一组山羊痘病毒重组蛋白抗原制备方法及其应用与流程

本发明属于分子生物技术和免疫技术领域，具体涉及一组山羊痘亚单位疫苗重组蛋白抗原制备方法及其应用。

背景技术：

山羊痘(goatpox)是由痘病毒科脊索动物痘病毒亚科山羊痘病毒属的山羊痘病毒引起的一种热性、接触性皮肤、粘膜病；在非洲、中东、中亚、印度以及我国的西北、东北等地广泛流行，被世界动物卫生组织列为必须上报的动物疫病之一，我国则将其列为法定通报的一类动物疫病。羊痘在中亚、印度、中非、北非等国家和地区呈地方性流行，在我国的黑龙江、吉林、辽宁、河北、甘肃、青海和内蒙古等省份也均有流行，对养羊业造成很大的经济损失。

目前对该病尚无特效的治疗方法，只能采取临床外伤处置及支持疗法，在防控上国内外主要采取接种山羊痘弱毒活疫苗进行预防，但这种疫苗仍不能够彻底消除和控制该病，在免疫力和安全性方面均存在一定的缺陷，因此创制安全、高效的新型疫苗势在必行。亚单位疫苗免疫动物既可以避免弱毒疫苗株基因重排而致毒力返强的风险，又可以避免灭活疫苗灭活不彻底散毒的可能性，可诱导全面而持久的免疫反应，因此，亚单位疫苗是减毒活疫苗和灭活苗的首选替代品。

山羊痘病毒属除了山羊痘病毒(goatpoxvirus,gtpv)外，还包括绵羊痘病毒(sheeppoxvirus，sppv)和牛结节性疹块病病毒(lumpyskindiseasevirus,lsdv)三种病毒。gtpv病毒粒子的两种主要的病毒粒子形式为胞内成熟病毒粒子(intracellularmaturevirion，imv)和胞外包膜病毒(extracellularenvelopedvirus，eev)，编码约140个蛋白。因此，筛选出良好免疫原性的抗原，对亚单位疫苗的制备十分关键。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，为如下a-k中任一所示的物质：

a、蛋白orf056、蛋白orf112和蛋白orf117；

b、含有蛋白orf056、蛋白orf112和蛋白orf117的组合物；

c、含有蛋白orf056、蛋白orf112和蛋白orf117的融合蛋白；

d、含有所述融合蛋白的组合物；

e、编码蛋白orf056的核酸、编码蛋白orf112的核酸和编码蛋白orf117的核酸；

f、编码所述融合蛋白的核酸；

g、表达所述编码蛋白orf056的核酸的生物材料、表达编码蛋白orf112的核酸和表达编码蛋白orf117的核酸；

k、表达所述融合蛋白的生物材料；

所述生物材料为表达盒、重组载体、重组菌或重组病毒或转基因细胞；

所述蛋白orf056为如下1)或2)所示的蛋白：

1)序列表中的序列2所示的氨基酸组成的蛋白质；

2)将1)所示蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

所述蛋白orf112为如下3)或4)所示的蛋白：

3)序列表中的序列4所示的氨基酸组成的蛋白质；

4)将3)所示蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

所述蛋白orf117为如下5)或6)所示的蛋白：

5)序列表中的序列6所示的氨基酸组成的蛋白质；

6)将5)所示蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

上述蛋白orf056可以为编码蛋白orf056的基因全长表达的蛋白也可以为orf056基因胞外区表达的蛋白；

上述蛋白orf117可以为编码蛋白orf117的基因全长表达的蛋白也可以为orf117基因胞外区表达的蛋白。

上述产品具有如下1)或2)功能：

1)预防、诊断和/或治疗动物山羊痘病；

2)抑制或中和山羊痘病毒属的病毒。

上述产品中，所述含有蛋白orf056、蛋白orf112和蛋白orf117的组合物为由抗原和佐剂组成的组合物，其中，所述抗原由所述蛋白orf056、所述蛋白orf112和所述蛋白orf117组成的；

