一种黄牛IGF1R基因插入/缺失的检测方法及其应用与流程

本发明属于现代生物技术与家畜育种领域，涉及基因插入/缺失(indel)的检测，特别涉及一种检测黄牛igf1r基因28-bp插入/缺失多态性位点基因型的方法。

背景技术：

动物育种技术主要包括以表型和表型值为基础的常规育种技术和以dna多态为基础的分子育种技术。作为分子育种技术体系的重要组成部分，分子标记辅助选择(marker-assistedselection，mas)育种技术首先检测重要基因的dna多态性，然后分析dna多态与遗传性状之间的相关性，最后再根据与遗传性状显著相关的dna标记进行性状选择。作为现代分子生物学技术发展过程中孕育而生的新技术，mas育种技术在克服表型鉴定的困难、早期选择、进行无损害的性状评价和选择及提高回交育种效率等方面具有优越性。

在mas育种技术体系中，寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点，并分析重要功能基因遗传变异位点与生长性能的相关性，是其应用的前提和关键。插入/缺失(indel)是分子遗传标记的重要方式之一。indel是指dna序列上核苷酸片段的插入或缺失而引起dna序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。插入或缺失片段长度在1-50bp之间，可能包括微小cnv，利用indel分析个体基因组可以更好地解释个体的表型差异，因此从dna水平上对小片段核苷酸的差异进行indel检测在动物分子育种的mas体系中具有重要意义。

插入/缺失(indel)是dna或蛋白质序列水平上发生频率仅次于残基替换的进化改变，大致分成以下5大类：(1)单碱基对的插入/缺失；(2)单一碱基的插入/缺失；(3)重复单元为2～15碱基的多碱基对插入/缺失；(4)转座子插入/缺失；(5)任意dna序列的插入/缺失多态性。随着比较基因组学的深入研究，indel为理论研究和遗传育种应用研究提供了大量的生物信息，其作为新一代的遗传学鉴定标记，兼具snp的优点，与snp相比，均是源于单突变事件，相对比较稳定。在结构上属于二等位基因多态性，等位基因都固定且已知，能够通过很小的扩增子进行扩增(<50bp)，提高了扩增高度降解dna的成功率。作为一种重要的遗传标记，indel的研究最早聚焦在分子生物学及生物医学领域。遍布于整个基因组的indel频率仅次于snp，位居第二，其中约三分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域，如启动子区和外显子区。

indel广泛存在于各种生物的基因组中，目前，对indel的研究多集中在人类和各种农作物的基因组中。2006年，第一个人类基因组indel图谱由mills等人创建，该图谱中有超过41万多个特异性的indel位点，2011年mills又在人类基因组中发现了长度从1bp到10000bp不等的近200万个indel标记，大部分长度集中在100bp以内。对indel的研究在畜禽上则集中在鸡上，在反刍动物上研究和应用甚少。2005年schnabel等人结合ssr标记和indel标记对控制奶牛产奶量进行了研究，成功进行了精细定位。indel位点是通过同源序列比对分析获得，但序列已知的生物种类有限，大多为模式物种或经济作物，对于非模式生物而言，大量基因组序列未知，导致indel引物设计与开发存在一定的难度。

随着经济发展和人们生活水平的不断提高，社会对黄牛产品的需求不断加强，但由于近年来牛肉、牛奶等产品严重短缺，所以黄牛育种专家期望更早、更好、更快地获得黄牛产品的优良品种。在高产、优质和高效的黄牛育种目标上，黄牛育种专家一直关注生长发育性状。首先在dna水平上筛查和检测与黄牛生长发育性状密切相关的dna标记，然后进行基因多态性的检测，进行基因多态性与生长发育性状的关联分析，最后根据与性状显著相关的indel标记进行性状优势个体的选择。

胰岛素样生长因子i型受体(insulin-likegrowthfactor-ireceptor，igf1r)是胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactors，igfs)发挥生物学效应的效应器，它可以调节igfs的半衰期和活性，对胚胎期及个体出生后的生长十分必须，它在免疫调节、淋巴细胞的生成、肌肉和骨的生长起着非常重要的作用。目前揭示了igf1r基因的变异会影响igf1r的生理功能，甚至会导致生长的受阻、产生肿瘤和其他一些疾病。作为影响生长和分化的重要因子，igf1r基因的研究在人、鼠等物种中均有报道，但在牛上的报道较少。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种黄牛igf1r基因插入/缺失的检测方法及其应用，从而加快黄牛良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种黄牛igf1r基因插入/缺失的检测方法，以待测黄牛(例如，晋南牛)全基因组dna为模板，以引物对p1为引物，通过pcr扩增黄牛igf1r基因部分片段；再对pcr扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛igf1r基因28-bp插入/缺失多态性位点(igf1r基因参考序列ac_000178.1:g8086630-8086657deltgtcctggggcacgtggtctcggccctc位点)的基因型；所述引物对p1为：

