骨关节炎诊治标志物GPA33及其用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及gpa33在疾病诊断方面的应用。
背景技术：
：骨关节炎(osteoarthritis，oa)是一种以关节软骨退行性病变和继发性骨质增生为特性的慢性关节疾病。多见于中老年人，女性多于男性。好发于负重较大的膝关节、髋关节、腰骶部脊柱关节(lumbosacraljoint)及第一跖趾关节(firstmipjoints)等部位，以及手部的远端指间关节(dipjoints)、近端指间关节(pipjoints)。该病亦称为骨关节病、退行性关节炎、增生行关节炎、退化性关节炎、骨性关节炎等。病因：由于关节腔中缺少了粘性的滑液(关节液)，导致原本应该充当骨关节中作为软垫的软骨不正常磨擦，造成破坏与退化。当软骨退化后，伴随肌肉萎缩韧带松驰。分类：原发性，指发病原因不明，患者没有创伤、感染、先天性畸形病史，无遗传性缺陷，无全身代谢及内分泌异常。多见于50岁以上的中老年人。继发性，指由于先天性畸形，如先天性髋关节脱位；创伤，如关节内骨折；关节面后天性不平整，如骨的缺血性坏死；关节不稳定，如关节囊或韧带松弛等；关节畸形引起的关节面对合不良，如膝内翻、膝外翻等原因，在关节局部原有病变的基础上发生的骨关节炎。目前临床上对于骨关节炎的诊断主要基于影像学的检查。x线表现主要为关节间隙狭窄，软骨下骨质硬化及囊性变，关节边缘骨赘形成，关节面萎陷、变形和关节半脱位等。mri可示早期软骨、半月板等关节结构的病变，有利于早期诊断。ct用于椎间盘病的诊断，优于x线。关节间隙变窄，软骨下骨硬化，边缘性骨刺脊椎关节连成骨桥。亦可见骨囊肿以及畸形。如发现这些变化可作为诊断的依据和估计关节损伤的程度。oa一般在早期没有或很少有症状，只在继发炎症、疼痛或影响关节的活动时，病人才找医生。此时，关节损伤发生已久。因为开发用于早期骨关节炎诊断的方法是亟待解决的问题。在分子水平上尤其是在基因水平上进行骨关节炎的早期诊断已经成为了骨关节炎诊断领域的发展趋势，在诊断方面，申请号为：201510548635.x、2015105495645、2015105486241、201510627048.x、2015107250040、201510724747.6、2015107257552专利文献均披露了可以用于骨关节炎诊断的基因标志物。本申请是在现有技术的启示下寻找新的可以用于骨关节炎诊断的生物标志物。技术实现要素：为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于骨关节炎早期诊断的分子标志物。相比传统的骨关节炎的诊断方法，使用基因标志物来诊断骨关节炎的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了检测gpa33基因表达的产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应用。进一步，上面所提到的检测gpa33基因表达的产品包括：通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测gpa33基因表达水平以诊断骨关节炎的产品。进一步，所述用rt-pcr诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增gpa33基因的引物；所述用实时定量pcr诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增gpa33基因的引物；所述用免疫检测诊断骨关节炎的产品包括：与gpa33蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨关节炎的产品包括：与gpa33基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断骨关节炎的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与gpa33蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与gpa33基因的核酸序列杂交的探针。在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量pcr诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增gpa33基因的引物的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测gpa33基因表达的产品可以应用于该平台实现对gpa33基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知gpa33基因的异常与骨关节炎相关也属于gpa33基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。本发明还提供了一种诊断骨关节炎的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测gpa33基因转录水平的针对gpa33基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的gpa33蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括gpa33基因在内的多个基因(例如，与骨关节炎相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括gpa33蛋白在内的多个蛋白质(例如与骨关节炎相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与骨关节炎的标志物同时检测，可大大提高骨关节炎诊断的准确率。其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测gpa33基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括gpa33蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测gpa33基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对gpa33基因的引物和/或探针。根据gpa33基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测gpa33基因表达水平的引物和探针。与gpa33基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。所述高通量测序平台包括检测gpa33基因表达水平的试剂。所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测gpa33基因的转录水平。进一步，所述gpa33蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述gpa33蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与gpa33蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。在本发明的具体实施方案中，所述针对gpa33基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物如seqidno.2所示。用于诊断骨关节炎的gpa33基因及其表达产物的来源包括但不限于组织、血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等。在本发明的具体实施方案中，用于诊断骨关节炎的gpa33基因及其表达产物的来源是组织。