所述含有融合蛋白的组合物为由所述融合蛋白和佐剂组成的组合物；

或，所述含有蛋白orf056、蛋白orf112和蛋白orf117的组合物为由所述抗原和其他蛋白组成的组合物，

所述含有融合蛋白的组合物为由所述融合蛋白和其他蛋白组成的组合物。

上述产品中，所述其他蛋白为修饰蛋白、标签蛋白或功能蛋白；

或，所述佐剂为弗氏佐剂。

上述产品中，所述抗原中，蛋白orf056、所述蛋白orf112和所述蛋白orf117的质量比为1:1:1。

上述产品中，所述山羊痘病毒属的病毒为山羊痘病毒gtpv和/或绵羊痘病毒sppv。

上述编码蛋白orf056的核酸可以为编码蛋白orf056的基因全长也可以为orf056基因胞外区；

上述编码蛋白orf117的核酸可以为编码蛋白orf056的基因全长也可以为orf117基因胞外区。

上述产品中，所述编码蛋白orf056的核酸为如下：

a)其编码序列包括序列表中序列1；

b)在严格条件下与a)限定的dna分子杂交且编码相同蛋白的dna分子；

c)与a)限定的dna分子具有80％以上或90％以上的同源性且编相同蛋白的dna分子；

所述编码蛋白orf112的核酸为如下：

d)其编码序列包括序列表中序列3；

e)在严格条件下与a)限定的dna分子杂交且编码相同蛋白的dna分子；

f)与e)限定的dna分子具有80％以上或90％以上的同源性且编相同蛋白的dna分子；

所述编码蛋白orf117的核酸为如下：

g)其编码序列包括序列表中序列5；

h)在严格条件下与a)限定的dna分子杂交且编码相同蛋白的dna分子；

i)与g)限定的dna分子具有80％以上或90％以上的同源性且编相同蛋白的dna分子。

上述产品为疫苗或药物或试剂盒。

上述的a-k中任一所示的物质在制备具有如下1)和/或2)功能的产品中的应用：

1)预防、诊断和/或治疗动物山羊痘病；

2)抑制或中和山羊痘病毒属的病毒。

上述应用中，所述产品为疫苗或药物或试剂盒；

或，所述山羊痘病毒属的病毒为山羊痘病毒gtpv和/或绵羊痘病毒sppv。

本发明的实验证明，利用imvorf056、orf112编码蛋白及eevorf117编码蛋白制备的亚单位疫苗免疫小鼠，比采用orf056、orf112或者orf117单一蛋白制备的疫苗免疫小鼠产生的羊痘病毒的中和抗体都高，是一种具有预防羊痘潜力的理想疫苗。

本发明具有如下优点：(1)表达的抗原蛋白都能够和gtpv血清反应，说明具有良好的抗原反应性；(2)该组抗原免疫原性好，又无毒副作用，三种蛋白抗原中的单一的或三种混合与佐剂配伍后免疫小鼠，能够产生高滴度的特异性的抗体；而三者混合之后产生的多克隆抗体具有更高的中和sppv、gtpv两种病毒的能力；由于三者混合与佐剂配伍后产生既能够中和gtpv,又能够中和sppv的高滴度的抗体,这说明这种疫苗具有更好的保护作用；这为羊痘的根除及预防提供坚实的基础。

附图说明

图1为westernblotting检测重组蛋白表达结果。

图2为westernblotting检测重组蛋白反应原性结果。

图3为三种蛋白纯化结果图。

图4为免疫小鼠血清不同蛋白特异性抗体测定结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1、山羊痘亚单位疫苗的制备

一、orf056-c、orf112和orf117-c重组蛋白的制备

1、orf056、orf117胞外区及orf112基因的克隆及表达载体的构建

提取山羊痘病毒gtpv/hbsz株(记载在如下文献中：zhout，jiah，cheng，etal，phylogeneticanalysisofchinesesheeppoxandgoatpoxvirusisolates.virolj，20129:25)的基因组dna，pcr扩增orf056基因的胞外区、orf117基因的胞外区片段及orf112基因全长，经限制性内切酶消化目的片段和原核表达载体，通过连接酶连接目的基因和载体，转化bl21感受态细胞，通过诱导剂诱导表达目的蛋白，通过镍层析柱纯化表达的蛋白。具体如下：