上游引物：5’-cgaagtgggacttgaggc-3’；

下游引物：5’-agacaactgggagaagggac-3’。

所述pcr扩增的反应程序为：

1)95℃预变性5min，然后进入步骤2)；

2)循环一：95℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸30s；共18个循环，第一次循环后，复性温度逐次降低1℃，然后进入步骤3)；

3)循环二：95℃变性30s，58～60℃复性30s，72℃延伸30s；共20个循环，然后进入步骤4)；

4)72℃延伸10min。

所述琼脂糖凝胶电泳采用的琼脂糖凝胶的质量浓度为2.5％。

所述插入/缺失多态性位点的基因型中，插入/插入基因型的电泳结果表现为405bp一条带纹；插入/缺失基因型表现为405bp和377bp两条带纹；缺失/缺失基因型表现为377bp一条带纹。

一种黄牛igf1r基因插入/缺失的检测试剂盒，该试剂盒包括上述用于pcr扩增黄牛igf1r基因中含有28-bp插入/缺失多态性位点的部分片段的引物对p1。

上述黄牛igf1r基因插入/缺失的检测方法在在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(ii)可作为晋南牛体斜长、胸围和体重的dna标记。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据igf1r基因的序列设计引物，分别以2种黄牛品种的基因组dna为模板，进行pcr扩增，并对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后获得黄牛的igf1r基因的插入/缺失多态性位点(ac_000178.1:g8086630-8086657deltgtcctggggcacgtggtctcggccctc位点)的基因型。通过对2个黄牛品种的上述插入/缺失多态性位点的基因型进行检测和基因频率分析，并与黄牛部分生长性状(例如，体高、体斜长、胸围、体重等)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛(例如，晋南牛)体斜长(p＝0.008)、胸围(p＝0.033)和体重(p＝0.007)的分子标记。结合以上实验结果，本发明提供了针对上述插入/缺失多态性位点的检测方法，通过设计的引物经pcr扩增后再经琼脂糖凝胶电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确的检测其插入/缺失的多态性，从而为黄牛良种选育提供依据，有利于快速建立生长发育性状优良的黄牛遗传资源群体，加快良种选育速度。

附图说明

图1为黄牛igf1r基因28-bp插入/缺失(indel)多态位点(ac_000178.1:g8086630-8086657deltgtcctggggcacgtggtctcggccctc位点)的pcr产物电泳结果；其中，m为markeri。

图2为黄牛igf1r基因8086630-8086657位呈现出插入/缺失的pcr产物测序图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，所述实施例是对本发明的解释而不是限定。

本发明利用pcr扩增方法对黄牛igf1r基因在ac_000178.1:g8086630-8086657deltgtcctggggcacgtggtctcggccctc位点突变可能产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其与生长性状进行关联分析，经验证对该位点的插入/缺失多态性进行检测的结果可以用于黄牛分子标记辅助选择育种，从而加快黄牛良种选育速度。

(一)实验药品与试剂

1.生化试剂与生物学试剂：①taqdna聚合酶(购自fermantas即mbi公司)；②蛋白酶k(购自华美生物工程公司)③；markeri(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

2.普通试剂：普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：tris、edta、nacl、naoh、kcl、na2hpo4、kh2po4、tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(sds)、溴化乙锭(eb)、溴酚蓝、二甲基苯氰ff、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

3.溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵pa)，25min。配制方法均参考sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。

1)提取组织样dna所用溶液：除了基因组dna提取时的公用溶液外，还配制以下试剂：①2mol/lnacl：11.688gnacl溶于水，定容至100ml，高压灭菌。②组织dna提取液(100ml)：lmol/ltris-cl(ph8.0)lml、0.5mol/ledta(ph8.0)20ml，及2mol/lnacl5ml，定容至100ml。