在本发明的上下文中，“gpa33基因”包括gpa33基因以及gpa33基因的任何功能等同物的多核苷酸。gpa33基因(nc_000001.11(167052836..167090631,complement))序列可在国际公共核酸序列数据库genebank中查询到。在本发明的上下文中，gpa33基因表达产物包括gpa33蛋白以及gpa33蛋白的部分肽。所述gpa33蛋白的部分肽含有与骨关节炎相关的功能域。“gpa33蛋白”包括gpa33蛋白以及gpa33蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括gpa33蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与gpa33的dna杂交的dna所编码的蛋白质。通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是gpa33蛋白的融合蛋白。对于与gpa33蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留gpa33蛋白的生物学活性即可。在本发明的上下文中，“诊断骨关节炎”既包括判断受试者是否已经患有骨关节炎、也包括判断受试者是否存在患有骨关节炎的风险。本发明的优点和有益效果：本发明首次发现了gpa33基因表达与骨关节炎相关，通过检测受试者中gpa33的表达，可以判断受试者是否患有骨关节炎、或者判断受试者是否存在患有骨关节炎的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。本发明发现了一种新的分子标记物-gpa33基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现骨关节炎的早期诊断，从而降低骨关节炎的死亡率。附图说明图1显示利用qpcr在mrna水平上检测gpa33基因表达的统计图。具体的实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1筛选差异表达基因1、取材：5例oa患者的滑膜组织(oa组)来自于行膝关节置换或滑膜切除术的oa病人。所用病例符合altam提出的关于oa的诊断标准。3例正常滑膜组织(nor组)来自于外伤手术病人关节滑膜组织。本研究中所用临床样本，均对患者进行知情告知并经医院的伦理委员会通过。选择的研究对象的临床信息如表1所示。表1临床信息2、组织rna的获取从组织样品中提取totalrna，利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。3、mrna文库构建真核生物mrna3’末端具有ploya尾的结构，用带有oligo(dt)的磁珠富集真核生物mrna。加入fragmentationbuffer将mrna打断成短片段，以mrna为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cdna链，然后加入缓冲液、dntps、rnaseh和dnapolymerasei合成第二条cdna链，在经过qiaquickpcr试剂盒纯化并加eb缓冲液洗脱之后做末端修复并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行pcr扩增，使用建好的文库上机测序。4、上机测序lluminahiseqx-ten上机测序流程(mrna)(1)文库富集，pcr扩增15个cycles；(2)2％琼脂糖胶回收目的条带(certifiedlowrangeultraagarose)；(3)tbs380(picogreen)定量，按数据比例混合上机；(4)cbot上进行桥式pcr扩增，生成clusters；(5)hiseqx-ten测序平台，进行2*100bp/300bp测序。5、生物信息学分析测序数据获得以后的mrna分析过程如下所示：(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉n大于10％的reads(用fastqc看一下测序数据的质量，拿到的数据完成处理时可跳过此步)；(2)tophat比对到mrna参考基因组上。mrna所用的参考基因组版本为grch38.p7，fasta和gff文件下载自ncbi；(3)cuffquant定量mrna的表达量并标准化输出；(4)cuffdiff包比较对照组跟疾病组mrna的表达差异。6、结果显著差异mrna筛选条件：p<0.05，|log2fc|>1。用以上标准筛选得到在正常滑膜组织和骨关节炎滑膜组织之间存在差异基因1068个，其中表达上调基因516个，表达下调的基因有552个。实施例2大样本验证筛选出的差异表达基因基于前期测序的结果，根据pvalue的大小，我们选择gpa33基因进行验证。1、样本收集按照实施例1的方法收集骨关节炎滑膜组织和正常滑膜组织各42例。2、在mrna水平上进行验证2.1提取组织rna步骤同实施例1。2.2逆转录反转录使用primescript1ststrandcdnasynthesiskit试剂盒，操作步骤如下进行：(1)在微量离心管中加入以下反应液体，如表2所示：表2反应液体试剂剂量rna2.0μgdntp1.0μloligo(dt)2.0μlrnasefreedh2o加至10.0μl(2)70℃孵育5min，迅速冷却至4℃；在微量离心管内加入以下反应试剂，制成反应体系，如表3所示：表3反应体系的配制试剂剂量5x1ststrandsynthesisbuffer4.0μlprimescriptrtase1.0μlrnaseinhibitor1.0μlrnasefreedh2o4.0μl轻轻震荡，快速离心后，42℃反应1h，70℃10min终止反应，4℃冷却，-20℃保存。采用sybppremixextaptmii试剂盒，在eppendorfreal-timepcr分析仪进行，具体操作如下：(1)在冰上配制以下pcr反应液，如表4所示：表4pcr反应液的配制试剂剂量sybr10.0μl正向引物1.0μl反向引物1.0μlcdna2.0μlddh2o6.0μl总量20.0μl引物序列设计如下：gpa33基因：5’-ctcattatcattggcatcatc-3’(seqidno.1)；5’-atcctccttgtcttcagt-3’(seqidno.2)β-actin：5’-gtggggcgccccaggcacca-3’(seqidno.3)；5’-ctccttaatgtcacgcacgattt-3’(seqidno.4)(2)上机，执行下述程序：95℃预变性3min；95℃变性15s。53.6℃退火20s，72℃延伸20s，共40个循环。结果釆用相对定量法，运用公式2-△△ct计算。实验重复3次。△ct＝ct(a)-ct(β-actin)△△ct＝△ct(实验组)-△ct(对照组)结果显示，42例骨关节炎滑膜组织中有39例骨关节炎滑膜组织中的gpa33基因mrna水平相比正常滑膜组织的平均值显著上调；统计结果如图1所示，与正常滑膜组织相比，骨关节炎滑膜组织中gpa33基因的mrna水平明显增加，差异具有统计学意义(p<0.05)。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。序列表<110>德阳市人民医院<120>骨关节炎诊治标志物gpa33及其用途<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctcattatcattggcatcatc21<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atcctccttgtcttcagt18<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gtggggcgccccaggcacca20<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ctccttaatgtcacgcacgattt23当前第1页12