1)、引物设计及pcr扩增

根据已发表的orf056、orf112和orf117基因序列，利用primmer5.0软件设计orf056、orf117基因的胞外区序列和orf112序列表达引物，并利用seman软件分析原核表达载体pet-30a(+)及目的基因的酶切位点：

orf056上游引物：5'-gcgaattcatgggagcagccgcaagtatac-3'，划线部分为ecori限制酶切位点；下游引物：5'-cgcctcgagttatcccgaactttgactaggg-3'，划线部分为xhoi限制酶切位点。

orf112上游引物：5'-cggaattcatggacagagcgttatcca-3，划线部分为ecori限制酶切位点；下游引物：5’-ccaagctttcatagtgttgtacttcttcctgt-3’，划线部分为hindiii限制酶切位点。

orf117上游引物：5'-ccgcggtaccttagcattttttaataataatacatgtg-3'，划线部分为kpni限制酶切位点；下游引物：5'-ccgcgctcgagttaaaaaaaagatcttacacag-3'，划线部分为xhoi限制酶切位点。

以gtpv/hbsz株的基因组dna为模板，分别用orf056上游引物和下游引物、orf112上游引物和下游引物、orf117上游引物和下游引物进行pcr扩增，得到546bporf056基因胞外区、447bporf112基因全长、396bporf117基因胞外区。

上述orf056pcr总反应体积为50μl：灭菌去离子水30.5μl，4×pcrbuffer10μl，2.5mmdntpmixture4μl，上、下游引物(50μmol/l)各1μl；dna模板3.5μl；表达片段orf056pcr扩增条件：95℃4min；94℃15s，55℃15s，68℃1min，35个循环；72℃5min。

上述orf112pcr总反应体积为50μl：灭菌去离子水30.5μl，4×pcrbuffer10μl，2.5mmdntpmixture4μl，上、下游引物(50μmol/l)各1μl；dna模板3.5μl；表达片段orf056pcr扩增条件：95℃4min；94℃15s，53℃15s，68℃1min，35个循环；72℃5min。

上述orf117pcr总反应体积为50μl：灭菌去离子水30.5μl，4×pcrbuffer10μl，2.5mmdntpmixture4μl，上、下游引物(50μmol/l)各1μl；dna模板3.5μl；表达片段orf056pcr扩增条件：95℃4min；94℃15s，55℃15s，68℃1min，35个循环；72℃5min。

将扩增产物送去测序，结果如下：

orf056基因胞外区的核苷酸序列为序列1，编码的蛋白命名为orf056-c，该蛋白的氨基酸序列为序列2；

orf112基因的核苷酸序列为序列3，编码的蛋白命名为orf112，该蛋白的氨基酸序列为序列4；

orf117基因胞外区的核苷酸序列为序列5，编码的蛋白命名为orf117-c，该蛋白的氨基酸序列为序列6。

2)、表达载体的构建

利用ecori和xhoi将orf056胞外区(546bp)扩增片段和pet-30a载体双酶切，利用ecori和hindiii将orf112(447bp)扩增片段和pet-30a载体双酶切，利用kpni和xhoi将orf117胞外区(396bp)扩增片段和pet-30a载体双酶切，酶切后回收，在16℃连接12～16h，连接产物转化bl21(de3)感受态，挑取单克隆进行pcr、酶切和测序鉴定测序正确的重组载体命名为pet-30-orf056、pet-30-orf112、pet-30-orf117，含有这些重组载体的重组菌命名为bl21(de3)/pet-30-orf056、bl21(de3)/pet-30-orf112、bl21(de3)/pet-30-orf117。

重组载体pet-30-orf056为将序列1所示的orf056基因胞外区替换pet-30a载体的ecori和xhoi酶切位点间的dna分子，得到的载体，该载体表达重组蛋白orf056，重组蛋白orf056为序列2所示的orf056-c的c末端融合载体上的his标签得到的蛋白；

重组载体pet-30-orf112为将序列3所示的orf112基因替换pet-30a载体的ecori和hindiii酶切位点间的dna分子，得到的载体，该载体表达重组蛋白orf112，重组蛋白orf112为序列4所示的orf112的c末端融合载体上的his标签得到的蛋白；

重组载体pet-30-orf117为将序列5所示的orf117基因胞外区替换pet-30a载体的kpni和xhoi酶切位点间的dna分子，得到的载体，该载体表达重组蛋白orf117，重组蛋白orf117为序列6所示的orf117-c的c末端融合载体上的his标签得到的蛋白。

