本发明属于生理学
技术领域：
，涉及失重环境条件一段时间后的生理变化，具体涉及预测失重骨丢失骨碱性磷酸酶balp下降风险的方法与dna甲基化标志物。
背景技术：
：骨碱性磷酸酶(balp)是碱性磷酸酶的骨特异性异构体，是在成骨细胞表面发现的一种糖蛋白，反映了成骨细胞的生物合成活性及功能状况。骨碱性磷酸酶已被证明是一种灵敏可靠的骨代谢指标，是近年来主要用于小儿佝偻病早期诊断和亚临床鉴别的特异性参考指标，也是目前用于评价人体骨矿化障碍的最佳指标。balp来源于成骨细胞，排除了肝、肾、肠道等疾患的影响，能更准确地反映骨代谢情况。当骨形成大于骨吸收时，血清中balp活性则明显增高，因此它是反映成骨细胞活性和骨形成的敏感指标之一。临床上，在骨折愈合过程中，骨形成活跃，balp活性升高；而在引起骨吸收增加的疾病如骨质疏松、骨髓瘤时，balp活性则会降低。失重性骨丢失是一种长期、持续进行性变化，其发展的结果将导致骨质疏松、软组织钙化、肾结石等病理现象发生，甚至出现重力再适应障碍，从而严重影响航天员的身体健康和工作效率。现有的手段难以预防和延缓空间骨丢失。在微重力条件下，骨丢失的速率超过地面上绝经后妇女每月骨密度丢失的10倍。骨密度的测量研究表明在1-6个月的空间驻留期间航天员骨质丢失量在0.9％-1.8％之间，这一比例因测试部位不同而异，目前普遍认为骨质和矿盐每月的丢失量为1％-2％。失重性骨丢失的发生是骨吸收增加和骨形成降低综合作用的结果。失重性骨丢失的发生是在失重以及航天飞行所带来的各种胁迫条件下，骨细胞、成骨细胞与破骨细胞之间相互作用的结果。成骨细胞功能的降低在失重引起的骨丢失中起着关键的作用。血清中balp水平的下降意味着失重或模拟失重状态下机体成骨细胞活性和骨形成能力的下降。综上，失重/模拟失重条件下，人体骨碱性磷酸酶(balp)水平减少与人体成骨细胞活性降低及骨密度下降关系密切。鉴于此，在经受同样的失重/模拟失重条件影响后，人体balp下降水平的差异亦能反映人体对失重条件导致骨丢失耐受程度的个体差异。面向载人航天任务，如能在执行任务前对乘员或受试者在模拟失重条件下的balp下降风险进行预测，对优化成员选拔、为乘员提供早期健康防护干预以及对人体骨碱性磷酸酶(balp)下降风险进行研究，都具有重要应用价值。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明采用-6度头低位卧床人体实验模型，筛选并鉴定了能预测失重后人体血清骨碱性磷酸酶下降风险的表观遗传学指标集合。本发明提供预测失重骨丢失骨碱性磷酸酶balp下降风险的dna甲基化标志物，包括下述一个或多个基因，基因位点注释信息见表3。在表中通过基因符号(第11列)和至少一个染色体位点(第8、9、10列)来识别这些基因的优选甲基化核苷酸位置。这些基因由探针id(列1)进一步识别，其在这些基因中，特别是在它们的调控元件中识别cpg位点(在染色体位点)。本文中的遗传参考文献通常参考基因组humanhg38。在表中，探针id是指在阵列平台上表示的序列，每一个都用于询问特定的cpg位点，染色体(chr)、开始位点(start)和结束位点(end)可以唯一地识别每个探针的第一个nt位置。本发明提供预测失重骨丢失骨碱性磷酸酶balp下降风险的方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括下述步骤：确定受试者样品中骨碱性磷酸酶风险基因位点的dna甲基化水平，并将该基因位点的甲基化水平与对照样品进行比较，从而预测受试者在失重条件骨碱性磷酸酶balp下降风险；其中所述骨碱性磷酸酶风险基因选自权利要求1中的一个或多个基因；所述对照样品选自失重条件下骨碱性磷酸酶balp未下降的样品；所述确定dna甲基化水平的方法可以通过本领域已知的任何方法确定，所述方法包括全基因组甲基化筛选分析、芯片平台的甲基化图谱分析、甲基化特异性pcr分析、飞行质谱检测(sequenome)、亚硫酸盐处理后的基因组测序分析、联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析、甲基化特异性内切酶酶切和定量聚合酶链反应联合分析、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析或焦磷酸测序法检测分析方法。