一种快速检测核酸样本的方法及系统与流程

本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种快速检测核酸样本的方法及系统。

背景技术：

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，是一种生物体外的特殊dna复制过程，pcr的最大特点，是能将微量的dna大幅增加。1983年，美国mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易dna扩增法，意味着pcr技术的真正诞生。到如今2013年，pcr已发展到第三代技术，即绝对定量的数字pcr技术。

通常，pcr(聚合酶链式反应)是利用dna在体外95℃高温时变性成为单链，低温(退火)(通常为55-60℃)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至dna聚合酶最适反应温度(72℃左右)，dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向以dntp为原料合成互补链。基于聚合酶制造的pcr仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行转换控制。实际上，只要有足量的dntp和退火引物，taq酶可以在温度升降过程中使引物延伸。如果仅仅合成35～100bp左右的序列，引物退火温度的要求范围可以高于或者低于理论温度5～10℃，在保证特异性的前体下，合并退火与延伸温度，用双温pcr可比用严格三温度转换更能提高反应速度。

pcr是目前分子诊断领域最成熟也是应用最广泛的技术，从技术层面上看，目前国内pcr技术已基本达到国际先进水平，比如基于半导体制冷的pcr技术。但pcr在国内的临床应用检测量的提升尚有很大的空间，行业内也存在大量的资源整合机会。当前，最常应用的荧光定量pcr产品普遍工作效率不高，通常流程为复杂的核酸提取流程、反复升降温的pcr过程、荧光检测程序，通常单个检测流程需要5个小时以上。基于磁珠法的全自动液体工作站近年逐渐受到重视，但其仪器和配套耗材价格高昂，难以适应国内pcr分子诊断市场。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种快速检测核酸样本的方法及系统，通过pcr反应体系液体或液滴的循环流动代替通常的原位温度模块的反复升降温过程，实现高效、快速、低价pcr，并提供与该套pcr模式相匹配的快速检测核酸样本的装置。

为达上述目的，本发明的主要技术解决手段是提供一种快速检测核酸样本的方法，包括以下步骤：s1：样本提取待检测核酸模板，制成pcr反应体系；s2：pcr扩增；s3：pcr产物检测，其特征在于，所述s2：pcr扩增包括如下步骤：

s21：通过驱动件驱动所述pcr反应体系流经启动温度区，完成dna聚合酶的热启动和待检测核酸模板的变性；

s22：所述驱动件继续驱动所述pcr反应体系循环流动在变性温度区和退火温度区之间进行扩增；

s23：扩增结束后，所述驱动件继续驱动所述pcr反应体系流动到pcr产物检测区。

所述变性温度区和退火温度区之间设有过渡区，所述pcr反应体系依次经过变性温度区、过渡区和退火温度区完成一次pcr循环，所述步骤s22包括1-100次pcr循环。

本发明还公开一种实施上述快速检测核酸样本的方法的系统，包括样本提取装置、pcr扩增装置和pcr产物检测装置，其特征在于，所述pcr扩增装置包括pcr反应体系芯片和线性pcr仪，所述pcr反应体系芯片为液体流芯片，所述液体流芯片包括第一芯片本体，所述第一芯片本体上设有第一逶迤形循环流道，所述第一逶迤形循环流道一端顺次连通有第一逶迤形启动流道、第一预备流道和第一样本孔，所述第一逶迤形循环流道另一端连通有第一收集流道，所述第一收集流道连接有胶体金试纸条，所述线性pcr仪为单通道pcr仪，其包括温度组件、至少两个温控仪和检测组件，所述温度组件包括上下相对设置的上加热组件和下加热组件，且所述上加热组件和下加热组件之间留有容置pcr反应体系芯片的第一间隙，所述上加热组件和下加热组件均包括并排设置的第一加热模块和第二加热模块，所述第一加热模块和第二加热模块之间留有第二间隙，所述上加热组件和下加热组件中的两个第一加热模块与一个温控仪连接，所述上加热组件和下加热组件中的两个第二加热模块与另一个温控仪连接，所述检测组件包括所述上加热组件的第一加热模块和第二加热模块之间设有的荧光检测装置和/或条带扫描装置，所述第一加热模块和第二加热模块上分别贯穿设有一个驱动孔，且两个驱动孔均连接有一个气泵作为驱动件，所述pcr产物检测装置包括荧光检测装置、检测试纸条和液滴读取仪器。

所述pcr反应体系芯片为液滴流芯片，其包括第二芯片本体，所述第二芯片本体上设有第二逶迤形循环流道，所述第二逶迤形循环流道一端顺次连通有第二逶迤形启动流道、第二预备流道和第二样本孔，所述第二预备流道连通有第三样本孔，所述第二逶迤形循环流道另一端连通有检测流道，所述检测流道连接有第二收集流道。

