一种用于二代测序过程中的样本防错的试剂盒的制作方法

本发明属于生物工程
技术领域：
，具体的说，是关于一种用于二代测序过程中的样本防错的试剂盒。
背景技术：
：临床二代测序检验流程步骤繁多，包括取血、核酸提取、dna片段化处理、文库构建、定量、捕获、生物信息学分析等一系列步骤，其中存在大量样本转移和换标签的步骤。中间任何环节都存在样本污染和样本混淆的可能性。一套低成本的qc样本准确性的体系，可以最大程度提高实验室生产数据的质量和准确性，二代测序实验室样本污染和出错的概率，根据不同的管理标准，在0.01-1％之间。另外，实验体系内无内参监控，对于实验过程中的样本信息准确性和污染情况无法监控。而基于snp分型的方法，需要同一份样本同时有snp分型和二代测序结果两组数据，实验成本高(100-1000人民币/case)。同时增加整个实验流程的复杂程度。因此，提供一种用于二代测序过程中的样本防错的试剂盒具有重要的应用价值。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种用于二代测序过程中的样本防错的试剂盒，以用于二代测序过程中的样本防错；本发明的第二个目的是提供一种用于二代测序过程中的样本防错的方法，以用于二代测序过程中的样本防错；本发明的第三个目的是提供上述所述的试剂盒在二代测序的样本防错中的应用。为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：作为本发明的第一个方面，一种用于二代测序过程中的样本防错的试剂盒，所述试剂盒包括16组防错标签质粒和48组捕获探针，其中，所述16组防错标签质粒的序列如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15和seqidno:16所示；所述48组捕获探针的序列如seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32、seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37、seqidno:38、seqidno:39、seqidno:40、seqidno:41、seqidno:42、seqidno:43、seqidno:44、seqidno:45、seqidno:46、seqidno:47、seqidno:48、seqidno:49、seqidno:50、seqidno:51、seqidno:52、seqidno:53、seqidno:54、seqidno:55、seqidno:56、seqidno:57、seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:63和seqidno:64所示。根据本发明，所述16组防错标签质粒的浓度为2ng/ul，所述48组捕获探针等比例混合，浓度为1ng/ul。根据本发明，所述16组防错标签质粒是采用全基因合成方式，将16组防错标签序列分别插入至puc18载体构建获得。根据本发明，所述试剂盒包括：1ng/ul捕获探针混合物5ul；2ng/ul防错标签质粒1ul；rna酶抑制剂2ul；核酸酶free去离子水3ul。作为本发明的第二个方面，一种用于二代测序过程中的样本防错的方法，包括如下步骤：步骤一、裂解细胞，提取核酸；步骤二、dna文库的构建；步骤三、采用上述所述的试剂盒，进行文库的捕获操作，比较加入防错标签和探针，对于整体捕获质量影响。作为本发明的第三个方面，一种上述所述的试剂盒在二代测序过程中的样本防错中的应用。本发明的有益效果是：1、创造性的采用非人源的罕见物种序列做为标签，加入整个实验体系，全流程伴随样本，在生信分析时，对相应序列进行校验，非常低成本高效实现整个质控流程的自动化；2、创造性的开发标签对应生物素标记dna探针，在捕获过程中，实现对应探针的精准捕获。附图说明图1为防错标签和捕获探针混合物对于捕获测序的质量影响的详细流程图。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。实施例1防错标签序列、捕获探针的设计及样本防错试剂盒的使用方法(1)防错标签序列的筛选a、在ncbi核酸库中选择罕见物种序列，与人基因组进行差异性比对，确定haloarculahispanicaicosahedralvirus2,nc_016989.1基因组做为候选序列。b、在步骤a的基因组内对应序列进行360bp为单位的blast比对，最终选出16组360bp的序列组合，筛选的16组防错标签序列如下：hhiv-001cactctctctctctctctggggggaccgcgaccgccgaccgcaccgcaccgcgggccgagcgaggcgagcggaccccgagccggtcgaggccagccgacacatacagctacagctagccgtgccgccccgcaccgccccgccgagtccttgtactactactactactactacgtaatgtagtacattacaccccgtactgcctgctgacaggccacagcgggccagagacgcccgaaaccccaacccgcctttattacagtaccccccggggtttatatgcccgacccaatacccctacgcggccgacagcgacccactgcggcccgacaccccgcagtacggcccgaactgtcagattg(seqidno:1)hhiv-002cgtatgccgtacattacgccaaaacgccgaaaccgcaagacggcggccgaatatggccggacccctttattacagtagccaaaaccgcaggacggcgcggcctttgctgtgagagccgcacagtcggccgctgtgccgctcgaaggtcggcaggacctacgggactcggagcgcgaacaaacagacgggtttgaccggcccgctcgacgctcggcccgtctggcacgaggcagaactaagaactaagccgccgcgccgtccacgtcgaggcgggcaggtgagtcgagcggccgaaactcccgggactccggggtaatgcggcgaggcgacctaggcgctgtcgacccgtaccgcgggttc(seqidno:2)hhiv-003aaatcccgccctgcccgctcttgcttcgaggaaaatccaccgtttcgcgcctatcctttgggcagaacttagctttataccgtgtccggcgagactacaggacagaccggcagcgagccggctacatgaccatgctgtttgcacacctcgcggggctgcccctacggccccgccgacgacgagcagaggaccgtaccgagacaaccgccgacctgacgggggcgctctaatgccgggcgtctctcgcctctctggcacggcgaccaccgccgagggcttcgctatcgagacgagcagcggcggaacagactaccgctacgtcctccgtgtcaccgagcaccgcgaggttcccgacgaggg(seqidno:3)hhiv-004cgacccgacgcccgggaccgtcgaggtcacggaacgctacaagaacggcgaggaggtcgaaccggaggcgactgaggtggtggcccgcactatggacgagtacggctacgaggtcgaggcatgagccgcggcgacccgctcggcgacccgcccgaggaggacaacctgttcaccgacaccgacgacgcggccggccagcccggcccgtcgagcgaccccggcccgctcccgccgacctccgggccggtcgaggccgcgctgtcgaccctgacctacgccgagggtagcgccttcggcctcggcatctgtcccgtcctgacggccctgctcgtgctcccctacgaccccacgctgtcactc(seqidno:4)hhiv-005gtggccctcgcctcggccggcctgctcaccgcgtcgacggccgcccgctcggccctgccgctcggccacgtcggagcgaacgcccactacctgttcgccggccaactcgccggggcagtcctcggtagtctgtgggtcgccctcgtcacgctcgccgcggctgtcggcggggtggtcgcatgagcgacacgcagcgagccgccacggccggcctgctggcgctcggcgtcggggcctttgccgtgggccgccgagtggcggaacgcgacagcgaccaaacagcggcctctacggagggcctgtaatggcggcctacgacggacccgatgacgccccggacgacgtgccggaccacgacgg(seqidno:5)hhiv-006cgaggtccccgaggtcgagcacgccgaacccggcgagctaccccggcgctggtatctgtaccgtatccgcgaccacacgggcctctccggctgcggagtcgtcgcgtggggcgtccaattcccagacgggaaggtcgcctatcattggacgacctcgccccggaccacgcagttcgccgagagcatccacgacgtgcaacacatccacggccacgagggcaaaaccgaggtccgctacgtcgacccggaggtcgaggcatgaccgaggacaagacgatagacgaggtctacgacgaccggaaccacgccgtgctcgccctcgccgagttggtcgcccgcgtcgagggcagcccggtcgcc(seqidno:6)hhiv-007accggcccatacgccgcctgttggaagccggacggcggcgacgacgccgacgccgacgagtgggcgatagtctacctgtcgctgccgaccgggcaggtgtcctaccacgtcccccgcgacatggtcgaggacgccaacatctaccgggacgactcggccgtgtgggacggccacgaccgggccagcaagaacacccgcttatcacggttttacaccgcgtgagacggtagcactaaccgccaatttcccgccgccgtcctgtagttctcgctcattgatatgggacacaacgcctttctatgcccacagttgataatgaagtggcaacttcgacggttgccctcctcgctacatgggcga(seqidno:7)hhiv-008gaaggccccgggtggaaccgggccgagggcgggtgttcctaagcactgtccgccctcacctacgttttcgcgttcctcactcaaaaatatacacggccaactgtcgagcaacccccggccaataccaccgccaaaacagggccgccgtctggcggttctcgattctgcccaacctatacggagcgccggcccgaccaacgatacggctacatggtcgattctaccctgcgccgggagtgcccggcatgagtgcgagcacagtgta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tcgccgagagcgtcgccgcgagcgacccgatacgcgagcaggtcgacggcgctgccgacgacggaggagacgaccgcgccacgttcggggccggggcggcccgtgacgcggcag；(seqidno:64)(4)样本防错试剂盒的使用方法a、16组防错标签质粒按照1-16号标记，浓度为2ng/ul(下文以防错标签作为该组分的特异性说明)；b、将上述48组捕获探针用10mmtebuffer稀释至25ng/ul，接着，将稀释好探针按照等比例混合，稀释至1ng/ul(-20度保存)，(下文以捕获探针混合物作为该组分的特异性说明)。实施例2磁珠法红细胞提前裂解方法步骤1：在2mlep管的管盖上标记编号，置于ep管架上。管内加入900μl新型红细胞裂解液。将血液颠倒混匀20-30次，吸取900μl血液加入对应ep管内，盖紧管盖，25℃1200rpm恒温震荡8min。12000rpm离心2min，小心去除上清，不要将底部沉淀倒出，用纸巾清洁管口，确保液体不要飞溅至管盖或其他ep管内。向管内再次加入1ml新型红细胞裂解液，25℃1200rpm恒温震荡5min。12000rpm离心2min，去除上清，用纸巾清洁管口，确保液体不要飞溅至管盖或其他ep管内。此时管内有明显微红色或乳白色沉淀。向管内加入50μl蛋白酶k和150μl缓冲液bb(或pbs)，25℃1200rpm恒温震荡5min。接着，向对应的孔位中加入表1的成分及分装量。表1各孔位加入的成分和分装量备注：加入防错标签(barcode)时需要双人确认，确认信息包括：barcode编号及抽提编号是否对应。步骤2：将上一步经过预处理的ep管内液体和沉淀，全部加入深孔板1,7列对应编号的孔内。步骤3：上机。将深孔板第6列盖上封口膜，放入自动核酸提取仪，确保深孔板与底部加热模块贴合紧密，深孔板放置平稳无晃动。在机器1,7列装入搅拌套，确认卡紧，关上仪器门，运行900μl提取程序。步骤4：步骤3运行10s后，暂停并复位，取出搅拌棒倒置在干净的纸巾或封口膜上，取出深孔板，在1,7列中加入375μl无水乙醇，撕去封口膜，重新上机，插入对应搅拌棒，点击步骤3开始运行。按照表3设置核酸提取仪的程序，裂解温度80℃，停止步骤2，洗脱温度65℃，起始步骤5。表3核酸提取盒的程序和条件提取出的核酸位于6,12列，将核酸吸出至1.5mlep管内，贴上标签，保存于-20℃冰。实施例3磁珠法一步红细胞裂解方法按表4在对应孔位加入试剂。表4各孔位加入的成分和分装量步骤2：将采血管颠倒混匀20-30次，用1ml血样专用移液枪将200μl血样加入1,7列对应编号孔内。步骤3：将深孔板第6列盖上封口膜，放入自动核酸提取仪，确保深孔板与底部加热模块贴合紧密，深孔板放置平稳无晃动。在机器1,7列装入搅拌套，确认卡紧，关上仪器门，运行200μl提取程序。步骤4：步骤3运行10s后，需暂停复位，取出搅拌棒倒扣在干净的纸巾或封口膜上，取出深孔板，在1,7列加入300μl无水乙醇，撕去封口膜，重新上机，插入对应搅拌棒，点击步骤3开始运行。按照表5设置核酸提取仪的程序，裂解温度80℃，停止步骤2，洗脱温度65℃，起始步骤5。表5核酸提取盒的程序和条件提取出的核酸位于6,12列，将核酸吸出至1.5mlep管内，贴上标签，保存于-20℃冰箱。实施例4手工柱式提取方法说明初次使用新的试剂盒需要在漂洗液pwb中加入60ml无水乙醇，并在瓶身标签上做好标记。1)样本处理取500μl血液样本，在血液样本中加入500μl细胞裂解液cl，颠倒混匀，12000rpm离心1min，弃去上清。注意：若样本量≤200μl，可用缓冲液gs补足至200μl，直接进行下一步核酸提取。向上一步沉淀中加入500μl细胞裂解液cl，振荡混匀(沉淀重新混悬)，12000rpm离心1min，弃去上清。向沉淀中加入200μl缓冲液gs和5ul防错标签，振荡至彻底混匀。2)核酸提取加入200μl缓冲液gb至上步样本处理获得的200μl样品中，充分混匀后室温静置5min。加入20μlproteinasek，充分颠倒混匀，恒温混匀仪56℃低速振荡10min，直至溶液清亮(如溶液未彻底清亮，延长裂解时间，直至溶液清亮为止)。室温静置5min后加入350μl缓冲液bd，充分颠倒混匀。将此步所得溶液(或存在絮状沉淀)都加入吸附柱cg2中(吸附柱cg2需放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱cg2中加入500μl缓冲液gdb，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱cg2中加入600μl漂洗液pwb，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。重复pwb步骤一次，共两次。12000rpm离心2min，倒掉剩余废液(此步操作用于去除残留废液)。