本发明提供权利要求1中所述基因的甲基化检测试剂在制备预测失重骨丢失骨碱性磷酸酶balp下降风险诊断产品中的应用，所述诊断产品包含检测权利要求1中一种或多种基因的甲基化检测试剂，所述试剂通过检测受试者样品中权利要求1中所述基因的甲基化水平，来判断受试者在失重条件下骨碱性磷酸酶是否具有下降风险；作为优选方案，所述试剂是基于全基因组甲基化筛选分析、芯片平台的甲基化图谱分析、甲基化特异性pcr分析、飞行质谱检测(sequenome)、亚硫酸盐处理后的基因组测序分析、联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析、甲基化特异性内切酶酶切和定量聚合酶链反应联合分析、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析或焦磷酸测序法检测分析所需的试剂。作为又一优选方案，所述基因的甲基化水平是在标记基因的开放阅读框架的上游区域，特别是启动子区域确定的；或在下述中的一种：(a)由权利要求1中所示染色体位点所定义的核酸；(b)包含核酸a的cpg位点；(c)与上述核酸a相距距离不超过1000个核苷酸内的核酸(a)。作为又一优选方案，所述试剂包括特异性扩增包含甲基化位点在内的权利要求1中所述基因的引物；作为再一优选方案，所述诊断产品是试剂盒、芯片或测序平台。本发明提供一组核酸引物和/或杂交探针，其对权利要求1中所述一个或多个基因的潜在甲基化区域是特异性的；作为优选方案，所述引物和/或杂交探针是特定于扩增标记基因开放阅读框架的甲基化上游区域，特别是启动子区域；或甲基化的下述中的一种：(a)由权利要求1中所示染色体位点所定义的核酸；(b)包含核酸a的cpg位点；(c)与上述核酸a相距距离不超过1000个核苷酸内的核酸(a)。引物和/或探针用于靶向表3中选择的一个或多个基因的dna分子中的一个潜在甲基化区域。本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求6所述的一组核酸引物或杂交探针，还包括甲基化特异性限制性酶和/或用于亚硫酸氢盐核苷酸脱胺的试剂。本发明提供一种预测失重骨丢失骨碱性磷酸酶balp下降风险的诊断产品，所述诊断产品包括能够检测权利要求1中所述基因甲基化水平的试剂；作为优选方案，所述检测权利要求1中所述基因甲基化水平的试剂包括用于全基因组甲基化筛选分析的试剂、用于基于芯片的甲基化图谱分析的试剂、用于甲基化特异性pcr分析的试剂、用于飞行质谱检测(sequenome)的试剂、用于亚硫酸盐处理后的基因组测序分析的试剂、用于联合亚硫酸氢盐限制性内切酶分析的试剂、用于甲基化特异性内切酶酶切和定量聚合酶链反应联合分析的试剂、用于甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析的试剂或用于焦磷酸测序法检测分析的试剂。作为又一优选方案，所述试剂包括特异性扩增包含甲基化位点在内的权利要求1中所述的基因片段的引物；作为又一优选方案，所述诊断产品是试剂盒、芯片或测序平台。本发明提供预测失重骨丢失骨碱性磷酸酶balp下降的方法，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，步骤如下：(1)测定dna甲基化位点的dna甲基化水平；(2)进行逻辑回归二分类模型构建，并代入下述公式：其中，x＝截距系数+dna甲基化位点的dna甲基化水平×自变量系数，y为骨碱性磷酸酶balp下降风险得分；如y＜0.5，则判定为骨碱性磷酸酶balp下降。本发明通过对血细胞dna甲基化水平与血清骨密度指标(骨碱性磷酸酶，balp)的挖掘，发现通过检测血细胞dna甲基化水平，能够实现对失重后人体骨碱性磷酸酶下降个体差异的预测，从而筛选更加耐受失重条件的个体，或者用于对骨碱性磷酸酶变化情况进行科学研究。