检测莲草直胸跳甲CSP基因表达特性的引物及方法与流程

本发明涉及检测莲草直胸跳甲csp基因表达特性的引物及方法，属于生物技术领域。

背景技术：

莲草直胸跳甲属鞘翅目，叶甲科，是空心莲子草的主要生防天敌之一。georgevogt于1962年首次发现了莲草直胸跳甲对空心莲子草有很好的控制作用。其后，莲草直胸跳甲在美国、澳大利亚等地被广泛应用于空心莲子草的控制，并取得了较好的防治效果。我国于1986年从美国引进莲草直胸跳甲，并应用于空心莲子草的生物防治，在四川、浙江、福建、广西等地取得一定的成功。

昆虫经过长期的进化，演化出复杂、灵敏且具有选择性的化学感受机制。昆虫依靠化学感受来完成与外界化学信息的交流，通过识别这些信息来指导昆虫的取食、交配、雌性产卵以及躲避天敌等行为，昆虫对信息化合物的识别通常是通过昆虫的化学感器。mckenna等采用消减cdna技术首先在果蝇触角发现了一种可溶性蛋白，称为os-d家族蛋白（olfactoryspecific-d）；pikielny鉴定并获得了果蝇触角内的另一种蛋白a-10蛋白。由于参与感知环境中的化学信息，而且分布在昆虫的化学感受器内，因此称为化学感受蛋白csps，随后多种昆虫的csps陆续被发现。

csps是一种具有较低相对分子质量的蛋白，相对分子质量大致为13kda，组成csp的氨基酸个数在100~115之间，2级结构具有6个α-螺旋，csps的保守半胱氨酸位点只含有4个，这4个保守的半胱氨酸可以形成2个二硫键，csps的进化保守性比较高，不仅同一种昆虫不同的csps之间保持较高同源性，而且不同目和不同科之间的同源性也保持了较高的同源性，例如东亚飞蝗和沙漠蝗csps的同源性为50%~60%，鳞翅目和直翅目csps的同源性为37%~50%。csps的表达分布部位非常广泛，昆虫csps除在触角表达以外，还可以在其他部位表达，例如性腺、下唇须、喙、足等。家蚕和小地老虎的csps经研究发现可以在性腺表达，棉铃虫和烟夜蛾的csp4可以在喙中表达。因此，昆虫csps表达比较广泛，种类比较多样，种间种内分布比较普遍，这些特点有利于使昆虫适应外部环境中多种多样复杂的化学刺激，承担更加复杂的化学感受功能。

昆虫csps承担了多种多样的生理功能，包括：（1）结合运输不同的亲脂性配体，这是昆虫csps最基本的功能。briand等采用荧光结合实验表明，意蜂触角中的asp3c可以结合脂肪及酯类，但不与一般的气味分子及信息素结合；（2）拥有部分嗅觉功能，免疫组化显示，沙漠蝗的csp1-5可以像obps一样在触角感器的淋巴液中表达，因此不少研究者认为这些csps可能兼有部分嗅觉功能；（3）调节昆虫生理节律，例如pebⅲ可能会导致果蝇发育成嗅觉削弱突变型；（4）免疫作用，pebⅲ不仅可以调节昆虫的生物节律而且还可以参与组织修复并识别外界入侵物；（5）调节昆虫发育，guo等采用rna干扰方法研究发现，东亚飞蝗几个csps和一个takeout基因协同调控东亚飞蝗群居型与散居型之间的相互转化。

关于莲草直胸跳甲csp基因的表达等研究国内外未见报道，因此采用实时荧光定量pcr研究不同co2浓度处理下莲草直胸跳甲csp基因的表达特性，结果表明，随着co2浓度的升高，雌雄虫csp基因的表达量均升高，这与转录组表达量上调的变化趋势一致，说明co2浓度升高可以影响csp基因的表达调控。通过昆虫化学感受相关基因作为靶标，依据分子的结构设计配体型药物，从而研发新一代害虫行为干扰化合物，是未来在害虫防治研究领域的前进方向。研究莲草直胸跳甲的化学感受基因可以为莲草直胸跳甲化学感受机制的研究奠定分子基础，为后续深入研究莲草直胸跳甲化学感受相关蛋白的功能以及莲草直胸跳甲的嗅觉机制打下基础。

技术实现要素：

本发明的目的是检测莲草直胸跳甲csp基因表达特性的引物及方法，为全面了解莲草直胸跳甲csp基因的表达特性而设计的不同处理co2浓度。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

