一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
。更具体地，涉及是基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统(adeninebaseeditor,abe)脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用。
背景技术：
：crispr/cas9系统是一项新的人工核酸酶技术，其是由grna(guiderna)和cas9蛋白组成的复合物。在靶位点3’末端pam(protospaceradjacentmotif)序列的帮助下，该grna-cas9蛋白复合物通过grna5’末端的20个碱基与靶dna结合，从而将内切核酸酶cas9招募到靶位点处，切割靶dna，从而编辑靶基因。虽然，crispr/cas9技术的出现，极大地提高了基因定点突变的效率，但目前依然无法满足临床基因治疗的需要。最近，基于crispr/cas9技术，科学家开发了新一代的基因编辑系统——腺嘌呤单碱基编辑系统(adeninebaseeditor,abe)。abe系统是由tada:tada*:cas9融合蛋白和grna两部分组分组成的。在grna的引导下，tada:tada*:cas9融合蛋白能够与dna上的靶位点结合，其中与grna互补的dna链会被cas9核酸酶切断，而非互补链上4-9位的a碱基则会被腺嘌呤脱氨酶——tada蛋白——催化脱氨基形成i碱基。随着dna的复制，i(次黄嘌呤，inosine)碱基会被g(鸟嘌呤,guanine)碱基替代，从而实现a至g的碱基置换。与crispr/cas9核酸酶相比，abe系统的效率更高。由于,abe系统能在不诱导dna双链断裂的情况下实现a至g的碱基置换，其安全性比crispr/cas9核酸酶也更高。大约48％的人致病单碱基突变可以通过a至g的碱基置换实现修复，从而最终实现遗传疾病的治疗，所以abe系统在人类疾病基因治疗领域有着广泛的应用前景。但是，目前仍未有一项能够在全基因组范围内检测abe系统脱靶效应的方法，这严重制约了abe系统的应用。技术实现要素：本发明的目的是针对上述abe系统尚无全基因组范围内检测脱靶效应的方法，提供一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用。在本发明一具体实施例中，本发明通过基因合成、分子克隆、蛋白表达纯化、体外转录、核酸纯化、全基因组测序、pcr产物深度测序、生物信息学分析等技术检测abe系统的脱靶效应。同时，我们还结合细胞转染和pcr产物深度测序技术对该检测方法的有效性和灵敏度进行了验证。本发明上述目的通过以下技术方案实现：第一方面，本发明提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)、将tada:tada*:cas9融合蛋白、一种或多种靶向待测dna序列的grna以及基因组dna共混后进行反应；其中，所述基因组dna包含有待测dna序列,在所述反应体系中，tada:tada*:cas9和grna复合物切割与grna互补的待测dna链，同时将非互补链上的腺嘌呤转变成次黄嘌呤；(2)、在步骤(1)反应后的体系中加入内切核酸酶v切割包含次黄嘌呤dna,造成dna双链断裂；(3)、利用全基因组测序以及生物信息学分析检测腺嘌呤单碱基编辑系统的脱靶效应。在本发明第一方面一具体实施例中，本发明提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法(endov-seq)；所述endov-seq首先利用体外纯化的tada:tada*:cas9融合蛋白与grna共处理基因组dna；tada:tada*:cas9和grna的复合物将切割与grna互补的dna链，同时将非互补链上的a转变成i；然后，利用内切核酸酶v(endonucleasev，enodv)切割包含i碱基的基因组dna,造成dna双链断裂；最后，利用全基因组测序结合生物信息学分析检测dna双链断裂，从而探究abe系统的脱靶效应。我们将这一方法命名为endov-seq。在本发明第一方面一具体实施例中，所述tada:tada*:cas9融合蛋白包括crispr/cas系统的效应蛋白结构域、腺苷脱氨酶结构域。在本发明第一方面一具体实施例中，所述tada:tada*:cas9融合蛋白包括crispr/cas系统的效应蛋白结构域、连接多肽、腺苷脱氨酶结构域。本领域技术人员可以理解的是，本发明所述的tada:tada*:cas9融合蛋白由cas9效应蛋白与腺苷脱氨酶(简称tada蛋白)融合而成，本领域技术人员可以根据需要，利用一条或多条连接多肽，将一个cas9效应蛋白结构域与一个或多个tada蛋白进行连接，获得融合蛋白，在本发明一具体实施例中，所述tada蛋白均重复一次。可以理解的是，所述cas9效应蛋白和tada蛋白的n端和c端的连接顺序为本领域常规技术，连接多肽包括但不限于本领域常规的连接多肽片段，常见地，比如gslinker。本领域技术人员可以理解的是，本领域技术人员可以根据具体需要，针对基因组dna设计任意特异性靶向的grna，并对grna进行本领域熟知的修饰，以提高grna靶向特异性。在本发明一具体实施例中，本发明设计的grna序列包括：hbg：gtggggaaggggcccccaagagg，其中下划线标注的为pam序列vegfa3：ggtgagtgagtgtgtgcgtgtgg，其中下划线标注的为pam序列。本领域技术人员可以理解的是，tada:tada*:cas9融合蛋白中，tada为腺苷脱氨酶的缩写，tada*为tada突变体的缩写，cas9为crispr/cas系统的cas9效应蛋白。