鉴别大银鱼的分子特异性标记引物及方法与流程

本发明属于动物分子生物学领域，具体涉及一种鉴别大银鱼的分子特异性标记引物以及利用该特异引物对大银鱼进行快速鉴别的方法。

背景技术：

大银鱼，学名：protosalanxhyalocranius(abbott，1901)，属硬骨鱼纲，鲑形目，银鱼科，大银鱼属，是银鱼科中个体最大的一种，一般规格120mm左右，最大个体可达210mm。大银鱼是我国银鱼科分布较广、产量较高且营养价值较高的名贵经济鱼类，主要分布于东海、黄海、渤海沿海及长江、淮河中下游河道和湖泊水库，属河口性鱼类。目前，对大银鱼的物种识别仅局限于形态学鉴定，而且专业鉴定人员很少。由于长江上游水坝修筑导致产卵地遭到破坏；加之外来物种的入侵、水体污染及人为滥捕等导致野生大银鱼自然资源日渐衰竭，已经不能形成优势种群，所以野生大银鱼的种群数量日益下降。因此，对大银鱼进行有效鉴定以及物种保护已经刻不容缓。

dna条形码技术(dnabarcoding)是指用基因组内一段标准的、短的dna片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，可以快速、准确的进行物种鉴定。目前线粒体dnacytb基因序列已被广泛应用在鉴定和区分动物种类及解决系统进化的关系问题上。dna条形码具有广泛的应用前景，在物种鉴定、分子进化、种群遗传、濒危物种保护等研究领域具有一定的发展潜力。dna条形码不同于以往的传统鉴别方法，对研究人员的专业技能并无较高要求，上至生物学家，下至普通生物爱好者，都可在短时间内掌握该技术。dna条形码技术摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，可实现快速准确的鉴定，是分子鉴定方法学上的创新，操作简单、效率高、应用广等特点无疑将改变整个物种鉴定领域的发展方向。运用dna条形码技术，可以很好的对大银鱼进行快速、有效的鉴定。

物种鉴定一直是分类学乃至几乎所有生物领域上的研究至关重要的基础步骤。因此，准确的对物种鉴定，特别是对那些稀有物种和具有保护意义的种类，分类鉴定工作就显得尤其重要。该方法与传统的分类学方法互为佐证，不仅可以解决鉴定中标本残缺不全无法准确鉴定等问题，而且有利于快速鉴定。目前已有专门的鱼类数据库，其中包括1.5万多种鱼类的条形码数据。但是我国许多鱼类由于其特有性，没有足够的相关数据。

技术实现要素：

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种用于鉴别大银鱼的分子特异性标记引物及其应用。

本发明的另一目的在于提供一种快速鉴别大银鱼的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

用于鉴别大银鱼的分子特异性标记引物，该引物的核苷酸序列如下：

上游引物dyy-cytb-f：5’-agcaacatgaaatgttggagta-3’(如seqidno.1所示)；

下游引物dyy-cytb-r：5’-gactacgtccttgataatatag-3’(如seqidno.2所示)。

该对分子特异性引物是采用普通pcr技术，经过比对大银鱼标本的核糖体its区序列的克隆序列，然后通过ncbi的序列比对得到的，上述引物具有极高的专一性，用此对引物进行pcr扩增，可以获得360bp左右的特异性片段。

本发明还涉及上述的分子特异性标记引物(dyy-cytb-f/dyy-cytb-r)在鉴别大银鱼中的应用。

本发明还涉及上述的分子特异性标记引物在制备用于鉴别大银鱼的试剂盒中的应用。

一种用于鉴别大银鱼的试剂盒，该试剂盒中包含上述的分子特异性标记引物。该试剂盒中还包含pcr常用试剂。

一种快速鉴别大银鱼的方法，以待测样本的基因组dna为模板，以上述的分子特异性标记引物(dyy-cytb-f/dyy-cytb-r)作为扩增引物进行pcr扩增，对扩增产物进行电泳检测：如果电泳结果出现dna目的条带，则待测样本为大银鱼。上述的dna目的条带为约360±10bp。

上述pcr扩增的反应程序为：95℃变性5min；95℃、30s，48℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃延伸10min。

上述方法中样本的选择、基因组dna提取、pcr反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，这些步骤均可按照本领域常规方法进行。

需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于大银鱼的形态学特征初步的判断，再将判断为大银鱼的标本运用发明方法鉴别。

本发明所述鉴别大银鱼方法的具体步骤如下：

(1)从浸泡标本中剪取形态学特征初步判断为大银鱼的部分肌肉组织，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。

(2)生物公司试剂盒方法提取样品中的基因组dna，于-20℃保存备用。

(3)以步骤(2)提取的基因组dna为模板，以所述分子特异性标记引物(dyy-cytb-f/dyy-cytb-r)作为扩增引物，进行pcr扩增；

pcr反应体系(总体积为25μl)组成为：

pcr反应程序为：95℃预变性5min；35个循环(95℃、30s，48℃、30s，72℃、30s)；72℃条件下延伸10min。

取5μlpcr产物，用2％琼脂糖凝胶电泳(120v，170ma，30min)，genegreen染料染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示，检出大小约为360±10bp的条带，可初步判定待测样本可能是大银鱼。