2、重组蛋白orf056、重组蛋白orf112和重组蛋白orf117的表达和纯化

1)westernblotting检测表达蛋白的反应原性

重组菌bl21(de3)/pet-30-orf056、bl21(de3)/pet-30-orf112、bl21(de3)/pet-30-orf117按体积比为1％的比例接种到含有50ug/ml的kan的lb培养基中，200rpm/min在37℃摇床震荡摇振2～3h，当od值达到0.6左右时，加iptg诱导剂终浓度为1mm，诱导6h，离心收集菌体。菌体sds-page电泳，然后转到硝酸纤维素(nc)膜上，利用山羊痘阳性血清(中国兽医药品监察所引进山羊痘病毒(goatpoxvirus)cvccav40，人工感染经检测抗体为阴性的3月龄山羊，感染后35d静脉采血，分离血清)作为一抗，用hrp标记的兔抗羊igg(sigma，a5420)作为二抗，westernblotting检测重组蛋白表达及其反应原性。

westernblotting检测重组蛋白表达结果如图1所示，

图1a为重组菌bl21(de3)/pet-30-orf056表达orf056-c的结果图，其中，m为蛋白marker，1为未诱导的bl21(de3)/pet-30-orf056，2为空载体bl21(de3)/pet-30(将空载体pet-30转入大肠杆菌中)，3为bl21(de3)/pet-30-orf056，可以看，bl21(de3)/pet-30-orf056表达得到重组蛋白orf056，大小约为26kda；

图1b为重组菌bl21(de3)/pet-30-orf117表达orf117-c的结果图，其中，m为蛋白marker，1为未诱导的bl21(de3)/pet-30-orf117，2为空载体bl21(de3)/pet-30(将空载体pet-30转入大肠杆菌中)，3为bl21(de3)/pet-30-orf117，可以看，bl21(de3)/pet-30-orf117表达得到重组蛋白orf117，大小约为19kda；

图1c为重组菌bl21(de3)/pet-30-orf112表达orf112-c的结果图，其中，m为蛋白marker，1为未诱导的bl21(de3)/pet-30-orf112，2为空载体bl21(de3)/pet-30(将空载体pet-30转入大肠杆菌中)，3为bl21(de3)/pet-30-orf112，可以看，bl21(de3)/pet-30-orf112表达得到重组蛋白orf112，大小约为34kda(实际上，按预测的分子量为23kda，电泳图显示实际表达分子量约34kd，但是利用质谱测序分析蛋白序列是正确的，这可能是由该蛋白表达的二聚体所致)。

westernblotting检测重组蛋白反应原性结果如图2所示，m：蛋白质分子质量标准；1、重组蛋白orf56与山羊痘病毒阳性血清反应情况，2、阴性血清反应；3、重组蛋白orf117与山羊痘病毒阳性血清反应情况，4、重组蛋白orf117与山羊痘病毒与山羊痘病毒阴性血清反应情况：5、重组蛋白orf112与阴性血清反应情况，6、重组蛋白orf112与山羊痘病毒阳性血清反应情况，可以看出，重组蛋白orf56、orf112、orf117都能够和山羊痘病毒的阳性血清反应，出现相对应条带，而和阴性血清没有反应也没有条带。

2)蛋白抗原的的纯化

(1)将重组菌bl21(de3)/pet-30-orf056、bl21(de3)/pet-30-orf112、bl21(de3)/pet-30-orf117按照1)中的诱导培养条件扩大培养，离心收集菌体；

(2)菌体在pbs磷酸盐缓冲液中洗涤两次，并用20ml缓冲液悬浮，在-70℃冰箱中反复冻融两次，利用超声破碎仪超声(功率为3800w，超声5s，停5s，超声共1h)，12000rpm，10min离心收集沉淀；

(3)分别利用2m和8m的尿素洗涤沉淀，共洗涤2次，利用8m的尿素溶解沉淀，室温放置1h后，12000rpm，30min离心，收集上清；

(4)将上清与装有镍填料纯化柱结合1h后，利用磷酸缓冲液洗涤5次，并控制流速(约为1ml/min)，洗掉杂蛋白；

(5)再利用含有20mm、50mm、100mm、200mm、400mm咪唑的磷酸缓冲液分别洗脱目的蛋白，收集蛋白；

(6)再分别利用含有逐渐递减的尿素浓度(6m、4m、2m)的磷酸盐缓冲液透析蛋白，去除大浓度的尿素，并利用bca法测定蛋白的浓度，调整蛋白的浓度为1mg/ml，得到纯化如图3。