进一步地，所述crispr/cas系统的效应蛋白结构域中，所述cas9效应蛋白包括但不限定于无切割活性或仅具有单链切割活性的cas蛋白streptococcuspyogenescas9(spcas9),staphylococcusaureuscas9(sacas9),lachnospiraceaecpf1(lbcpf1),acidaminococcuscpf1(ascpf1),streptococcusthermophiluscas9(stcas9),andneisseriameningitidiscas9(nmcas9)和francisellacpf1(fncpf1)等。进一步地，所述的tada:tada*:cas9融合蛋白中，腺苷脱氨酶tada蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。在本发明第一方面一具体实施例中，所述tada:tada*:cas9融合蛋白的氨基酸序列为seqidno.2所示或为与seqidno.2所示氨基酸至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％一致的序列。在本发明第一方面一具体实施例中，所述tada:tada*:cas9融合蛋白的制备方法是将合成的tada:tada*:cas9融合蛋白原核表达载体(pet42b-abe7.10，seqidno.3)载体在大肠杆菌中进行表达并纯化tada:tada*:cas9融合蛋白。更具体地，该制备过程包括步骤(1)将pet42b-abe7.10转化到bl21startm(de3)e.coli(thermofisher)感受态中。更具体地，步骤(2)诱导tada:tada*:cas9融合蛋白表达的方式是：挑取单克隆37℃过夜培养后1:200接种于1l含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃培养至od600＝0.7–0.8。然后，将培养液放于4℃冰箱静置1h，加入终浓度0.5mmiptg18℃诱导蛋白表达14-16h。更具体地，步骤(3)纯化及保存tada:tada*:cas9融合蛋白的方式是：4000rpm，10min收集诱导后的菌体，加入10ml裂解液(100mmtris-hcl,ph8.0,1mnacl,20％甘油,5mmtcep(sigma-aldrich),0.4mmpmsf(sigma-aldrich)，蛋白酶抑制剂(roche)and20mmimidazole(sigma-aldrich))。超声(5mintotal,2son,5soff)初步破碎细胞。然后，15000rpm，4℃离心10min后收集上清液再次超声(5mintotal,2son,5soff)。之后，15000rpm，4℃离心10min后收集上清液。上清液与ni-nta琼脂糖树脂(gehealthcare)4℃孵育1.5h。混合液倒入层析柱，然后用40ml洗涤液(100mmtris-hcl,ph8.0,0.5mnacl,20％甘油,5mmtcep,20mmimidazole)清洗ni-nta琼脂糖树脂(gehealthcare)。然后，用洗脱液(100mmtris-hcl,ph8.0,0.5mnacl,20％甘油,5mmtcep,270mmimidazole)将蛋白从ni柱洗脱。洗脱蛋白过5ml阳离子交换层析(hi-traphpsp阳离子交换柱，gehealthcare)。然后，用30kda浓缩管浓缩(millipore)至300μl。然后，将浓缩产物过0.22μm滤菌膜(millipore)过滤除菌。用bca试剂盒(piercebiotechnology)测蛋白浓度后暂存于4℃，如需长期保存，则将蛋白用液氮速冻后冻于-80℃保存。更具体地，所述grna的制备方法是包括(1)化学合成grna；(2)体外转录合成grna。在本发明第一方面一具体实施例中，所述反应体系为溶液反应体系，所述溶液反应体系还包含所述tada:tada*:cas9融合蛋白将所述非互补链上的腺嘌呤转变成次黄嘌呤所需的缓冲液组分。在本发明第一方面一具体实施例中，所述步骤(3)包括：对步骤(2)酶切后的体系进行全基因组测序，获得全基因组测序结果；对全基因组测序结果进行生物信息学分析，获得所述腺嘌呤单碱基编辑系统的脱靶数据；进一步地，所述步骤(3)还包括：根据所述脱靶数据预测所述腺嘌呤单碱基编辑系统在细胞(包括人细胞、动物细胞、植物细胞等)或机体内(包括人、动物、植物等)的脱靶效应。第二方面，本发明提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的试剂盒，包括第一方面所提供的靶向目的dna的grna序列或tada:tada*:cas9融合蛋白、endov核酸酶。第三方面，本发明提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法在检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应中的应用。本发明利用体外纯化的tada:tada*:cas9融合蛋白和grna，利用融合蛋白-grna复合物处理基因组dna。然后，利用核酸纯化试剂盒纯化处理过的基因组dna。再利用内切核酸酶v消化以上纯化的基因组dna。消化完成后，再将该基因组dna纯化，并进行全基因组测序检测abe系统的全基因组脱靶效应。该检测方法(endov-seq)和检测结果也在本发明的保护范围之内。同时，还可以根据endov-seq的检测结果，优选出效率和特异性高的grna。endov-seq作为优选grna的方法也在本发明的保护范围之内。另外，上述endov-seq在基因编辑中的应用也在本发明的保护范围之内。本发明将促进以abe系统为工具，进行的精准基因编辑治疗的临床应用，精准疾病模型构建的应用，精准基因编辑植物或作物的培育等应用。第四方面，endov-seq还可以用于检测其他能够将a碱基转变成i碱基的酶或化学试剂的效率和脱靶活性。