一种荧光定量PCR检测鉴定森林葱蜗牛的方法与流程

本发明涉及分子生物学检测鉴定领域，具体涉及一种荧光定量pcr检测鉴定森林葱蜗牛的方法。

背景技术：

森林葱蜗牛cepaeanemoralis(linnaeu,1758）隶属软体动物门mollusca，腹足纲gastropoda，柄眼目stylommatopgora、大蜗牛科helicidae，葱蜗牛属cepaea，是国际植物检疫中备受关注的危险性有害生物。该蜗牛昼伏夜出，常隐匿于阴暗处，可以休眠的方式随货物和木质包装材料远距离传播。其不但危害各种蔬菜、瓜果、花卉等农作物，为农业生产上的重要有害生物，而且是许多人畜共患病的中间宿主，影响人畜健康。近年来我国辽宁、张家口、江苏、山东、福建、天津、宁波、上海等口岸多次从进境植物性材料、集装箱中截获该蜗牛，其传入我国风险较高。森林葱蜗牛贝壳与花园葱蜗牛cepaeahortensis(müller,1774）形态极为相似，往往难以区别，卵粒和幼螺的鉴定则更为困难。由于历史的原因，目前国境口岸的植物检疫人员绝大多数为植物保护专业，对陆生软体动物的分类知之甚少，这种局面给我国的实际检疫工作造成了被动，也是世界各国检验检疫部门共同面临的技术难题。最近二十多年来，分子生物学技术飞速发展，20世纪90年代出现的荧光定量pcr技术在反应体系中加入荧光染料，通过荧光信号的传递来反映dna扩增量，实现了快而准的检测鉴定。迄今为止，尚未见用于森林葱蜗牛检测鉴定的荧光定量pcr技术。如果能设计出特异性引物及探针用荧光定量pcr扩增方法为森林葱蜗牛的快速准确鉴定提供新的技术手段，这个难题就迎刃而解。本发明建立了一种荧光定量pcr方法检测鉴定森林葱蜗牛的技术，以适应当前国境口岸检疫和农业生产工作的需要。

技术实现要素：

本发明针对传统形态学和普通pcr鉴定技术所存在的不足开展研究，旨在提供一种特异性强、准确性好、灵敏度高且操作方便的检测方法，应用于森林葱蜗牛的快速检测鉴定。

本发明提供了一种荧光定量pcr检测鉴定森林葱蜗牛的方法，所述方法是应用特异性引物及探针对森林葱蜗牛的分子特征进行识别，所述引物及探针为：

上游引物为cnf：5’-cggcccacgcatttgttat-3’，

下游引物为cnr：5’-ccaccttccacgagtcttct-3’，

荧光探针为cnp：5’-fam-cccactgcttgtgggagcgcc-bhq1-3’，5’端标记的荧光报告基团是fam，3’端标记的荧光淬灭基团是bhq1，

以上引物及探针浓度均为10μmol/l。

所述荧光定量pcr反应体系总体积为20μl，其中2×taqmanpcrmastermix10μl，上、下游引物及荧光探针各1μl，100ng/μldna模板2μl，roxii0.5μl，余下用灭菌ddh2o补足；所述荧光定量pcr反应的程序为：95℃预变性3min；95℃10s，60℃40s，40个循环；结束反应。

所述荧光定量pcr反应结束后根据扩增曲线判定结果，判定方法如下：在空白对照及阴性对照无ct值且无扩增曲线条件下，若待测样品出现典型扩增曲线，且ct值小于或等于35时，判定森林葱蜗牛；若ct值大于或等于40时，判定非森林葱蜗牛；若ct值大于35且小于40时，应重新进行测试；重新测试的ct值大于或等于40时，判定非森林葱蜗牛，重新测试的ct值大于35且小于40时，则判定森林葱蜗牛。本发明的显著优点：本发明方法能够快速、准确地检测鉴定森林葱蜗牛。本发明为森林葱蜗牛的检测鉴定提供了新的技术手段，对于防止森林葱蜗牛的传入和扩散具有重要意义。本发明所提供的方法具有以下有益效果：

1、特异性强：所采用的引物及探针是针对森林葱蜗牛的its2基因序列设计出的特异性引物及探针，一对特异性引物和一条特异性探针可以对靶目标进行双重控制，特异性强。

2、灵敏度高：对森林葱蜗牛的检测灵敏度在dna水平上可达到1pg/μl。

3、结果判定准确方便：本发明所设计出的一种检测鉴定森林葱蜗牛的特异性引物及探针，仅对森林葱蜗牛进行检测，已经对近缘种比萨茶蜗牛、亮大蜗牛、蠕虫尹氏蜗牛、盖罩大蜗牛、江西巴蜗牛、花园葱蜗牛、散大蜗牛共计7种代表性蜗牛进行了测试验证，且pcr扩增结果可以在电脑上直接显示，无需其他额外步骤，因此结果判定准确方便。

4、检测速度快，操作方便：当传统分类学方法难以鉴定森林葱蜗牛时，本发明方法用分子生物学技术进行弥补，且无需pcr后处理，能有效避免假阳性和交叉污染，从而得到快速、准确、灵敏度高的检测鉴定森林葱蜗牛的荧光定量pcr方法。因此本方法的实用性强，检测速度快，操作方便，可满足对森林葱蜗牛进行快速可靠的检测和鉴定的需要。