将取食不同co2浓度培育的空心莲子草的莲草直胸跳甲雌雄虫各采9只到eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。

设计一对检测莲草直胸跳甲csp基因表达特性的引物，包括符合荧光定量pcr反应特点的上下游引物：

csp-f：5`-gcagccaaaagcagaaagaag-3`

csp-r：5`-atcctcatcatcgcctctaagt-3`

以及作为内参基因的上下游引物：

tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`

tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`

本发明所述检测莲草直胸跳甲csp基因表达特性的荧光定量pcr法，按如下步骤进行：

（1）cdna第一链合成：提取样本的总rna并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的rna为模板反转录得到的cdna；

（2）对下述引物进行常规pcr检测

该基因的荧光定量上下游引物：

csp-f：5`-gcagccaaaagcagaaagaag-3`

csp-r：5`-atcctcatcatcgcctctaagt-3`

以及作为内参基因的上下游引物：

tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`

tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`

常规pcr扩增体系为25µl：10×buffer2.5µl，dntp1.0µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，100ng/µlcdna模板1.0µl，ex-taqe0.15µl，水19.35µl；

常规pcr反应程序如下：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；

（3）实时荧光定量pcr反应：

以步骤（1）得到的cdna为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量pcr反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值。

实时荧光定量pcr扩增体系为：sybr^®premixextaq^tm12.5µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，100ng/µlcdna1.0µl，补足水至25µl；

实时荧光定量pcr反应程序如下：95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火30s，40个循环。

本发明更加详细的试验方法如下：

莲草直胸跳甲csp基因的实时荧光定量pcr检测方法可通过以下步骤实现：

（1）引物设计：根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲csp基因的序列，使用dnaman软件设计适合荧光定量pcr检测的特异性引物，引物序列如下：

csp-f：5`-gcagccaaaagcagaaagaag-3`

csp-r：5`-atcctcatcatcgcctctaagt-3`

同时，根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列，设计用于荧光定量pcr内对照物的引物，引物序列如下：

tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`

tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`

（2）莲草直胸跳甲处理试验：在对照co2浓度（420μl·l^－1）和高co2浓度（750μl·l^－1）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同co2浓度的雌雄虫各采9只到eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样处理后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。

（3）cdna第一链合成：参照全式金公司的transzol^tmupplusrnakit试剂盒说明书提取总rna，按照transscript公司的one-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒说明书，合成cdna第一链。

（4）实时荧光定量pcr反应：实时荧光定量pcr采用takara公司的sybr^®premixextaq^tm试剂盒进行。以上述合成的cdna第一链为模板，上述csp-f、csp-r和tubulin-f、tubulin-r为特异性引物，进行荧光定量pcr程序，每个样品设3个平行重复，扩增后取所得平行ct值的平均数。

实时荧光定量pcr扩增体系为：sybr^®premixextaq^tm12.5µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，100ng/µlcdna1.0µl，补足水至25µl；实时荧光定量pcr反应程序如下：95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火30s，40个循环。

（5）莲草直胸跳甲csp基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为：相对mrna表达=2^-δδct×100%，其中ct值=靶基因ct值-tubulinct值。

（6）图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同co2浓度培育的空心莲子草后csp基因的差异表达。结果表明，随着co2浓度的升高，雌雄虫csp基因的表达量均升高，并与转录组的表达量变化趋势一致，这为我们深入开展莲草直胸跳甲csp基因的研究提供了重要的基础数据。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明中的不同co2浓度处理措施，对昆虫绝大部分化学感受蛋白基因都适用，这对全面深入研究基因表达特性具有重要的意义。

（2）本发明所述高效快捷的荧光定量pcr法，包括荧光定量pcr程序等，实际用时55min，相对于现有技术大大缩短了反应时间，具有高效快捷的特性。

（3）本发明所述的荧光定量pcr法，提供常规pcr电泳结果图，可以直观快捷的反映出引物的特异性。

附图说明

附图为莲草直胸跳甲雌雄虫csp基因转录水平的荧光定量pcr检测结果。

图1：莲草直胸跳甲csp基因荧光定量引物常规pcr产物电泳结果：产物长度为192bp，marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。

图2：莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量引物常规pcr产物电泳结果：产物长度为199bp，marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。

