一种广地龙的环介导等温扩增检测引物及基于LAMP技术鉴定广地龙的方法与流程

本发明属于中药材资源鉴定技术领域，具体涉及一种广地龙的环介导等温扩增检测引物及基于lamp技术鉴定广地龙的方法。

背景技术：

广地龙是环节动物门钜蚓科动物，是中国传统的动物中药材，其用药历史悠久，广地龙和广地龙类制剂在临床应用广泛。广地龙有多种药理作用，主要包括降压、平喘、解热抗炎、抗血栓、抗肿瘤等。地龙是中国民间传统用药，根据中国药典记载，地龙包括广地龙和沪地龙，其中广地龙的质量被认为行业品质最优。中国的品种较多，形态大小因品种差异而不同，加工成中药材后，增加了品种的辨别难度。经调查，中药材市场上地龙商品伪品较多，严重影响了中药材用药的稳定性和安全性，需要一种新的鉴定技术，快速完成地龙商品的鉴定。

等温环介导扩增技术(lamp)是一种新的核酸扩增技术，反应可在恒温(60-65℃)条件30-60min内完成扩增。反应结束后，在反应液中加入荧光染料sybrgreeni，通过肉眼观察颜色变化即可判断结果。相比常规pcr技术，lamp反应操作简单，耗时短，不需要昂贵的仪器设备，反应灵敏度高等有点。近几年，lamp技术逐渐用于中药材鉴定和肉制品鉴定中，包括人参、冬虫夏草、木通、牛肉、猪肉等。但有关利用lamp技术鉴定蚯蚓品种未见有报道。本发明利用lamp鉴定技术应用于中药市场的广地龙商品鉴定中，减少市场伪品的混入，为中药材质量提供保障。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、检测时间短、对仪器设备要求低的广地龙的环介导等温扩增检测引物及基于lamp技术鉴定广地龙的方法。

本发明的第一个目的是提供一种广地龙的环介导等温扩增检测引物，所述的检测引物如下所示：

上游内引物fip：5’-caacagccgcagaccttactattttaacataagattttgacttttgcc-3’(如seqidno.1所示)；

下游内引物bip：5’-ggacagtttacccccctttagcttttgctaaatgtagtgagaaaattgca-3’(如seqidno.2所示)；

上游外引物f3：5’-catagcattcccacgtcta-3’(如seqidno.3所示)；

下游外引物b3：5’-acctaaaattgatgaggcac-3’(如seqidno.4所示)。

本发明的第二个目的是提供一种广地龙的环介导等温扩增检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、bstdna聚合酶、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物，所述的检测引物包括：

上游内引物fip：5’-caacagccgcagaccttactattttaacataagattttgacttttgcc-3’(如seqidno.1所示)；

下游内引物bip：5’-ggacagtttacccccctttagcttttgctaaatgtagtgagaaaattgca-3’(如seqidno.2所示)；

上游外引物f3：5’-catagcattcccacgtcta-3’(如seqidno.3所示)；

下游外引物b3：5’-acctaaaattgatgaggcac-3’(如seqidno.4所示)。

所述的阳性对照质控品优选为含有广地龙的coⅰ基因(如seqidno.5所示)的质粒dna。

所述的阴性对照质控品优选为不同于广地龙的coⅰ基因的dna序列或ddh2o。

本发明的第三个目的是提供一种基于lamp技术鉴定广地龙的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组dna作为模板；

(2)使用权利要求1所述的广地龙的环介导等温扩增检测引物，与环介导等温扩增反应液、bstdna聚合酶和待测样品的基因组dna混合形成lamp反应体系，进行环介导等温扩增反应，以阳性对照质控品和阴性对照质控品分别作为阳性对照和阴性对照；

(3)扩增反应完成后，通过与阳性对照和阴性对照进行对比，判断待测样品lamp反应体系中是否扩增得到扩增产物，来判断待测样品是否为广地龙。

通过与阳性对照和阴性对照进行对比，判断待测样品lamp反应体系中是否扩增得到扩增产物，来判断待测样品是否为广地龙具体为通过琼脂糖凝胶电泳法或sybrgreeni荧光染色显色法同时检测阳性对照、阴性对照和待测样品lamp反应体系的扩增产物，根据是否有梯形条带或反应体系的颜色来判断待测样品是否为广地龙。

所述步骤(2)的lamp反应体系总体积优选为25μl：包括dna模板1μl，10pmol/μl的fip和bip各4μl，10pmol/μl的f3和b3各0.5μl，10×bstdna聚合酶缓冲液2.5μl，10mmdntps3.5μl、100mmmgso41.5μl、ddh2o6.5μl和8u/mlbstdna聚合酶1μl。

所述步骤(2)的进行环介导等温扩增反应，其反应参数为：将lamp反应体系中除bstdna聚合酶以外的其他组分混合，置于95℃水浴锅中水浴5min，迅速放在冰上冷却，加入bstdna聚合酶，61-64℃恒温反应50-60min，80℃孵育10min。

所述的阳性对照质控品优选为含有广地龙的coⅰ基因(如seqidno.5所示)的质粒dna。

所述的阴性对照质控品优选为ddh2o。

本发明针对广地龙的coⅰ基因，设计和筛选了一套特异性检测引物以及含有该检测引物的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过环介导等温扩增进而确定待测样品是否为广地龙的鉴定方法。本发明操作简单，结果检测只需肉眼观察，不需要昂贵的检测仪器，灵敏度比常规pcr高1000倍。本发明所需成本低，可应用于地龙商品的真伪鉴定。