所述线性pcr仪为所述多通道pcr仪，其包括控制器、转盘、至少两个温控仪、多个温度组件和液滴读取仪，转盘包括固定座和枢接在固定座上的转动件，多个温度组件固定在转动件上，液滴读取仪固定在所述固定座上，所述多个温度组件中的第一加热模块均与一个温控仪连接，所述固定座上设有用于将检测完的温度组件内容置的pcr反应体系芯片推出的触动推杆，所述多个温度组件中的第二加热模块均与另一个温控仪连接，所述触动推杆、温控仪、液滴读取仪均与控制器连接。

所述样本提取装置包括样本处理芯片和提取样本处理芯片中样本的自动核酸提取仪，所述样本处理芯片包括设有孔洞的基板，所述基板上围绕孔洞逆时针设有顺次连通的第一弧形腔室、第二弧形腔室、垂直流道、核酸吸附膜腔室、裂解液腔室和第一洗涤液腔室，所述核酸吸附膜腔室靠近孔洞的一侧连通有洗脱液腔室，所述核酸吸附膜腔室另一侧连通有模板存储腔室，所述裂解液腔室上方开口，用于添加待检测样本，所述裂解液腔室、第一洗涤液腔室和洗脱液腔室均设有开口且分别设有裂解液、第一洗涤液和洗脱液，所述核酸吸附膜腔室和裂解液腔室之间、裂解液腔室之间和第一洗涤液腔室之间、所述核酸吸附膜腔室和洗脱液腔室之间以及所述核酸吸附膜腔室和模板存储腔室之间均连接有一填蜡槽，所述核酸吸附膜腔室设有核酸吸附膜，所述填蜡槽内均设有加热可融性固体材料且槽口均设有盖片。

所述裂解液腔室和第一洗涤液腔室之间设有结合液腔室，结合液腔室设有开口且设有结合液，所述裂解液腔室和结合液腔室之间设有一填蜡槽。

所述第一洗涤液腔室顺次连通有第二洗涤液腔室，所述第一洗涤液腔室和第二洗涤液腔室之间设有一填蜡槽；或是所述第一洗涤液腔室顺次连通有第二洗涤液腔室和第三洗涤液腔室，所述第一洗涤液腔室和第二洗涤液腔室之间以及第二洗涤液腔室和第三洗涤液腔室之间均设有一填蜡槽；或是所述第一洗涤液腔室顺次连通有第二洗涤液腔室、第三洗涤液腔室和第四洗涤液腔室，所述第一洗涤液腔室和第二洗涤液腔室之间以及第二洗涤液腔室和第三洗涤液腔室之间以及第三洗涤液腔室和第四洗涤液腔室之间均设有一填蜡槽。

所述自动核酸提取仪包括底座、底座上连接有的可与基板孔洞配合的中心轴和驱动中心轴旋转的动力系统，所述底座上对应每个填蜡槽的位置处均设有一加热电阻，所述动力系统和加热电阻均与所述的控制器连接，所述底座上设有用于匹配并固定模板存储腔室方向的固定槽。

所述单通道pcr仪包括温度组件、三个温控仪和检测组件，所述温度组件包括上下相对设置的上加热组件和下加热组件，且所述上加热组件和下加热组件之间留有容置pcr反应体系芯片的第一间隙，所述上加热组件和下加热组件均包括并排设置的第一加热模块、第三加热模块和第二加热模块，所述第一加热模块、第三加热模块之间留有第三间隙，所述第三加热模块和第二加热模块之间留有第四间隙，所述上加热组件和下加热组件中的两个第一加热模块与一个温控仪连接，所述上加热组件和下加热组件中的两个第二加热模块与第二个温控仪连接，所述上加热组件和下加热组件中的两个第三加热模块与第三个温控仪连接，所述检测组件包括所述第三间隙或第四间隙上设有的荧光检测装置和/或条带扫描装置，所述第一加热模块和第二加热模块上分别贯穿设有一个驱动孔，且两个驱动孔均连接有一个气泵作为驱动件，所述pcr产物检测装置包括荧光检测装置、检测试纸条和液滴读取仪器。

本发明的有益效果是：

1)本发明可采用常规pcr或数字pcr，实现了极好的兼容性。

2)本发明以简易的方式成功实现从样本到数据的全自动化过程，同时可以单通道和多通道自由选择，适用于各种基于分子诊断的应用场景；

3)本发明的样本核酸自动化提取装置和线性pcr检测装置容易实现拼装，也可分别独立运行，并且各种情况均可以做到随到随检，极大提高了分子诊断的检测效率；

4)本发明仅通过简单和容易实现的设计完成功能，极大地降低了仪器耗材的生产加工和检测成本；通过液体/液滴流替代了常规pcr的原位循环升降温过程，极大地缩短了单次检测的时间。