将吸附柱cg2开盖，室温静置2min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱cg2转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加100μl洗脱缓冲液tb，室温静置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。实施例5二代测序数据生信校验(1)bwa生信信息分析软件(版本号0.7.15)，设置nc_016989.1基因组序列，对于测序数据采用bwa进行比对分析。(2)bedtools工具，根据设定的bed区域位置对于每个区域内特异性reads进行扫描分析(软件版本v2.26.0-148-gd1953b6)。测序reads>1000的标签号为该样本标签号。对应样本的readscalling结果，如表6所示。表6对应样本的readscalling结果结论:对实验中加入防错标签的16组样本，均能在生信分析过程中，有效检测到对应的序列信息。实施例6防错标签质粒和捕获探针混合物对于捕获测序质量影响a、根据实施例3的方法提取核酸，选择16个新鲜edta抗凝血样本，分别添加标签1-16号or不添加防错标签。b、后续按照标准流程进行后续文库构建。c、相应文库样本，分别采用agilentv6或idt全外显子捕获试剂盒，进行文库的捕获操作，比较加入防错标签和探针，对于整体捕获质量影响。agilentv6全外显子捕获试剂盒操作方案：吸取5ul捕获探针混合物，加入1ul防错标签质粒，加入2ulrnaseblock(核糖核酸酶抑制剂)，核酸酶free去离子水3ul，混合备用。实验结果如表8所示。idt全外显子捕获试剂盒操作方案：吸取5ul捕获探针混合物，加入1ul防错标签质粒，加入2ulrnaseblock，核酸酶free去离子水3ul，混合备用。实验结果如表7所示。表7防错标签和捕获探针混合物对于捕获测序的质量影响表项目号防错标签检测芯片20*覆盖度捕获效率20*覆盖度捕获效率barcode--++hy180765011全外显子(idt)98.70％68.50％98.70％68.40％hy180765022全外显子(idt)98.70％68.50％98.70％68.40％hy180765033全外显子(idt)98.60％68.10％98.60％68.00％hy180765044全外显子(idt)98.60％68.10％98.60％68.00％hy180765055全外显子(idt)99.10％67.40％99.10％67.40％hy180765066全外显子(idt)98.90％67.40％98.90％67.40％hy180765077全外显子(idt)98.50％67.40％98.50％67.50％hy180765088全外显子(idt)98.50％67.40％98.50％67.60％hy180765099全外显子(idt)99.10％67.40％99.10％67.40％hy1807651010全外显子(idt)98.90％67.40％98.90％67.40％hy1807651111全外显子(idt)98.50％67.40％98.50％67.50％hy1807651212全外显子(idt)98.50％67.40％98.50％67.60％hy1807651313全外显子(idt)98.80％67.10％98.80％67.10％hy1807651414全外显子(idt)98.80％67.10％98.80％67.10％hy1807651515全外显子(idt)98.70％66.60％98.70％66.70％hy1807651616全外显子(idt)98.70％66.60％98.70％66.70％表8防错标签和捕获探针混合物对于捕获测序的质量影响表结论：在捕获实验过程中，加入防错标签质粒的dna文库和捕获探针混合物，对于目标区域的捕获效率和覆盖均一性无明显影响。实施例7王某某，送检医学全外检测，在核酸提取过程中，加入3号标签序列，测需数据返回，经实施例5的生信校验发现实际标签为5号标签，回溯整个实验过程，发现在dna打断过程中，3号样本与5号样本发生混淆，从而避免实验过程中出现错误(系统判定结果图)。该方案经实验室3000例以上临床检测样本测试，有效监控实验过程中样本混淆和污染的情况。详细流程图见图1，结果见表9。结果显示，3号样本与5号样本发生混淆。结论：该样本防错试剂盒，可以避免实验过程中出现错误，有效监控实验过程中样本混淆和污染的情况。表9防错标签和捕获探针混合物对于捕获测序的质量影响实施例8snp分型方案根据捕获试剂盒设计，选取中间10-20个snp位点，做为靶点，同一份样本首先采用pcr(聚合酶链式反应)和sanger测序方法，检测相关位点的杂合性。二代测序实验完成，采用生物信息学方法，同样分析对应snp位点杂合性，两者一致，认为二代数据结果准确，与最初的实验样本一致。实验结果见表10。表10snp分型方法和二代测序方法的实验结果。结论：该样本防错试剂盒用于二代测序，其结果准确可靠。以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。