2)琼脂糖电泳分析所用溶液:①1×tbe缓冲液：取10×tbe100ml定容至1000ml。②上样缓冲液：含0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯青ff，及40.0％(w/v)蔗糖的水溶液。

(二)黄牛igf1r基因pcr引物的设计

在ncbi上检索牛igf1r基因的参考序列，并利用primerpremier5.0设计能够扩增包含黄牛igf1r基因第2内含子区域28-bpindel位点(ac_000178.1:g8086630-8086657deltgtcctggggcacgtggtctcggccctc位点)的pcr引物对p1，其引物序列如下(引物设计完成时间为2016年11月)：

上游引物：5’-cgaagtgggacttgaggc-3’；

下游引物：5’-agacaactgggagaagggac-3’。

上述引物对p1对黄牛基因组扩增，能够扩增包含黄牛igf1r基因在ac_000178.1:g8086630-8086657deltgtcctggggcacgtggtctcggccctc位点的indel的不同的基因型片段。理论上，当8086630与8086657nt之间的tgtcctggggcacgtggtctcggccctc缺失时，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是377bp大小的一条带纹；8086630与8086657nt之间的tgtcctggggcacgtggtctcggccctc插入时，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测之后是405bp大小的一条带纹。

(三)pcr扩增待测黄牛的igf1r基因片段

1、黄牛样本的采集

实验所用的动物为2个品种黄牛共计303个样本，其中：

1)晋南牛(jn)样品共173份，采自山西省运城市保种场。采用随机采样方式采取牛场个体的耳组织样品，样品用70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。

2)夏南牛(xn)样品共130份，采自河南省驻马店市泌阳县畜牧局夏南牛繁育场。采用随机采样方式采取牛场个体的耳组织样品，样品用70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。

表1.黄牛样本的采集

2、组织样品基因组dna的提取与分离

1)取约10mg耳组织样，放于1.5ml的离心管中，用小剪刀尽量剪碎。

2)加入600μl组织dna提取液、10％sds至sds终浓度为1％，及蛋白酶k至终浓度为100μg/ml，55℃消化过夜，保证组织样较均匀地分布在组织dna提取液中。

3)将消化后溶液冷却至室温，加入等体积的tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

4)取上清液，加入等体积的酚:氯仿(1:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

5)取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，至少持续10min以上，12000r/min离心15min。

6)取上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l乙酸钠，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至液体清亮，出现白色絮状dna。

7)挑出dna，放进一个1.5ml的离心管中，加入500μl70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。

8)再一次向离心管中加入500μl70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。

9)待干燥后，加入60μl灭菌超纯水，为使其完全溶解，4℃保存过夜，待检测。

3、琼脂糖凝胶电泳检测dna

1)将凝胶电泳槽洗干净，用胶带纸将两端封住，插上梳子。

2)称取2g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入1×tbe80ml使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾2次拿出，待其冷却至不烫手时加入终浓度为0.5μg/ml的核酸染料。然后快速将琼脂糖溶液导入，轻微摇动，防止出现气泡。

3)混匀后(约60℃)，立即将琼脂糖溶液到入槽内。如出现气泡，立即用移液器移出。

4)完全冷却凝固(约25～40min)后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸，将凝胶移入电泳槽中。

5)向电泳槽中加入1×tbe缓冲液，使液面高出胶面2～5mm。

6)取dna样品2～4μl，加2μl上样缓冲液后混匀，统一上样，并将dnamarker加在一边。

7)120v电压电泳45min。

8)在紫外分析仪上观察，如果有rna则需要纯化，如果有明显降解，需重新提取相应样品的dna。

4、dna的纯化

1)500μl的dna溶液中加入10％sds至sds终浓度为0.1％，加入蛋白酶k至终浓度达到100μg/ml。

2)55℃保温10h左右。

3)等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次；其中，采用12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

5)加入1/10体积3mol/l醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀dna。

6)倒掉液体，70％乙醇洗涤后凉干，加入60μl灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

5、分光光度法检测dna

用紫外光光度计测定dna样品在260nm、280nm处的od值。计算dna含量和od260/od280的比值。如od260/od280比值小于1.6，说明含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除rna纯化。

dna浓度(ng/μl)＝50×od260值×稀释倍数

dna检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μl，存于-20℃备用(模板dna)，其余的存放于-80℃。