酶包括但不限定于tada腺嘌呤脱氨酶。本发明具有以下有益效果：本发明提供了基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法，该检测方法可以用于腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的检测，促进腺嘌呤单碱基编辑系统在疾病基因治疗、模型构建、基因编辑植物或作物的培育等应用，具有十分广泛的应用前景。附图说明图1为cas9蛋白、be3蛋白和tada:tada*:cas9蛋白的蛋白凝胶电泳图；第一道泳道为蛋白分子marker，第二道为cas9蛋白，第三道为be3蛋白，第四道为tada:tada*:cas9蛋白；图2为grna琼脂糖凝胶电泳结果，两条泳道均为grna。图3为tada:tada*:cas9蛋白-grna复合物和endov共处理能够切开靶dna分子。图4为enodv-seq能够检测到靶位点处的dna双链断裂。图5为endov-seq检测hbg和vegfa3两条grna介导的abe系统的全基因组范围内的脱靶效应。a图是circosplot展示endov-seq检测到的靶位点及脱靶位点，红色箭头指示的是靶位点。b图是weblog展示的脱靶位点的分子模式。下方标注的是grna的靶序列，其中pam标注为绿色字母。图6为pcr产物深度测序验证hbg的脱靶位点，18个脱靶位点中有6个位点能被验证，并用*号标出。图7为pcr产物深度测序验证vegfa3的脱靶位点，22个脱靶位点中有3个位点能被验证，并用*号标出；图8为本发明基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法(endov-seq)的流程示意图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。本发明一具体实施方式中，本发明提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的系统、方法、试剂盒及其应用。本发明提供的基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法，采用了本发明提供的基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应检测试剂盒，所述方法包括但不限于如下步骤的一个或多个步骤：tada:tada*:cas9融合蛋白的表达纯化和grna的制备1、tada:tada*:cas9融合蛋白的表达纯化制备含编码tada:tada*:cas9融合蛋白基因的重组表达质粒，本实施例中，所述tada:tada*:cas9融合蛋白的原核表达载体为pet42b-abe7.10(seqidno.3)；步骤(1)、将pet42b-abe7.10转化到bl21startm(de3)e.coli(thermofisher)感受态中。步骤(2)、诱导tada:tada*:cas9融合蛋白表达：挑取单克隆37℃过夜培养后1:200接种于1l含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃培养至od600＝0.7–0.8。培养液放于4℃冰箱静置1h，加入终浓度0.5mmiptg18℃诱导蛋白表达14-16h。步骤(3)、纯化及保存tada:tada*:cas9融合蛋白：4℃收集菌体并纯化蛋白。4000rpm，10min收集诱导后的菌体，加入10ml裂解液(100mmtris-hcl,ph8.0,1mnacl,20％甘油,5mmtcep(sigma-aldrich),0.4mmpmsf(sigma-aldrich)，蛋白酶抑制剂(roche)and20mmimidazole(sigma-aldrich))。超声(5mintotal,2son,5soff)初步破碎细胞，15000rpm，4℃离心10min后收集上清液再次超声(5mintotal,2son,5soff)，15000rpm，4℃离心10min后收集上清液。上清液与ni-nta琼脂糖树脂(gehealthcare)4℃孵育1.5h。混合液倒入层析柱，40ml洗涤液(100mmtris-hcl,ph8.0,0.5mnacl,20％甘油,5mmtcep,20mmimidazole)清洗ni-nta琼脂糖树脂(gehealthcare)。然后用洗脱液(100mmtris-hcl,ph8.0,0.5mnacl,20％甘油,5mmtcep,270mmimidazole)将蛋白从ni柱洗脱。洗脱蛋白过5ml阳离子交换层析(hi-traphpsp阳离子交换柱，gehealthcare)。然后用30kda浓缩管浓缩(millipore)至300μl。然后将浓缩产物过0.22μm滤菌膜(millipore)过滤除菌。用bca试剂盒(piercebiotechnology)测蛋白浓度后暂存于4℃，如需长期保存，则将蛋白用液氮速冻后冻于-80℃保存。蛋白表达检测结果如附图1，图1显示了cas9蛋白、be3蛋白和tada:tada*:cas9蛋白的蛋白凝胶电泳图。2、grna的制备本发明实施例通过化学直接合成或者通过体外转录制备grna，其中，体外转录制备grna包括以下步骤①通过pcr的方式获得包含t7启动子的grna转录模板dna。或者将grna编码序列克隆到包含t7启动子的转录载体中，然后将该载体线性化而获得包含t7启动子的grna转录模板dna；②体外转录grna；体外转录grna的方法是：以包含t7启动子的grna转录模板dna为模板，用megashortscriptt7kit(lifetechnologies)转录生产grna。再用rna纯化试剂盒纯化grna(qiagen)，并用不含核酸酶的水洗脱grna，即可获得grna。