筛选具有耐高温特性的中间球海胆用引物及方法与流程

本发明属于生物技术，尤其涉及一种筛选具有耐高温特性的中间球海胆用引物及方法。

背景技术：

中间球海胆（strongylocentrotusintermedius）原产于日本北海道和俄罗斯远东等地沿海，1989年自日本引入我国，现已在大连、山东等地形成一定的人工养殖规模，是我国北方沿海最主要的经济海胆种类，其性腺的国内市场需求量和出口量逐年递增。大量研究表明，海水温度是影响中间球海胆生长和性腺发育的主要因素，中间球海胆在15~18℃左右摄食最为活跃，当水温超过23℃时，则会引起死亡。近年来，中国北黄海夏季海水温度经常出现长时间在25℃以上的情况，导致了养殖中间球海胆的大规模死亡，严重影响了中间球海胆产业的健康发展。但是，迄今为止并没有关于活体筛选具有耐高温特性的中间球海胆的相关报道。

技术实现要素：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种筛选具有耐高温特性的中间球海胆用引物及方法。

本发明的技术解决方案是：一种筛选具有耐高温特性的中间球海胆用引物，其特征在于由1~6号引物对构成，所述1~6号引物对上游引物f1~f6及下游引物r1~r6的dna序列分别如下：

1号f1：5'-cagaagaccctgtggtgaagttg-3'；

r1：5'-aagaggtagctgatgaggattgg-3'；

2号f2：5'-gatggcagcgtctatctttcagt-3'；

r2：5'-ccaaccagtatttccagaacacg-3'；

3号f3：5'-tggtcttgcccctccctcacttg-3'；

r3：5'-tccctaagattacttccttcggt-3'；

4号f4：5'-ttctaaaacgcatcggatacgct-3'；

r4：5'-agtccagtcccacatcattcaag-3'；

5号f5：5'-tgtttacatcagcatctcagcgtc-3'；

r5：5'-cccttctttcccacatccttcaa-3'；

6号f6：5'-atgaagatgctgatgttgtttgc-3'；

r6：5'-aggacctccagtgttgagtgttt-3'。

一种用上述引物筛选具有耐高温特性的中间球海胆的方法，依次按照如下步骤进行：

a.提取中间球海胆rna；

b.将中间球海胆rna反转录合成cdna；

c.以所得到的cdna为模板，分别以1~6号引物对进行定量pcr反应；

d.选出定量pcr反应的扩增产物同时满足下列相对表达值的中间球海胆为具有耐高温特性的中间球海胆：

1号引物对扩增产物相对表达值7.57~8.34；

2号引物对扩增产物相对表达值8.41~10.04；

3号引物对扩增产物相对表达值28.50~31.82；

4号引物对扩增产物相对表达值5.13~6.00；

5号引物对扩增产物相对表达值0.20~0.23；

6号引物对扩增产物相对表达值0.32~0.38。

本发明解决了活体筛选具有耐高温特性的中间球海胆的问题，所筛选的具有抗高温特性的中间球海胆可以在25℃水温中正常存活，筛选操作简便、成本低廉、重复性好、准确性较高，实现了耐高温中间球海胆选育的分子辅助育种，进一步提高了选育的准确性和选育效率。

附图说明

图1是本发明实施例与对照组扩增产物相对表达量示意图。

具体实施方式

本发明的筛选具有耐高温特性的中间球海胆的方法，依次按照如下步骤进行：

a.提取中间球海胆rna：

随机挑选100只中间球海胆，分别抽取海胆体腔液，放入1.5ml的离心管中，然后以4000r/min离心10分钟，弃掉上清，重复3次；加入裂解液，用研磨杵将组织彻底研磨，利用rna试剂盒提取rna。所述rna试剂盒采购自tiangen公司，型号为动物组织总rna提取试剂盒（离心柱型）50preps。

b.将中间球海胆rna反转录合成cdna；

对所提取的中间球海胆rna利用反转录试剂盒进行反转录，合成cdna。所用试剂盒采购自takara公司，型号为primescriptrtreagentkit200rxns，反应体系为10μl。

c.以所得到的cdna为模板，分别以1~6号引物对进行荧光定量pcr反应，即以每个引物对单独进行一次荧光定量pcr反应；所述1~6号引物对上游引物f1~f6及下游引物r1~r6的dna序列分别如下：

1号f1：5'-cagaagaccctgtggtgaagttg-3'；

r1：5'-aagaggtagctgatgaggattgg-3'；

2号f2：5'-gatggcagcgtctatctttcagt-3'；

r2：5'-ccaaccagtatttccagaacacg-3'；

3号f3：5'-tggtcttgcccctccctcacttg-3'；

r3：5'-tccctaagattacttccttcggt-3'；

4号f4：5'-ttctaaaacgcatcggatacgct-3'；

r4：5'-agtccagtcccacatcattcaag-3'；

5号f5：5'-tgtttacatcagcatctcagcgtc-3'；

r5：5'-cccttctttcccacatccttcaa-3'；

6号f6：5'-atgaagatgctgatgttgtttgc-3'；

r6：5'-aggacctccagtgttgagtgttt-3'。

每次荧光定量pcr反应程序如下：

注：以abi7500荧光定量pcr仪为参照设定。

荧光定量pcr反应体系为20μl（引物18μl、cdna模板2μl），dna模板的量通常在100ng以下，必要时可以稀释。

d.计算每次荧光定量pcr扩增产物的相对表达量，选出扩增产物同时满足下列相对表达值的中间球海胆为具有耐高温特性的中间球海胆：

1号引物对扩增产物相对表达值范围7.57~8.34；

2号引物对扩增产物相对表达值范围8.41~10.04；

3号引物对扩增产物相对表达值范围28.50~31.82；

4号引物对扩增产物相对表达值范围5.13~6.00；

5号引物对扩增产物相对表达值范围0.20~0.23；

6号引物对扩增产物相对表达值范围0.32~0.38。

最终选出58只具有耐高温特性的中间球海胆。

对比实验：

本发明实施例以为内参(β-actin)引物为对比，以上述所得到的cdna为模板并以同样反应体系及反应程序进行荧光定量pcr反应，扩增产物相对表达量对比结果如图1所示。

耐高温实验：

将本发明实施例所选出的58只具有耐高温特性的中间球海胆与选剩的42只中间球海胆分别置于两个网笼内并在同一养殖池内养殖1个月。养殖期间除养殖水温为25℃外，其余养殖条件均同现有技术。养殖1个月后，所选出的58只具有耐高温特性的中间球海胆存活率为100%，而其它42只中间球海胆则全部死亡。

序列表

<110>大连海洋大学

<120>筛选具有耐高温特性的中间球海胆用引物及方法

<160>12

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<222>(1)..(23)

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<222>(1)..(23)

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