图3为三种蛋白纯化结果图，1为纯化重组蛋白orf56；2为纯化重组蛋白orf112；3为纯化重组蛋白orf117。

二、免疫疫苗的制备

orf056+orf112+orf117重组蛋白疫苗：将上述一制备的浓度为1mg/ml纯化重组蛋白orf56、浓度为1mg/ml纯化重组蛋白orf112、浓度为1mg/ml纯化重组蛋白orf117按照质量比为1:1:1混合，得到抗原；再将抗原与弗氏佐剂(sigma公司)配伍，低速搅拌混合后，得到疫苗，加入的佐剂与抗原的体积比为1:1。

orf056重组蛋白疫苗：将上述一制备的浓度为1mg/ml纯化重组蛋白orf056作为抗原与弗氏佐剂配伍，低速搅拌混合后，得到疫苗，加入的佐剂与抗原的体积比为1:1。

orf112重组蛋白疫苗：将上述一制备的浓度为1mg/ml纯化重组蛋白orf112作为抗原与弗氏佐剂配伍，低速搅拌混合后，得到疫苗，加入的佐剂与抗原的体积比为1:1。

orf117重组蛋白疫苗：将上述一制备的浓度为1mg/ml纯化重组蛋白orf117作为抗原与弗氏佐剂配伍，低速搅拌混合后，得到疫苗，加入的佐剂与抗原的体积比为1:1。

实施例2、重组蛋白抗原特异性抗体及中和抗体测定

1、试验动物与免疫

72只6～8周龄的雌性balb/c小鼠(18g)购自兰州大学实验动物中心。共分为6个组：

orf056重组蛋白疫苗组(gtpv-orf056)：将实施例1中的orf056重组蛋白疫苗在第0d、14d和28d进行小鼠腿部肌肉注射免疫，剂量为200μl(50μg蛋白/只小鼠)。

orf112重组蛋白疫苗组(gtpv-orf112)：将实施例1制备的orf112重组蛋白疫苗在第0d、14d和28d进行小鼠腿部肌肉注射免疫，剂量为200μl(50μg蛋白/只小鼠)。

orf117重组蛋白疫苗组(gtpv-orf117)：将实施例1制备的orf117重组蛋白疫苗在第0d、14d和28d进行小鼠腿部肌肉注射免疫，剂量为200μl(50μg蛋白/只小鼠)。

orf056+orf112+orf117重组蛋白疫苗组(gtpv-orf056+orf112+orf117)：将实施例1制备的orf056+orf112+orf117重组蛋白疫苗在第0d、14d和28d进行小鼠腿部肌肉注射免疫，剂量为200μl(总蛋白量为50μg蛋白/只小鼠)。

弗氏佐剂对照组：将弗氏佐剂(sigma公司)在第0d、14d和28d进行小鼠腿部肌肉注射免疫，量为200μl。

pbs对照组：将浓度为0.01mmolph值为7.4的pbs在第0d、14d和28d进行小鼠腿部肌肉注射免疫，量为200μl。

2、间接elisa法检测特异性抗体的水平

上述1的6组免疫后每周采集尾静脉血，分离血清，用间接elisa法检测特异性抗体的水平。

通过间接elisa法检测orf056、orf112和orf117的特异性抗体水平和分型抗体水平，具体的步骤：利用5μg/mlorf056、orf112和orf117重组蛋白分别包被96孔elisa板，每孔为100μl，置湿盒4℃过夜；利用pbst洗涤包被不同抗原的板子5次，将收集的每只小鼠血清按1：51200稀释后，每孔加100μl，37℃温箱中孵育1h，pbst洗涤5次后；再加1：20000稀释的抗小鼠的igghrp二抗，37℃温箱中孵育1h，pbst洗涤5次后，加100μltmb,酶标仪测定od490值。

结果如图4所示，与弗氏佐剂对照组和pbs对照组相比，四个疫苗组在初次免疫后特异性抗体开始上升到第4周或第5周达到最高水平，说明这几种抗原都能够产生特异性的抗体，且三种蛋白抗原混合后制备的疫苗(gtpvorf056+orf112+orf117)效果较单一的抗原产生的抗体水平高。