具体地，grna体外转录方法的操作程序如下：1)以grna转录模板dna为模板，利用megashortscriptt7kit(lifetechnologies)，按照如下表1所示体系配制反应体系。表1反应体系成分用量t710×反应液2μlt7atp溶液2μlt7ctp溶液2μlt7gtp溶液2μlt7utp溶液2μl模板dna1μgt7rna转录酶2μlddh2o加水至20μl37℃反应2h，案后往反应体系中加1μlturbodnase,37℃反应15min。2)grna的纯化，用qiagen的rnaeasykit纯化，按照如下步骤进行：a.加ddh2o使得起始rna的体积为100μl，混匀。b.加350μlbindingsolutionconcentrate到rna样品中，并混匀。c.加250μl100％乙醇，并混匀。d.将样品转移到柱子中，12000g离心15s。e.用500μlwashsolution洗两次，12000g离心15s。f.加50μlddh2o将rna从柱子上洗脱下来。3)结果如图2所示，图2显示了hbg和vegfa3两条grna的琼脂糖凝胶电泳结果。endov-seq检测abe系统在靶位点的单碱基编辑为了验证endov-seq是否能够用于检测abe系统全基因组范围内的脱靶效应，我们利用了一条已经多次被验证能高效靶向靶位点的grna——hek293-2，其靶序列为gaacacaaagcatagactgcggg，其中下划线标注的为pam序列。首先，我们通过pcr的方式扩增出了包含了hek293-2位点的pcr产物，然后将该产物纯化，具体纯化方法如下。按axypreppcrcleanupkit的操作手册进行实验。a.在pcr反应液中，加3个体积的bufferpcr-a并混匀，然后转移到dna制备管，将dna制备管置于2ml离心管中，12,000g离心1min，将滤液弃掉。b.将制备管放回2ml离心管中，加700μlbufferw2，12000g离心1min，将滤液弃掉。c.将制备管放回2ml离心管中，加400μlbufferw2，12000g离心1min，弃滤液。d.12,000g离心3min，使bufferw2中的乙醇充分弃掉。e.将制备管置于新的1.5ml离心管中，在制备管中央加25-30μl的无核酸酶的水，静置1min。12000g离心1min(无核酸酶的水用前先65℃预热)。获得了纯化后的pcr产物之后，将pcr产物加入到20μl反应体系中。该反应体系中含有2μl10×nebuffer3,400nmtada:tada*:cas9融合蛋白,900nmgrnaand200ngpcr产物。37℃反应3h。依次加入rnasea和proteinasek移除grna及蛋白。然后再次按照如上步骤纯化，取100ng与1单位的endov(thermofisher)混合10μl反应体系，65℃反应30min。3％琼脂糖检测。检测结果如图3所示，用endov消化tada:tada*:cas9和grna处理过的pcr产物，能够将包含hek293-2靶位点的pcr产物切断。其中cas9蛋白作为阳性对照。图3的结果说明endov能够用于检测abe系统的脱氨基作用。为了进一步检测endov-seq是否能够用于检测abe系统的脱氨基作用，我们进一步用tada:tada*:cas9融合蛋白和hek293-2grna一起处理人hek293t细胞的基因组dna。首先，我们用基因组dna提取试剂盒从hek293t细胞中提取基因组dna(dneasyblood&tissuekit,qiagen),操作方法完全按照说明书进行。然后用tada:tada*:cas9融合蛋白和hek293-2grna一起处理人hek293t细胞的基因组dna。在500μl反应体系中我们加有50μl10×nebuffer3,400nmabe7.10,900nmgrnaand10μg基因组dna。37℃反应8h。8h后，向反应体系中加入rnasea和proteinasek移除grna及蛋白。然后用苯酚/氯仿/异戊醇仿抽提基因组dna，操作步骤如下。a.向以上反应加入1体积的苯酚/氯仿/异戊醇剧烈混匀，室温下静置10分钟，待分层后12000rpm离心10分钟；b.吸取上层水相，并记录其体积；c.加入1/10体积的3mnaac，加3倍体积冷的无水乙醇(-20℃冰箱)，剧烈混匀。然后，冰上孵育15分钟；d.离心(12000rpm，15分钟，4℃)，用移液器尽可能除去乙醇；e.加入0.5ml70％乙醇洗dna沉淀一次，12000rpm，离心2分钟，吸取并尽可能弃掉乙醇；f.加入30μl水溶解dna，然后用nanodrop测定其浓度；然后，取4μg基因组dna与8单位的endov核酸酶(thermofisher)混合100μl反应体系，65℃反应3h，酚氯仿抽提基因组dna。最后，取1μg基因组dna做全基因组测序。然后用bwa软件将测序的reads比对到人参考基因组。我们发现endov-seq确实能够检测到abe系统介导的靶位点的修饰，结果如图4所示。endov-seq检测abe系统在全基因组范围内的脱靶效应为了进一步探究endov-seq是否能够用于检测abe系统全基因范围内的脱靶效应。我们进一步利用在实施例1中所转录出的hbg和vegfa3两条grna,然后将其分别与tada:tada*:cas9融合蛋白孵育。然后用该蛋白-rna复合物处理hek293-2基因组dna。在500μl反应体系中我们加有50μl10×nebuffer3,400nmabe7.10,900nmgrnaand10μg基因组dna。37℃反应8h。8h后，向反应体系中加入rnasea和proteinasek移除grna及蛋白。然后用苯酚/氯仿/异戊醇仿抽提基因组dna，操作步骤如下。a.向以上反应加入1体积的苯酚/氯仿/异戊醇剧烈混匀，室温下静置10分钟，待分层后12000rpm离心10分钟；b.吸取上层水相，并记录其体积；c.加入1/10体积的3mnaac，加3倍体积冷的无水乙醇(-20℃冰箱)，剧烈混匀。