6、pcr扩增

pcr反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的pcr反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mleppendorfpcr管中，然后加入模板dna，再瞬时离心后进行pcr扩增；pcr反应体系包括2×taqpcrsupermix(包括taqdna聚合酶、dntps和反应缓冲液，浓度为2×)5μl；上游引物0.5μl；下游引物0.5μl(上下游引物浓度为10pmol/μl)；基因组dna(浓度为50ng/μl黄牛基因组dna)1.0μl；去离子水3μl；pcr反应体系共计10μl。

7、pcr反应的程序

pcr扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，68℃复性30s，72℃延伸30s，18个循环，其中，后17个循环中每个循环中复性温度降低1℃；95℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，20个循环之后；72℃延伸10min，10℃保存扩增产物。

(四)pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析

1)制作2.5％的琼脂糖凝胶，点样后120v电压下电泳45min；

2)待分子量不同的dna片段分离清晰时，在bio-radgeldoc2000凝胶成像系统成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳成像分析indel多态性

用bio-radgeldoc2000凝胶成像系统照相分析，判断插入/缺失(indel)的多态性。参见图1、图2，黄牛基因组的igf1r基因在ac_000178.1:g8086630-8086657deltgtcctggggcacgtggtctcggccctc位点的插入/缺失(indel)的多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：插入/缺失基因型(id)表现为405bp和377bp两条带纹，插入/插入基因型(ii)表现为405bp一条带纹，缺失/缺失基因型(dd)表现为377bp一条带纹。

(五)黄牛igf1r基因indel位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。计算的公式可以写成：

ptt＝ntt/n

其中ptt代表某一位点的tt基因型频率；ntt表示群体中具有tt基因型的个体数；n为检测群体的个体总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：

pt＝(2ntt+nta1+nta2+nta3+nta4+……+ntan)/2n

其中，pt表示等位基因t频率，ntt表示群体中具有tt基因型的个体数量，ntai表示群体中具有tai基因型个体数量，a1～an为等位基因t的n个互不相同的复等位基因。

在不同黄牛品种igf1r基因28-bp插入/缺失(indel)位点(ac_000178.1:g8086630-8086657deltgtcctggggcacgtggtctcggccctc位点)中的基因型频率及等位基因频率如表2所示，群体遗传参数如表3所示。晋南牛、夏南牛的等位基因“i”的频率分别为0.699和0.765，相应的等位基因“d”的频率为0.301和0.235，等位基因“i”和“d”的频率均大于1％，故为稳定存在插入/缺失(indel)类型。

表2.黄牛igf1r基因indel位点基因频率分布

表3.黄牛igf1r基因indel位点群体遗传参数

(六)黄牛igf1r基因indel位点基因效应的关联分析

基因型数据：pcr扩增后琼脂糖凝胶电泳识别的基因型。

生产数据：晋南牛和夏南牛体高、十字部高、体斜长、胸围、体重等体尺性状数据。

关联分析模型：利用spss(23.0)软件来分析品种不同因素与生长性状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，依据影响生长发育的因素的不同，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型如下所示：

yijk＝μ+indelj+eijk，

其中：yijk为性状观察值，μ为总体均值，indelj为第j个插入缺失类型的固定效应，eijk为随机误差。各组数据间的差异性采用lsd多重比较进行检验，试验结果以mean±se形式表示。

结果表明：以上黄牛igf1r基因不同基因型频率与等位基因频率的分布对黄牛某些生长性状(如体斜长、胸围和体重)的影响均有显著差异。具体如下：

参见表4，在对173只晋南牛群体的研究中，igf1r基因的28-bp插入/缺失多态性对晋南牛的体斜长(p＝0.008)、胸围(p＝0.033)和体重(p＝0.007)均有显著影响(p<0.05)。而且基因型ii的个体在体斜长、胸围和体重性状上显著大于基因型dd和id的个体，因此，igf1r基因28-bp插入/缺失(indel)位点的基因型ii是晋南牛生长发育的分子标记，可以用于优良黄牛的选育。

表4.igf1r基因indel多态性对晋南牛生长性状的影响

注：同行数据所标字母相异表示差异显著(a,b:p<0.05)或极显著(a,b:p<0.01)。

<110>西北农林科技大学

<120>一种黄牛igf1r基因插入/缺失的检测方法及其应用

<160>3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

cgaagtgggacttgaggc18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

agacaactgggagaagggac20

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>ac_000178.1:g8086630-8086657del

<400>3

tgtcctggggcacgtggtctcggccctc28