3、病毒中和抗体的测定

将上述1的6组免疫后第5周采集的各组免疫后血清，于56℃的恒温水浴锅灭活30min，取灭活的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作系列倍比稀释：1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128和1:256。

取-80℃冰箱保存的病毒gtpv和sppv(记载在如下文献中，zhout,jiah,cheng，etal,phylogeneticanalysisofchinesesheeppoxandgoatpoxvirusisolates.virolj,20129:25)，按测定的毒价稀释至200tcid50；将等体积的200tcid50的病毒稀释液加入到上述倍比稀释的血清稀释液中，置37℃、5％co2的细胞培养箱中感作1h；将血清病毒混合液以每孔100μl加入到细胞密度达到80％左右96孔微量细胞培养板中培养的vero细胞中，每组4个复孔，置37℃、5％co2细胞培养箱进行培养，培养48h后开始记录，直至出现cpe的孔数不再增加为止，为保证试验结果的准确性试验都必须同时设置病毒对照组，血清毒性对照组和正常细胞对照组；根据reed-muench法计算相应免疫组小鼠血清中和抗体效价。

结果如表1和表2所示，可以看出，单一蛋白抗原制备的疫苗和复合抗原制备的疫苗都能够产生中和gtpv和sppv的能力的抗体，重组蛋白orf056抗原制备疫苗产生中和gtpv和sppv抗体滴度为1：32，重组蛋白orf112抗原制备疫苗产生中和gtpv和sppv的滴度为1:19.03，orf117抗原制备疫苗产生中和gtpv和sppv的滴度为1：16，而重组蛋白orf056+orf112+orf117复合蛋白抗原与佐剂配制的疫苗组能够有效中和gtpv和sppv，中和gtpv抗体的效价为1：44.67(见表1)，中和sppv的效价为1：39.81，中和抗体的效价显著高于orf112单一抗原、orf117蛋白抗原制备的疫苗组，pbs对照组和弗氏佐剂对照组的血清不能够中和gtpv和sppv(见表2)。

表1各免疫组小鼠血清gtpv中和抗体

表中“+”:出现细胞病变,“-”:未出现细胞病变。

表2各免疫组小鼠血清sppv中和抗体

表中“+”:出现细胞病变,“-”:未出现细胞病变。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一组山羊痘亚单位疫苗重组蛋白抗原制备方法及其应用

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>546

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgggagcagccgcaagtatacaaactacagtaaatacgttgaatgaaaaaataagtagt60

aaattggaacaaactgctgaagccactgcagaagcaaaatgcgatatagaaattggtagt120

attgtatttagacaaaataaaggttgtaatgttactgttaaaaacttgtgttcgtctaaa180

gcagaatctcaattagatgctatattaaaagcagcaacagaaacatatgatttacttact240

cctgatcaaaaagcatatgttccaggattgatgacagcggcattaaatatccaaacaagt300

gttaatactgtggttaaagattttgaaacgtatgtaaaacaaaagtgtacatcaaaatcg360

gttattgataataaattaaagattcataatatttttatagatgagtgtgctgcaccaacc420

ggaacaactacaaactttgaatttattaattctggaaccagtcagggaatatgtgcaata480

aaaacgttaatggatgtaaccacaaaggcgagtacaaaaatttcccctagtcaaagttcg540

ggataa546

<210>2

<211>181

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

metglyalaalaalaserileglnthrthrvalasnthrleuasnglu

151015

lysileserserlysleugluglnthralaglualathralagluala

202530

lyscysaspilegluileglyserilevalpheargglnasnlysgly

354045

cysasnvalthrvallysasnleucysserserlysalaglusergln

505560

leuaspalaileleulysalaalathrgluthrtyraspleuleuthr

65707580

proaspglnlysalatyrvalproglyleumetthralaalaleuasn

859095

ileglnthrservalasnthrvalvallysaspphegluthrtyrval

100105110

lysglnlyscysthrserlysservalileaspasnlysleulysile

115120125

hisasnilepheileaspglucysalaalaprothrglythrthrthr

130135140

asnpheglupheileasnserglythrserglnglyilecysalaile

145150155160

lysthrleumetaspvalthrthrlysalaserthrlysileserpro

165170175

serglnsersergly

180

<210>3

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