然后，冰上孵育15分钟；d.离心(12000rpm，15分钟，4℃)，用移液器尽可能除去乙醇；e.加入0.5ml70％乙醇洗dna沉淀一次，12000rpm，离心2分钟，吸取并尽可能弃掉乙醇；f.加入30μl水溶解dna，然后用nanodrop测定其浓度；然后，取4μg基因组dna与8单位的endov核酸酶(thermofisher)混合100μl反应体系，65℃反应3h，酚氯仿抽提基因组dna。最后，取1μg基因组dna做全基因组测序。然后，用bwa软件将测序的reads比对到人参考基因组。再利用在线软件(digenome2.0,http://www.rgenome.net/digenome-js/standalone)对基因组各个位点进行打分，确定其切割的分值。参考之前用digenome-seq检测胞嘧啶单碱基编辑系统脱靶效应的研究，我们将分值大于0.1的位点定义为阳性脱靶位点。我们发现endov-seq能够检测到靶位点以及脱靶位点，研究结果如图5所示，endov-seq检测到的脱靶位点见表2和表3。表2endov-seq检测到的hbggrna介导的abe系统的脱靶位点统计表3endov-seq检测到的vegfa3grna介导的abe系统的脱靶位点统计为了进一步研究endov-seq的有效性和敏感度。我们将pcdna3.1-abe7.10载体(由广州艾基生物科技有限公司合成，seqidno.4)与表达hbg(或vegfa3)grna的grna表达载体puc19-spcas9-grna(seqidno.5,本实验室构建)共转染到293t细胞中，48h后收集细胞。利用基因组dna提取试剂盒提取基因组dna(dneasyblood&tissuekit,qiagen),操作方法完全按照说明书进行。然后利用表2和表3中的引物通过pcr扩增靶位点和脱靶位点，并将这些pcr产物用于深度测序。如图6，通过深度测序，我们发现，对于hbg来说，18个脱靶位点中有6个位点能被验证。而对于vegfa3来说，22个脱靶位点中有3个位点能被验证。所以，endov-seq的总验证率为22.5％(9/40)，说明endov-seq能够有效检测abe系统的脱靶效应。对于hbggrna来说，我们发现hbg-ot9位点在细胞内的脱靶效率为0.13％，十分接近pcr产物深度测序的检测极限0.1％1(1.tsai,s.q.etal.circle-seq:ahighlysensitiveinvitroscreenforgenome-widecrispr-cas9nucleaseoff-targets.naturemethods14,607-614(2017).)，说明endov-seq具有很高的灵敏度。以上结果说明，endov-seq能够高效、灵敏地检测abe系统全基因组范围内的脱靶效应。为进一步说明本发明的有益效果，本发明提供了本发明基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法(endov-seq)的流程示意图，如图8所示。如图8，本发明实施例利用体外纯化的tada:tada*:cas9融合蛋白、grna以及基因组dna共孵育。在该反应体系中，tada:tada*:cas9和grna的复合物将切割与grna互补的dna链，同时将非互补链上的a转变成i(次黄嘌呤，inosine)。然后，利用内切核酸酶v(endonucleasev，endov)切割包含i碱基的基因组dna,造成dna双链断裂。最后，利用全基因组测序结合生物信息学分析检测abe系统的脱靶效应。基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统(adeninebaseeditor,abe)脱靶效应的方法，能催化靶位点处腺嘌呤(adenine,a)至鸟嘌呤(guanine，g)的高效置换，在人类疾病基因编辑治疗和疾病模型构建中有广泛的应用前景。但由于crispr/cas9系统的特异性不高，易将tada:tada*:cas9融合蛋白靶向到与grna不完全匹配的脱靶位点上，导致脱靶。严重制约了abe系统的应用。为此，本发明提供的首个能够检测abe系统全基因组范围内脱靶效应的检测方法endov-seq，利用endov-seq能在体外检测到abe系统的脱靶位点，并结合体内实验进行验证。可以预见，endov-seq在基因编辑，尤其是基因编辑治疗领域，将具有广泛的应用前景。本发明所述seqidno.4和seqidno.5的碱基序列分别如下(所述seqidno.4和seqidno.5的碱基序列为商业质粒载体的序列，故不写入后续序列表中)：seqidno.3：gatataccatgggcagcagtcatcatcatcaccatcactcggaggttgaattctcccacgagtattggatgcggcacgctcttacgttagcaaaacgcgcgtgggacgagcgtgaagtaccggtaggcgccgtgttagtgcataataaccgggtcattggtgaaggatggaatcggccgatcgggagacacgatccgacagcacatgctgagattatggctttacggcaaggaggactggttatgcagaactaccggttgattgatgctacactgtacgtaaccttagaaccatgtgtgatgtgtgctggagccatgatacattcccgcatcggaagagtggtttttggggctcgtgatgcaaaaactggcgccgccggaagtcttatggacgtgttacatcatccaggcatgaatcatcgggtcgagattacagagggcattttggcagatgaatgtgctgcattgcttagtgatttcttccgcatgcggagacaggaaatcaaagcccaaaaaaaagctcaaagtagtactgatagtggtggatccagtggaggctcgtcaggctctgaaacgcctggcacatcagaatcggcaacgccagagtcgtcaggaggttcctcaggtggatcttcggaggtcgagttttcacatgagtattggatgcgtcatgccttgacgttggcgaaacgggcgcgcgatgagcgtgaggtgcccgtgggagcggtgttggtactgaataaccgggttataggggaaggatggaaccgggctattgggttacacgacccaacggcgcacgccgagataatggcactgcgccaagggggcttagttatgcagaattatcgccttatcgatgctacactgtatgtaacctttgaaccctgcgtaatgtgtgcgggggctatgatccactcgagaatagggcgcgtggtattcggcgtacgcaacgctaaaaccggggctgcgggctcgttgatggatgttctgcactaccccggaatgaatcacagagtagagatcacggagggaattttggccgacgaatgtgcagctttactgtgctacttttttcggatgccgcggcaagtcttcaacgcacagaagaaggctcaatcttccactgactcaggtggctcgagtggtgggagtagcggatctgagacgccaggcacatcagagagtgcaacccccgagtcatcgggtgggagttccggcggatctgataagaaatactcaataggcttagctatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcgacaacaacttccagaaaagtataaagaaatcttttttgatcaatcaaaaaacggatatgcaggttatattgatgggggagctagccaagaagaattttataaatttatcaaaccaattttagaaaaaatggatggtactgaggaattattggtgaaactaaatcgtgaagatttgctgcgcaagcaacggacctttgacaacggctctattccccatcaaattcacttgggtgagctgcatgctattttgagaagacaagaagacttttatccatttttaaaagacaatcgtgagaagattgaaaaaatcttgacttttcgaattccttattatgttggtccattggcgcgtggcaatagtcgttttgcatggatgactcggaagtctgaagaaacaattaccccatggaattttgaagaagttgtcgataaaggtgcttcagctcaatcatttattgaacgcatgacaaactttgataaaaatcttccaaatgaaaaagtactaccaaaacatagtttgctttatgagtattttacggtttataacgaattgacaaaggtcaaatatgttactgaaggaatgcgaaaaccagcatttctttcaggtgaacagaagaaagccattgttgatttactcttcaaaacaaatcgaaaagtaaccgttaagcaattaaaagaagattatttcaaaaaaatagaatgttttgatagtgttgaaatttcaggagttgaagatagatttaatgcttcattaggtacctaccatgatttgctaaaaattattaaagataaagattttttggataatgaagaaaatgaagatatcttagaggatattgttttaacattgaccttatttgaagatagggagatgattgaggaaagacttaaaacatatgctcacctctttgatgataaggtgatgaaacagcttaaacgtcgccgttatactggttggggacgtttgtctcgaaaattgattaatggtattagggataagcaatctggcaaaacaatattagattttttgaaatcagatggttttgccaatcgcaattttatgcagctgatccatgatgatagtttgacatttaaagaagacattcaaaaagcacaagtgtctggacaaggcgatagtttacatgaacatattgcaaatttagctggtagccctgctattaaaaaaggtattttacagactgtaaaagttgttgatgaattggtcaaagtaatggggcggcataagccagaaaatatcgttattgaaatggcacgtgaaaatcagacaactcaaaagggccagaaaaattcgcgagagcgtatgaaacgaatcgaagaaggtatcaaagaattaggaagtcagattcttaaagagcatcctgttgaaaatactcaattgcaaaatgaaaagctctatctctattatctccaaaatggaagagacatgtatgtggaccaagaattagatattaatcgtttaagtgattatgatgtcgatcacattgttccacaaagtttccttaaagacgattcaatagacaataaggtcttaacgcgttctgataaaaatcgtggtaaatcggataacgttccaagtgaagaagtagtcaaaaagatgaaaaactattggagacaacttctaaacg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技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。