附图说明：

图1为实施例1中lamp产物电泳检测图，从左到右，m：marker、1：广地龙(梯形条带)、n：阴性对照。

图2为实施例1中lamp产物可视化检测图，从左到右，1：广地龙(出现绿色)、n：阴性对照(橘黄色)。

图3为实施例2中的灵敏度检测图；其中，a为lamp灵敏度检测图，从左到右依次为：m：marker；1～8为不同稀释梯度的广地龙dna模板，1：1、2：10^-1、3：10^-2、4：10^-3、5：10^-4、6：10^-5、7：10^-6、8：10^-7；n：阴性对照；b为pcr灵敏度检测图，从左到右依次为：m：marker；1～3为不同稀释梯度的广地龙dna模板，1：1、2：10^-1、3：10^-2；n：阴性对照。

图4为实施例3中lamp产物电泳检测图，从左到右为不同产地的地龙，1：广西玉林(活体)、2：广东湛江(活体)、3：广东茂名(活体)、4：广东肇庆(活体)、5：广东阳江(活体)、6：广西北海(活体)、7：玉林中药材市场(干品)、8：玉林中药材市场(干品)、9：淘宝购买(干品)、10：亳州中药材市场(干品)、11：清平中药材市场(干品)、12：清平中药材市场(干品)、n：阴性对照；样品1、7、8、12出现梯形条带。

图5为实施例3中lamp产物可视化检测图，从左到右为不同产地的地龙，1：广西玉林(活体)、2：广东湛江(活体)、3：广东茂名(活体)、4：广东肇庆(活体)、5：广东阳江(活体)、6：广西北海(活体)、7：玉林中药材市场(干品)、8：玉林中药材市场(干品)、9：淘宝购买(干品)、10：亳州中药材市场(干品)、11：清平中药材市场(干品)、12：清平中药材市场(干品)、n：阴性对照；样品1、7、8、12反应液为绿色，样品2、3、4、5、6、9、10、11、n反应液为橘黄色。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1.dna的提取

取鲜活广地龙(参环毛蚓)组织30mg，用动物组织dna提取试剂盒(天根)进行dna提取，得到广地龙dna模板。

2.广地龙引物设计

通过测序及校正，得到广地龙coⅰ基因序列(如seqidno.5所示)，并以coⅰ基因作为靶基因序列，利用primerexplorerv5software，在线设计出4条引物，得到的引物序列如下：

上游内引物fip：5’-caacagccgcagaccttacta-tttt-aacataagattttgacttttgcc-3’(如seqidno.1所示)；

下游内引物bip：5’-ggacagtttacccccctttagc-tttt-gctaaatgtagtgagaaaattgca-3’(如seqidno.2所示)；

上游外引物f3：5’-catagcattcccacgtcta-3’(如seqidno.3所示)；

下游外引物b3：5’-acctaaaattgatgaggcac-3’(如seqidno.4所示)。

3.lamp反应体系的建立

在ep管中加入广地龙dna模板1μl、10pmol/μl的fip和bip各4μl、10pmol/μl的f3和b3各0.5μl、10×bstdna聚合酶缓冲液2.5μl、10mmdntps3.5μl、100mmmgso41.5μl、ddh2o6.5μl。将ep管置于95℃水浴锅中水浴5min，迅速放在冰上冷却，加入1μl8u/mlbstdna聚合酶，63℃恒温反应60min，80℃孵育10min，完成lamp反应。

4.反应产物的检测

取1μlsybrgreeni加入反应液中，肉眼可观察到溶液变为绿色(图2)；取4μl扩增产物于2％琼脂糖凝胶(含eb)电泳，通过凝胶成像仪可观察到梯形条带(图1)。

实施例2：

灵敏度检测：将实施例1提取的广地龙dna模板以1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的稀释梯度进行稀释，分别进行lamp(方法同实施例1)和pcr，比较两种鉴定方法的灵敏度。检测结果(图3)表明，lamp法灵敏度是常规pcr的1000倍。

实施例3：

通过采集不同地方活体地龙、中药材市场购买干品及网上购买干品，一共收集样品12份，按实施例1的方法进行广地龙真伪鉴定。结果表明(图4、图5)样品1、7、8、12为广地龙，其余均为其他品种。显示广地龙的环介导等温扩增检测引物具有良好的特异性。

序列表

<110>广东省生物资源应用研究所

<120>一种广地龙的环介导等温扩增检测引物及基于lamp技术鉴定广地龙的方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

caacagccgcagaccttactattttaacataagattttgacttttgcc48

<210>2

<211>50

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggacagtttacccccctttagcttttgctaaatgtagtgagaaaattgca50

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

catagcattcccacgtcta19

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

acctaaaattgatgaggcac20

<210>5

<211>670

<212>dna

<213>参环毛蚓(pheretimaasperfillme.perrier)

<400>5

tctaggatttgagccggataattggagccggaataagacttcttattcgtattgaattaa60

gacaacctggatccttccttggaagagatcagctatacaacacaattgtaacagcacacg120

catttctaataattttctttctagtaatgccagtatttattggtgggtttggaaactgac180

tgctcccacttatactaggaacccccgacatagcattcccacgtctaaataacataagat240

tttgacttttgccaccatccttaattctattagtaaggtctgcggctgttgaaaagggag300

ccggtaccggatggacagtttacccccctttagcaagaaacatagcacatgcgggcccct360

ctgtagaccttgcaattttctcactacatttagcgggtgcctcatcaattttaggtgcca420

ttaactttatcactacagtaattaacatgcgatgatcggggctacgcttagaacgaattc480

cactatttgtttgagccgtagtaattactgtagtacttctactattgtcgcttcccgtat540

tagccggtgctattactatattactaacagaccgaaatctaaatacatccttctttgacc600

ccgctggaggtggcgacccaattctatatcaacatctattctgattttttggtcacctgg660

gaaagtttaa670