图3：莲草直胸跳甲雌虫（f）取食不同co2浓度培育的空心莲子草后csp基因的差异表达，柱形和左边坐标轴为荧光定量的表达量，散点和右边坐标轴为转录组的表达量。

图4：莲草直胸跳甲雄虫（m）取食不同co2浓度培育的空心莲子草后csp基因的差异表达，柱形和左边坐标轴为荧光定量的表达量，散点和右边坐标轴为转录组的表达量。

具体实施方式

以下结合具体实施例及附图说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制发明，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1

试验材料的处理

在对照co2浓度（420μl·l^－1）和高co2浓度（750μl·l^－1）的人工气候箱里培育空心莲子草，用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫，不同co2浓度的雌雄虫各采9只到eppendorf管中，分为3个生物学重复，共12组样品。虫样收集后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。

实施例2

引物的设计

（1）引物设计：根据转录组测序得到的莲草直胸跳甲csp基因的序列，使用dnaman软件设计适合荧光定量pcr检测的特异性引物，引物序列如下：

csp-f：5`-gcagccaaaagcagaaagaag-3`

csp-r：5`-atcctcatcatcgcctctaagt-3`

莲草直胸跳甲csp基因荧光定量pcr产物长度为192bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量pcr检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

（2）同时，根据转录组测序得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列，设计用于荧光定量pcr内对照物的引物，引物序列如下：

tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`

tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`

莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量pcr产物长度为199bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量pcr检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。

实施例3

总rna的提取

参照全式金公司的transzol^tmupplusrnakit试剂盒说明书提取总rna，用液氮将虫体研磨成粉，加入1mltranszol^tmup，转到1.5ml转离心管中，室温静置5min后，加入200μl氯仿/1mltranszol^tmup，剧烈振荡30s，室温孵育3min。4℃10000g离心15min后，移上层水相（一般<80%）于新的离心管中，加入1/3体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀。将rna离心柱套于2ml收集管中，将上步混合物全部转入离心柱中，12000g，30~60s离心，弃流动相，重复使用收集管。加入500μlcb9，室温12000g离心30s，弃流动相，再加入500μlcb9，室温12000g离心30s，弃流动相。加入稀释的500μlwb9，12000g离心30s，弃流动相，再加入稀释的500μlwb9，12000g离心30s，弃流动相。12000g离心2min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。将离心柱放入rnase-freetube中，加50μlrnase-freewater在离心柱的中央，室温静置1min，12000g离心1min，洗脱rna。所得的rna置于-80℃备用。

实施例4

cdna第一链合成：按照transscript公司的one-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒说明书步骤，以实施例3中的rna为模板，反转录生成cdna第一链，具体步骤如下：

（1）反转录体系

（2）42℃温育30min。

（3）85℃加热5min，产物可放在-20℃、-80℃保存。

实施例5

进行荧光定量pcr反应。实时荧光定量pcr采用takara公司的sybr^®premixextaq^tm试剂盒进行。以实施例4中的cdna为模板，用实施例2中的引物进行实时荧光定量pcr扩增反应，每个样品设3个平行重复，扩增后取所得平行ct值的平均数。

（1）实时荧光定量pcr扩增体系如下：

实时荧光定量pcr扩增体系为：sybr^®premixextaq^tm12.5µl，上游引物0.5µl，下游引物0.5µl，100ng/µlcdna1.0µl，补足水至25µl；

（2）实时荧光定量pcr反应程序如下：95℃预变性30s，然后95℃变性5s、60℃退火30s，40个循环。

（3）实时荧光定量pcr完成后，根据ct值计算不同处理条件下相对表达量的比值2^-δδct。莲草直胸跳甲csp基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为：相对mrna表达=2^-δδct×100%，其中ct值=靶基因ct值-tubulinct值。

表1：莲草直胸跳甲雌虫（f）取食不同co2浓度培育的空心莲子草后csp基因的c(t)值、平均值、标准偏差、荧光定量表达量及转录组的表达量

表2：莲草直胸跳甲雄虫（m）取食不同co2浓度培育的空心莲子草后csp基因的c(t)值、平均值、标准偏差、荧光定量表达量及转录组的表达量

（4）图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同co2浓度培育的空心莲子草后csp基因的差异表达。结果表明，随着co2浓度的升高，雌雄虫csp基因的表达量均升高，与转录组的表达量上调的变化趋势一致。这为我们深入开展莲草直胸跳甲csp基因的研究提供了重要的基础数据。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>检测莲草直胸跳甲csp基因表达特性的引物及方法

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