序列表<110>中山大学<120>一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用<130>2018<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>167<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metsergluvalglupheserhisglutyrtrpmetarghisalaleu151015thrleualalysargalatrpaspgluarggluvalprovalglyala202530valleuvalhisasnasnargvalileglygluglytrpasnargpro354045ileglyarghisaspprothralahisalagluilemetalaleuarg505560glnglyglyleuvalmetglnasntyrargleuileaspalathrleu65707580tyrvalthrleugluprocysvalmetcysalaglyalametilehis859095serargileglyargvalvalpheglyalaargaspalalysthrgly100105110alaalaglyserleumetaspvalleuhishisproglymetasnhis115120125argvalgluilethrgluglyileleualaaspglucysalaalaleu130135140leuseraspphepheargmetargargglngluilelysalaglnlys145150155160lysalaglnserserthrasp165<210>2<211>1763<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2sergluvalglupheserhisglutyrtrpmetarghisalaleuthr151015leualalysargalatrpaspgluarggluvalprovalglyalaval202530leuvalhisasnasnargvalileglygluglytrpasnargproile354045glyarghisaspprothralahisalagluilemetalaleuarggln505560glyglyleuvalmetglnasntyrargleuileaspalathrleutyr65707580valthrleugluprocysvalmetcysalaglyalametilehisser859095argileglyargvalvalpheglyalaargaspalalysthrglyala100105110alaglyserleumetaspvalleuhishisproglymetasnhisarg115120125valgluilethrgluglyileleualaaspglucysalaalaleuleu130135140seraspphepheargmetargargglngluilelysalaglnlyslys145150155160alaglnserserthraspserglyglyserserglyglysersergly165170175sergluthrproglythrsergluseralathrproglusersergly180185190glyserserglyglysersergluvalglupheserhisglutyrtrp195200205metarghisalaleuthrleualalysargalaargaspgluargglu210215220valprovalglyalavalleuvalleuasnasnargvalileglyglu225230235240glytrpasnargalaileglyleuhisaspprothralahisalaglu245250255ilemetalaleuargglnglyglyleuvalmetglnasntyrargleu260265270ileaspalathrleutyrvalthrphegluprocysvalmetcysala275280285glyalametilehisserargileglyargvalvalpheglyvalarg290295300asnalalysthrglyalaalaglyserleumetaspvalleuhistyr305310315320proglymetasnhisargvalgluilethrgluglyileleualaasp325330335glucysalaalaleuleucystyrphepheargmetproargglnval340345350pheasnalaglnlyslysalaglnserserthraspserglyglyser355360365serglyglyserserglysergluthrproglythrsergluserala370375380thrprogluserserglyglyserserglyglyserasplyslystyr385390395400serileglyleualaileglythrasnservalglytrpalavalile405410415thraspglutyrlysvalproserlyslysphelysvalleuglyasn420425430thrasparghisserilelyslysasnleuileglyalaleuleuphe435440445aspserglygluthralaglualathrargleulysargthralaarg450455460argargtyrthrargarglysasnargilecystyrleuglngluile465470475480pheserasnglumetalalysvalaspaspserphephehisargleu485490495glugluserpheleuvalglugluasplyslyshisgluarghispro500505510ilepheglyasnilevalaspgluvalalatyrhisglulystyrpro515520525thriletyrhisleuarglyslysleuvalaspserthrasplysala530535540aspleuargleuiletyrleualaleualahismetilelysphearg545550555560glyhispheleuilegluglyaspleuasnproaspasnseraspval565570575asplysleupheileglnleuvalglnthrtyrasnglnleupheglu580585590gluasnproileasnalaserglyvalaspalalysalaileleuser595600605alaargleuserlysserargargleugluasnleuilealaglnleu610615620proglyglulyslysasnglyleupheglyasnleuilealaleuser625630635640leuglyleuthrproasnphelysserasnpheaspleualagluasp645650655alalysleuglnleuserlysaspthrtyraspaspaspleuaspasn660665670leuleualaglnileglyaspglntyralaaspleupheleualaala675680685lysasnleuseraspalaileleuleuseraspileleuargvalasn690695700thrgluilethrlysalaproleuseralasermetilelysargtyr705710715720aspgluhishisglnaspleuthrleuleulysalaleuvalarggln725730735glnleuproglulystyrlysgluilephepheaspglnserlysasn740745750glytyralaglytyrileaspglyglyalaserglnglugluphetyr755760765lyspheilelysproileleuglulysmetaspglythrglugluleu770775780leuvallysleuasnarggluaspleuleuarglysglnargthrphe785790795800aspasnglyserileprohisglnilehisleuglygluleuhisala805810815ileleuargargglngluaspphetyrpropheleulysaspasnarg820825830glulysileglulysileleuthrpheargileprotyrtyrvalgly835840845proleualaargglyasnserargphealatrpmetthrarglysser850855860glugluthrilethrprotrpasnpheglugluvalvalasplysgly865870875880alaseralaglnserpheilegluargmetthrasnpheasplysasn885890895leuproasnglulysvalleuprolyshisserleuleutyrglutyr900905910phethrvaltyrasngluleuthrlysvallystyrvalthrglugly915920925metarglysproalapheleuserglygluglnlyslysalaileval930935940aspleuleuphelysthrasnarglysvalthrvallysglnleulys945950955960gluasptyrphelyslysileglucyspheaspservalgluileser965970975glyvalgluaspargpheasnalaserleuglythrtyrhisaspleu980985990leulysileilelysasplysasppheleuaspasnglugluasnglu99510001005aspileleugluaspilevalleuthrleuthrleuphegluasparg101010151020glumetileglugluargleulysthrtyralahisleupheaspasp1025103010351040lysvalmetlysglnleulysargargargtyrthrglytrpglyarg104510501055leuserarglysleuileasnglyileargasplysglnserglylys106010651070thrileleuasppheleulysseraspglyphealaasnargasnphe107510801085metglnleuilehisaspaspserleuthrphelysgluaspilegln109010951100lysalaglnvalserglyglnglyaspserleuhisgluhisileala1105111011151120asnleualaglyserproalailelyslysglyileleuglnthrval112511301135lysvalvalaspgluleuvallysvalmetglyarghislyspro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