基团还可以是选自alex-350、vic、tet、cal、fluorgold540、joe、calflourorange560、tamra、calfluorred590、calfluor、red610、texasred、calflourred635、quasar670、cy3、cy5.5或quasar705；除上表2中所带的淬灭基团dabcy1外，在其他实施方式中，所述淬灭基团还可以是选自bhq、eclipse或tamra。优选地，试剂盒内引物组中的正向、反向引物各1μm，分子信标荧光探针各0.3μm。实施例1.提供一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒在检测呼吸道病毒中的应用，包括以下步骤：(1)引物组和探针组的制备从genbank获取呼吸道病毒的核酸序列，并进行同源性对比分析，确定各病毒的保守序列区域，然后在保守区域内选择合适的序列来设计特异的引物组和探针。特别地，引物组与探针可根据所要检测的靶标病毒rna的存在形式来设计。(2)制备试剂盒：试剂盒由引物组、探针组以及上述的2×nasba反应液和5×nasba反应酶混合液组成。(3)rna的提取：取阳性病毒样本，用市售病毒rna提取试剂盒提取样本中的rna，具体操作按照说明书进行。(4)nasba反应体系：取5μl上述病毒的rna提取液，加入12.5μl包含引物组、探针组和2×nasba反应液的混合液，混合均匀，加入2.5μldepc处理水至总反应体系为20μl。(5)nasba扩增：利用pcr仪将步骤(4)的nasba反应体系65℃加热5min，41℃冷却5min后，立即加入5μl5×nasba反应酶混合液，41℃反应90min。(6)nasba扩增检测：将步骤(5)中得到的扩增产物在荧光pcr仪上进行熔解曲线分析：95℃加热2min，高温使得扩增产物变性解开双链；再40℃冷却2min，使得检测探针与靶标杂交，此时常规降温至40℃即可；再以0.1℃/s的升温速率从40℃升温至85℃，进行熔解曲线分析，并在此阶段采集荧光信号。(7)结果分析：根据熔解曲线峰图对检测结果进行判断，各型靶标病毒对应的荧光通道类型和熔解峰tm值如下：病毒种类荧光类型熔解峰tm值甲型流感病毒fam65℃±0.5℃乙型流感病毒rox58.5℃±0.5℃副流感病毒1型cy559℃±0.5℃副流感病毒2型hex62℃±0.5℃副流感病毒3型cy555℃±0.5℃实施例1的检测结果如图1-图5所示，图1示出了甲型流感病毒的荧光熔解曲线图，图2示出了乙型流感病毒的荧光熔解曲线图，图3示出了副流感病毒1型的荧光熔解曲线图，图4示出了副流感病毒2型的荧光熔解曲线图，图5示出了副流感病毒3型的荧光熔解曲线图。通过检测结果可知，各型靶标病毒只在对应的荧光通道检测出特异tm值的熔解曲线峰，表明本发明的检测试剂盒具有较高的特异性；且本发明的试剂盒将探针与靶标杂交后再变性解链的熔点来判定扩增产物的存在与否，结果易于判读，不易出错，检测特异性高；将nasba技术与分子信标熔解曲线分析技术组合使用，通过特异探针与对应的靶标病毒扩增产物杂交，再通过熔解曲线分析来区分各型产物，可以实现对不同的nasba扩增产物进行鉴别，从而大大提高检测通量。实施例2.用于试剂盒检测灵敏性分析，包括以下步骤：(1)rna参考品制备：以各型呼吸道病毒rna为模板，使用带有能被t7rna聚合酶识别的启动子序列的上游引物和对应的下游引物，进行一步法rt-pcr，以扩增产物cdna为模板，按照largescalernaproductionsystem-t7试剂盒(promega)说明书的步骤进行体外转录，转录产物经酚氯仿抽提后，异丙醇沉淀，用无rnase酶的水溶解后定量待用，分装并于-70℃保存，作为体外转录rna参考品。为评价试剂盒的检测灵敏度，rna参考品采用te缓冲液或depc处理水以10倍梯度稀释，制备成灵敏度参考品。(2)按照实施例1的步骤(4)～步骤(7)进行nasba扩增及nasba扩增产物检测。以乙型流感病毒的灵敏性检测为例，实施例2的检测结果如图6所示，曲线峰从高到低代表不同浓度的参考品检测出的熔解峰，熔解峰的荧光导数值高低代表荧光信号的强弱，间接反应出试剂盒的检测灵敏度。实施例3.试剂盒对临床样本的检测效果(1)提取病毒rna：收集疑似呼吸道病毒感染者的鼻咽拭子样品，用市售病毒rna提取试剂盒提取样品中的rna，具体操作按照说明书进行。(2)按照实施例1的步骤(4)～步骤(7)进行nasba扩增及nasba扩增产物检测。图7所示为部分临床样本检测结果，图中熔解曲线峰1为为rox通道检测出的乙型流感病毒，熔解曲线峰2为cy5通道检测出的副流感病毒1型病毒，3为hex通道未检出熔解曲线峰，表明此荧光通道未检出病毒。本领域技术人员将认识到，对以上描述做出众多变通是可能的，所以实施例和附图仅是用来描述一个或多个特定实施方式，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。序列表<110>深圳市亿立方生物技术有限公司<120>一种检测多种呼吸道病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用<130>18a103121jyc<160>16<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1cttctaaccgaggtcgaaa19<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2tcttgtctttagccattccat21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3tggtgttgcaatcaaaggagg21<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列<400>4ttggctttgatgtctctcaatagc24<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<400>5ttggtctacaacccgaaatgac22<210>6<211>25<212>dna<213>人工序列<400>6gcataggatcatgataatgaaggac25<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7atgggtgcagaaggtaggctc21<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8aggacggtacccattgagcc20<210>9<211>22<212>dna<213>人工序列<400>9ggaccgagcaagctacagaatc22<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10cgtcctggttcgttctgtttg21<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11taatacgactcactataggg20<210>12<211>27<212>dna<213>人工序列<400>12ccagcccctcaaagccgagatcgctgg27<210>13<211>28<212>dna<213>人工序列<400>13gcggagacatcaaagccaagactgccgc28<210>14<211>23<212>dna<213>人工序列<400>14ccgcatctggctactgattgcgg23<210>15<211>25<212>dna<213>人工序列<400>15cgccgatgcagaccaccaagaggcg25<210>16<211>34<212>dna<213>人工序列<400>16cgccacagactaaacaagagactcaacgacggcg34当前第1页12