本发明提供了对失重后人体骨碱性磷酸酶下降风险有预测功能的dna甲基化位点集合，与人体骨代谢的相关性较高。这一发现为系统揭示失重条件影响引起的人体骨丢失提供了新的线索，值得深入研究。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。本发明提供了可预测在失重后人体骨碱性磷酸酶下降风险的dna甲基化标志物列表(基因位置注释信息及预测性能见表3)，并提供了一种预测失重后人体骨碱性磷酸酶下降风险的方法。在一个具体实施方案中，通过甲基化标志物cg22433798的甲基化水平，评价失重后人体骨碱性磷酸酶下降个体差异，识别骨碱性磷酸酶下降的受试者，进而筛选更加耐受失重条件的个体。本发明虽然不拘囿于任何理论，但发明人认为表3中的甲基化标志物水平与失重条件下骨碱性磷酸酶下降风险之间存在相关关系。在本发明中的一个具体实施方案中，骨碱性磷酸酶下降风险得分y，dna甲基化水平cg22433798的关系满足其中，x＝5161+cg22433798×(-5421)，式中的cg22433798为特定基因位点的dna甲基化水平。如y＜0.5，则判定为骨碱性磷酸酶下降。实施例11、-6度头低位卧床模拟失重模型(1)志愿者试验志愿者为15名健康不吸烟男性，中专及中专以上文化程度。年龄在22岁到34岁之间(m＝26.62，sd＝4.21)，身高在160cm到174cm之间(m＝170.31，sd＝4.02)，体重53～72kg(m＝62.81，sd＝5.90)。无特殊病史，视力或矫正视力正常，均为右利手，非运动员。所有的试验志愿者在接受实验前均填写知情同意书。(2)实验条件15位志愿者在-6度卧位床上保持头向下-6度状态，连续生活45天。实验过程中持续保持身体轴向-6度头部向下状态。(3)实验程序卧床实验开始前1天，通过edta抗凝管采集15位受试者血细胞样本，冻存于-80℃冰箱，留待后续dna甲基化芯片检测；通过elisa技术检测受试者在卧床试验前1天及卧床第45天的血清骨碱性磷酸酶指标。2、数据采集总体情况数据采集情况如表1所示。表1数据采集情况表3、骨碱性磷酸酶balp检测方法与质量控制采用elisa方法检测血清中balp，应用双抗体夹心法测定标本中人碱性磷酸酶(alp)水平。使用immunoway公司的humanbalp(bonealkalinephosphatase)elisa试剂盒。用纯化的人碱性磷酸酶(alp)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入碱性磷酸酶(alp)，再与hrp标记的碱性磷酸酶(alp)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物tmb显色。tmb在hrp酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的碱性磷酸酶(alp)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(od值)，通过标准曲线计算样品中人碱性磷酸酶(alp)浓度。45天-6度头低位卧床试验后，6位受试者骨碱性磷酸酶下降，相对下降幅度为4.4％-49.9％；9位受试者上升。因血清中骨碱性磷酸酶水平的下降意味着机体成骨细胞活性和骨形成能力的下降，故将受试者划分为骨碱性磷酸酶下降高风险组(h组，相对下降幅度超过4％，共计6位受试者)和低风险组(l组，骨碱性磷酸酶水平非下降，共计9位受试者)。表2骨碱性磷酸酶balp的变化趋势4、dna甲基化表达谱检测采用illuminahuman450kdna甲基化芯片检测。鉴于基因芯片技术相对成熟，且国内有运行成熟的商业化技术服务平台，采用外协测试的方式完成illuminahuman450kdna甲基化芯片测试。主要技术环节包括：(1)基因组总dna提取。使用商业化试剂盒qiaampdnaminikit试剂盒提取总dna。(2)dna质检。使用nanodrop及agrosegel质检方法，通过a260/280信号、a260/230信号、dna总量(μg)等质检参数进行提取dna的质量控制。