本发明的有益效果主要体现在：

本发明的分子特异性标记引物(dyy-cytb-f/dyy-cytb-r)可对大银鱼进行快速的分子鉴定，方法简单、准确、灵敏度高，是形态特征辨别大银鱼的有效辅助手段。

附图说明

图1是采用本发明的分子特异性标记引物对大银鱼进行pcr扩增的电泳图。

其中，m：dna标准分子量标；1,2为空白；3,4为目的片段。

图2是采用本发明的分子特异性标记引物对大银鱼、鲫鱼进行pcr扩增的电泳图。

其中，m：dna标准分子量标；1,2为空白；3,4为大银鱼dna扩增；5,6为鲫鱼dna扩增。

图3是采用本发明的分子特异性标记引物对不同品种的鱼类样本进行pcr扩增的电泳图。

其中，m：dna标准分子量标；1,2为空白；3,4为大银鱼样本1；5,6为大银鱼样本2；7,8为非大银鱼样本1；9,10为非大银鱼样本2；11,12为大银鱼样本3；13,14为非大银鱼样本3；15,16为非大银鱼样本4；17,18为大银鱼样本4；19,20为非大银鱼样本5；21,22为大银鱼样本5。

具体实施方式

本发明可以从分子水平上较为客观准确的鉴别大银鱼。下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

(1)待测大银鱼基因组dna的提取

取大银鱼组织样品，剪碎后使用基因组dna提取试剂盒进行提取，利用2％琼脂糖胶对所得dna进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测dna浓度，于-20℃冰箱存放备用。

(2)设计合成特异性pcr扩增引物

设计合成基于大银鱼的特异性引物：

上游引物dyy-cytb-f：5’-agcaacatgaaatgttggagta-3’；

下游引物dyy-cytb-r：5’-gactacgtccttgataatatag-3’。

由技术人员设计，并由引物设计公司合成。

(3)分子特异性标记引物(dyy-cytb-f/dyy-cytb-r)的pcr扩增

pcr反应体系25μl：10×pcrbuffer2.5μl，dntps0.5μl，taq(5u/μl)0.2μl，mgcl21.5μl，f引物(10μm)1μl，r引物(10μm)1μl，dna模板(约50ng/μl)2μl，ddh2o16.3μl。

pcr反应程序为：95℃预变性5min；35个循环(95℃、30s，48℃、30s，72℃、30s)；72℃条件下延伸10min。

(4)电泳检测：

取5μlpcr产物，用2％琼脂糖凝胶电泳(120v，170ma，30min)，genegreen染料染色。凝胶成像系统检测，电泳图谱如图1所示。

m：dna标准分子量标；1,2为空白；3,4为目的片段。由图1可见，扩增出分子量约为360bp左右的特异性dna条带。

实施例2

用实施例1的方法进行大银鱼、鲫鱼两种鱼块检测，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，在实验人员未知物种名称的情况下开展实验，结果表明仅仅有一种鱼块可扩增出分子量约为360bp左右的特异性dna条带，另一种鱼块样本未能扩增出特异性条带，检测结果与取样人记录信息完全一致。其凝胶电泳结果如图2所示，其中，m：dna标准分子量标；1,2为空白；3,4为大银鱼dna扩增；5,6为鲫鱼dna扩增。因此可表明本发明的核酸分子引物具有极高的专一性，因此可以用于快速的鉴别大银鱼。

实施例3：

从鱼类组织样本中选取2组肌肉组织样，保存在95％酒精中。选取的肌肉组织分属两组不同品种的鱼类，其中一组为大银鱼(5个样品)，另一组为其他品种(5个样品)，取样人根据具体信息做好品种记录并编号，实验操作人员在不清楚2组样本品种归属的情况下进行实验。采用与实施例1相同的实验方法进行实验，pcr产物凝胶电泳结果显示其中一组的5个样品能够扩增出360bp左右的特异性dna条带，为大银鱼的组织样本，另一组的5个样品为非大银鱼的组织样本，实验结果同取样人记录信息完全一致。其凝胶电泳结果如图3所示，其中，m：dna标准分子量标；1,2为空白；3,4为大银鱼样本1；5,6为大银鱼样本2；7,8为非大银鱼样本1；9,10为非大银鱼样本2；11,12为大银鱼样本3；13,14为非大银鱼样本3；15,16为非大银鱼样本4；17,18为大银鱼样本4；19,20为非大银鱼样本5；21,22为大银鱼样本5。

上述实施例为本发明的较佳实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>江苏省高宝邵伯湖渔业管理委员会办公室

<120>鉴别大银鱼的分子特异性标记引物及方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agcaacatgaaatgttggagta22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gactacgtccttgataatatag22