序列表<110>上海瀚垚生物医学科技有限公司<120>一种用于二代测序过程中的样本防错的试剂盒<160>64<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cactctctctctctctctggggggaccgcgaccgccgaccgcaccgcaccgcgggccgag60cgaggcgagcggaccccgagccggtcgaggccagccgacacatacagctacagctagccg120tgccgccccgcaccgccccgccgagtccttgtactactactactactactacgtaatgta180gtacattacaccccgtactgcctgctgacaggccacagcgggccagagacgcccgaaacc240ccaacccgcctttattacagtaccccccggggtttatatgcccgacccaatacccctacg300cggccgacagcgacccactgcggcccgacaccccgcagtacggcccgaactgtcagattg360<210>2<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cgtatgccgtacattacgccaaaacgccgaaaccgcaagacggcggccgaatatggccgg60acccctttattacagtagccaaaaccgcaggacggcgcggcctttgctgtgagagccgca120cagtcggccgctgtgccgctcgaaggtcggcaggacctacgggactcggagcgcgaacaa180acagacgggtttgaccggcccgctcgacgctcggcccgtctggcacgaggcagaactaag240aactaagccgccgcgccgtccacgtcgaggcgggcaggtgagtcgagcggccgaaactcc300cgggactccggggtaatgcggcgaggcgacctaggcgctgtcgacccgtaccgcgggttc360<210>3<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aaatcccgccctgcccgctcttgcttcgaggaaaatccaccgtttcgcgcctatcctttg60ggcagaacttagctttataccgtgtccggcgagactacaggacagaccggcagcgagccg120gctacatgaccatgctgtttgcacacctcgcggggctgcccctacggccccgccgacgac180gagcagaggaccgtaccgagacaaccgccgacctgacgggggcgctctaatgccgggcgt240ctctcgcctctctggcacggcgaccaccgccgagggcttcgctatcgagacgagcagcgg300cggaacagactaccgctacgtcctccgtgtcaccgagcaccgcgaggttcccgacgaggg360<210>4<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgacccgacgcccgggaccgtcgaggtcacggaacgctacaagaacggcgaggaggtcga60accggaggcgactgaggtggtggcccgcactatggacgagtacggctacgaggtcgaggc120atgagccgcggcgacccgctcggcgacccgcccgaggaggacaacctgttcaccgacacc180gacgacgcggccggccagcccggcccgtcgagcgaccccggcccgctcccgccgacctcc240gggccggtcgaggccgcgctgtcgaccctgacctacgccgagggtagcgccttcggcctc300ggcatctgtcccgtcctgacggccctgctcgtgctcccctacgaccccacgctgtcactc360<210>5<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gtggccctcgcctcggccggcctgctcaccgcgtcgacggccgcccgctcggccctgccg60ctcggccacgtcggagcgaacgcccactacctgttcgccggccaactcgccggggcagtc120ctcggtagtctgtgggtcgccctcgtcacgctcgccgcggctgtcggcggggtggtcgca180tgagcgacacgcagcgagccgccacggccggcctgctggcgctcggcgtcggggcctttg240ccgtgggccgccgagtggcggaacgcgacagcgaccaaacagcggcctctacggagggcc300tgtaatggcggcctacgacggacccgatgacgccccggacgacgtgccggaccacgacgg360<210>6<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cgaggtccccgaggtcgagcacgccgaacccggcgagctaccccggcgctggtatctgta60ccgtatccgcgaccacacgggcctctccggctgcggagtcgtcgcgtggggcgtccaatt120cccagacgggaaggtcgcctatcattggacgacctcgccccggaccacgcagttcgccga180gagcatccacgacgtgcaacacatccacggccacgagggcaaaaccgaggtccgctacgt240cgacccggaggtcgaggcatgaccgaggacaagacgatagacgaggtctacgacgaccgg300aaccacgccgtgctcgccctcgccgagttggtcgcccgcgtcgagggcagcccggtcgcc360<210>7<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7accggcccatacgccgcctgttggaagccggacggcggcgacgacgccgacgccgacgag60tgggcgatagtctacctgtcgctgccgaccgggcaggtgtcctaccacgtcccccgcgac120atggtcgaggacgccaacatctaccgggacgactcggccgtgtgggacggccacgaccgg180gccagcaagaacacccgcttatcacggttttacaccgcgtgagacggtagcactaaccgc240caatttcccgccgccgtcctgtagttctcgctcattgatatgggacacaacgcctttcta300tgcccacagttgataatgaagtggcaacttcgacggttgccctcctcgctacatgggcga360<210>8<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gaaggccccgggtggaaccgggccgagggcgggtgttcctaagcactgtccgccctcacc60tacgttttcgcgttcctcactcaaaaatatacacggccaactgtcgagcaacccccggcc120aataccaccgccaaaacagggccgccgtctggcggttctcgattctgcccaacctatacg180gagcgccggcccgaccaacgatacggctacatggtcgattctaccctgcgccgggagtgc240ccggcatgagtgcgagcacagtgtacgacaccctcgacaactggcgggaggccgacgacc300tcgatatcgacgggttccggttcggcgtccagcacgaggaggacgagagcgtcgccgtct360<210>9<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9acgtgacccacgcctcgcccggttacgtcgtgtgggtcgccgagggacagcagcgccagc60gcgtcggctacgaggccgacaaggccgacgccaagggcagtatgcagcagtgggcgcaga120agttggcgaacgtccgcgctgcccggtcgttcgtccgcgaaaccggcgtcgaggactacg180ggatagagctacccgacacaatcgccgacaaggacgacgagagtatcccgtacagcgtcg240gcagccggaagattcggcggaagttggccgactactacgagagcaccgacgatatcgccg300aggcgagcgacgacgagttagacagtttcgccggcctcggccctaagacgctcgaagggc360<210>10<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10tgcgcgacgagttcgggggcggcgaccccgaacagttggggccagaccgaccgttccgcc60tcggcgacatggccgacgtggaaccctccggcctcgaattggacgacccggcgaccgaga120taccggggataggcgacgcgaactactacaacgaccggacggttcgctggttctgggaga180acggctgcccgttccacgaggtcggcggccagtatcaacaggacgccctacggaccatac240tcggcgcggagtggttcgacgtggacgccccgagccatgtggtccgggtgttcgctggct300acatgggggccgacgcctacgacgacgacggcaaccaactaggcaactaccccgaggcca360<210>11<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tgtttggtatgttcgactgggacgacgtggctatcgcgtggtcgtggggcgcggactcgg60ccggcgggaacgtcggcagcgagaaagccgccggggccaatatcatcgagcagcaggcgg120ccctcggggccggcgaggacctgccgttccatcaactcgactacgaccccgaggaggact180acggcctgtcggggctgcacgacgtggtcggcatcgacaagcacgagcacgacaaccgaa240agcggagcgtggtctacacggccgacacgtcgccgctcggcgaggtcgagaacgacgagg300tctacatccctcatgatacggtgtggttctactccgtgctgttcggcatcgactacaccg360<210>12<211>360<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12acctccgggtcgcacagcagtac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