(3)亚硫酸氢盐转化，采用zymoezdnamethylationkit试剂盒处理。(4)wga方式扩增、片段化，采用illumina芯片扫描仪，用genomestudio软件控制。(5)芯片杂交、洗脱、延伸、呈像，采用genomestudio软件。(6)数据分析。上述实验操作按相关试剂盒和公司的标准操作规程进行。5、dna甲基化表达谱芯片数据预处理应用标准的illuminahuman450kdnamethylationchip数据输出文件*.idat文件中，使用r语言平台(v3.4.4)及rstudio工具(v1.1.442)进行数据分析。预处理所用工具包包括：minfi(v1.24.0)，champ(v2.9.10)。通过过滤以下探针：(1)检测p值大于0.01；(2)在超过5％的样本中探针bead-count数小于3；(3)非cg开头的探针；(4)snps位点开头的探针；(5)注释在多个基因位置的探针；(6)注释在x和y染色体上的探针，最后得到412345个探针、15位受试者的dna甲基化表达谱数据，用于后续分析。6、头低位卧床模拟失重条件下腰椎骨丢失风险预测甲基化位点筛选(1)模型特征筛选1——标准差过滤对每个探针计算在15位受试者间的标准差，通过标准差对探针进行排序，筛选出在受试者人群中基准甲基化水平差异较大的探针。筛选阈值设为sd＞0.02，由此筛选出117872个探针，用于后续分析。(2)模型特征筛选2——差异表达筛选对117872个甲基化探针，在骨碱性磷酸酶下降高风险组(h组)和低风险组(l组)间进行t检验分析。以p-value＜0.05为阈值，筛选组间甲基化水平显著差异的探针。由此筛选出2487个探针，用于后续分析。(3)基于逻辑回归模型的单位点预测模型构建及性能分析应用逻辑回归模型，以上述2487个探针中各位点分别进行分类模型构建。采用留一验证方法评价各位点模型的性能，输出模型auc、odds-ratio值、模型精度accuracy、模型精度置信区间及p值等参数信息。以p-value＜0.05为阈值，筛选出133个具有较高预测性能的甲基化位点。其中90个位点注释在已知基因上(表3)。表3对失重条件下骨碱性磷酸酶下降风险具有预测能力的甲基化特征位点集合针对应用逻辑回归模型筛选出的上述90个探针所在基因做功能富集分析。表4中分析结果显示，对失重条件下骨碱性磷酸酶下降风险具有预测能力的甲基化位点所在基因最显著富集于chemokinesignalingpathway信号通路(p-value＝1.22e-2)。表4失重条件下腰椎骨丢失风险预测甲基化位点所在基因的功能富集结果(4)模拟失重前后骨碱性磷酸酶balp下降风险预测模型实例以表3中甲基化位点cg22433798为输入。探针cg22433798对应染色体序列及相应位置信息如下(斜体加粗字体显示，序列包含探针位置上下游25bp核酸序列)，参考基因组为humanhg38：＞chr7：584994-585045(cg22433798)将骨碱性磷酸酶下降高风险组(h组，相对下降幅度超过4％，共计6位受试者)标记分类符为“0”，低风险组(l组，骨碱性磷酸酶水平非下降，共计9位受试者)标记分类符为“1”。使用r语言平台(v3.4.4)及工具包caret(v6.0.80)进行逻辑回归二分类模型构建，对失重条件下骨碱性磷酸酶下降高风险组和低风险组进行预测。预测模型系数如表5。表5预测模型系数变量系数cg22433798(自变量)-5421常变量5161所用计算公式如下：其中，x＝5161+cg22433798×(-5421)，cg22433798为特定基因位点的dna甲基化水平，y为骨碱性磷酸酶下降风险得分。如y＜0.5，则判定为骨碱性磷酸酶下降。通过留一验证分析，该预测模型auc＝1(p-value＝4.7e-04)，其他模型性能参数输出详见表6。结果表明，该预测模型可对数据集中骨密度高风险/低风险人群进行准确预测。表6预测模型性能参数最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12