附图说明

图1为森林葱蜗牛荧光定量pcr引物特异性试验结果。其中：曲线1为森林葱蜗牛cepaeanemoralis(linnaeu,1758）；曲线2为比萨茶蜗牛thebapisana；曲线3为亮大蜗牛helixlucorum；曲线4为蠕虫尹氏蜗牛eobaniavermiculata；曲线5为盖罩大蜗牛helixpomatia；曲线6为江西巴蜗牛mastigeulotakiangsinensis；曲线7为花园葱蜗牛cepaeahortensis；曲线8为散大蜗牛helixaspersa；曲线9为空白对照。

图2为森林葱蜗牛荧光定量pcr检测灵敏度试验结果。其中曲线1为100ng/μl；曲线2为10ng/μl；曲线3为1ng/μl；曲线4为：100pg/μl；曲线5为：10pg/μl；曲线6为：1pg/μl；曲线7为：100fg/μl；曲线8为10fg/μl；曲线9为1fg/μl；曲线10为空白对照。

具体实施方式

实施例1:森林葱蜗牛荧光定量pcr引物特异性试验

1、材料的准备

供试蜗牛如下：森林葱蜗牛、比萨茶蜗牛、亮大蜗牛、蠕虫尹氏蜗牛、盖罩大蜗牛、江西巴蜗牛、花园葱蜗牛、散大蜗牛。

以上供试蜗牛系全国口岸检疫中截获或通过国内调查采集获得，经原质检总局国家软体动物检疫鉴定重点实验室确认后，置于-20℃保存备用。

2、荧光定量pcr方法的建立

2.1、引物的设计合成：基于森林葱蜗牛its2基因序列，用引物设计软primerexpress3辅助设计和分析引物，经ncbiblast检验其特异性后，交由上海生工生物技术服务有限公司合成。经反复比对测试最终确定的最优引物如下：

上游引物为cnf：5’-cggcccacgcatttgttat-3’，

下游引物为cnr：5’-ccaccttccacgagtcttct-3’，

荧光探针为cnp：5’-fam-cccactgcttgtgggagcgcc-bhq1-3’，5’端标记的荧光报告基团是fam，3’端标记的荧光淬灭基团是bhq1。

2.2、dna提取：tiangen组织基因组dna提取试剂盒提取，按使用说明书操作提取dna。用核酸蛋白分析仪测定dna的浓度，最后用te溶液将dna稀释至100ng/μl，得到dna模板，置于-20℃保存备用。

2.3、荧光定量pcr扩增反应体系：总体积为20μl，其中2×taqmanpcrmastermix10μl，上、下游引物及荧光探针各1μl，100ng/μldna模板2μl，roxii0.5μl，余下用灭菌ddh2o补足。混匀后放入荧光定量pcr扩增仪中进行扩增。

2.4、荧光定量pcr两步法扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃10s，60℃40s，40个循环；结束反应。

2.5、结果判定：反应结束后根据扩增曲线判定结果，结果见图1，其中曲线1为森林葱蜗牛cepaeanemoralis(linnaeu,1758）；曲线2为比萨茶蜗牛thebapisana；曲线3为亮大蜗牛helixlucorum；曲线4为蠕虫尹氏蜗牛eobaniavermiculata；曲线5为盖罩大蜗牛helixpomatia；曲线6为江西巴蜗牛mastigeulotakiangsinensis；曲线7为花园葱蜗牛cepaeahortensis；曲线8为散大蜗牛helixaspersa；曲线9为空白对照。在空白对照及阴性对照无ct值且无扩增曲线条件下，若待测样品出现典型扩增曲线，且ct值小于或等于35时，判定森林葱蜗牛；若ct值大于或等于40时，判定非森林葱蜗牛；若ct值大于35且小于40时，应重新进行测试；如果重新测试的ct值大于或等于40时，判定非森林葱蜗牛；如果重新测试的ct值大于35且小于40时，则判定森林葱蜗牛。

实施例2：森林葱蜗牛荧光定量pcr检测灵敏度试验

采用10倍浓度系列稀释法将实施例1中提取的森林葱蜗牛dna原液（100ng/μl）稀释成10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl和1fg/μl共8个不同浓度梯度，分别标记为1-9，曲线10为空白对照。

荧光定量pcr扩增反应体系：总体积为20μl，其中2×taqmanpcrmastermix10μl，上、下游引物及荧光探针各1μl，100ng/μldna模板2μl，roxii0.5μl，余下用灭菌ddh2o补足。混匀后放入荧光定量pcr扩增仪中进行扩增。

荧光定量pcr两步法扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃10s，60℃40s，40个循环；结束反应。

荧光定量pcr结果判定：如果在荧光定量pcr仪上观察到典型的扩增曲线，则说明该浓度可以被检出。结果显示，在dna浓度为1pg/μl时仍有扩增曲线出现，表明此方法具有较高的灵敏度，可达到1pg/μl（图2）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>一种荧光定量pcr检测鉴定森林葱蜗牛的方法

<130>3

<160>3

<170>patentinversion3.3

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