附图说明

图1为本发明所述方案的流程示意图，以及各步骤的实施方案；

图2为本发明优选方案样本处理芯片的结构示意图；

图3为本发明优选方案自动化核酸提取仪的结构示意图；

图4为本发明优选方案单通道线性pcr仪的结构示意图，上部分为正面视图，下部分为侧面视图；

图5为本发明优选方案液体流芯片的结构示意图；

图6为本发明优选方案液滴流芯片的结构示意图；

图7为本发明优选方案多通道线性pcr仪的结构示意图；

图8为本发明优选方案全自动液滴数字pcr检测系统的结构示意图；

图9为本发明优选方案液体流芯片+单通道线性pcr检测系统对cyp2c9基因的检测试纸条结果；

图10为常规方案对cyp2c9基因的检测毛细管电泳结果；

图11为本发明优选方案液体流芯片+单通道线性pcr检测系统对hpv病毒的检测试纸条结果；

图12为常规方案对hpv病毒检测毛细管电泳结果；

图13为本发明优选方案液滴流芯片+单通道线性pcr仪+液滴荧光读取装置对hbv病毒定量检测的结果；

图14为常规定量试剂盒对hbv病毒的荧光定量检测结果；

图15为本发明优选方案液滴流芯片+单通道线性pcr仪+液滴荧光读取装置对低频kras基因突变的检测的结果；

图16为常规荧光定量方法对低频kras基因突变的检测的结果；

图17为本发明优选方案自动化核酸提取仪+多通道线性pcr仪对ctdna中微量egfr基因突变的检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。

可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。

如图1所示，本实施例所描述的本发明的目的就是针对上述现有技术中的不足，提供一种具有2个固定温度的线性pcr模式，通过液体或液滴的循环流动代替通常的原位温度模块的反复升降温过程，实现高效、快速、低价的一种pcr方式，并提供与该套pcr模式相匹配的pcr耗材、上游的核酸提取和下游的产物检测方法(附图1所示)。本发明还提供一套优选的配备螺旋夹板的线性pcr方式和对应的分别针对常规pcr和液滴式数字pcr的两类芯片：液体流芯片和液滴流芯片，以及优选的针对常规pcr的试纸条和针对液滴式数字pcr的液滴荧光阅读的检测方式。本发明所述的系统中各相邻部件设计为拼接搭配，针对不同应用场景根据实际需求实现从半自动到全自动的线性pcr检测模式。

本发明所述快速检测核酸样本的方法或装置均包含样本提取部分、固定温度(可调)液体/液滴循环式pcr扩增部分和pcr产物检测部分。依次进行上述三个步骤即可完成从样本到结果的完整检测过程，其中每个步骤可独立完成并手动依次完成下一操作的完成手动，或通过一定方式顺利衔接各部分实现完全自动化，或通过部分衔接实现手动加自动化等方式均落在本发明权利要求范围内。

具体而言，所述样本提取部分为通过一定方式将样本中的dna或rna释放出来并去除其中的蛋白和糖类等干扰物质从而在聚合酶作用下顺利完成扩增过程。所述样本为临床分子检测相关组织或排出物，如血液、唾液、组织、石蜡切片、唾液、尿液、粪便等。所述方式包含免提取、常规试剂盒手工提取和自动提取仪提取，其中免提取、常规提取试剂盒和商业化自动提取仪等操作不单一作为本发明权利要求的范围，但与后续固定温度(可调)液体/液滴循环式pcr扩增部分和pcr产物检测部分的组合完成pcr的模式包含在本发明范围之内。

优选地，本发明系统中的样本提取装置，用以与后续扩增步骤连接达到全自动化的效果，其单一用途或与后续组合方式均在本发明范围内。所述样本提取装置由样本处理芯片和涡轮式定点融通提取仪(自动核酸提取仪)组成，并按照特定的程序完成自动化提取过程。所述样本处理芯片结构由附图2所示。

具体而言，固定温度(可调)液体/液滴循环式pcr扩增部分即通过液体/液滴在两个温度模块间循环流动从而完成扩增过程的pcr模式。所述固定温度(可调)是指针对某种特定反应需要固定两个模块之间的温度，而可调是指每个模块的温度是容易调节的，从而使扩增仪器适应所有设计条件下的pcr反应。所述液体/液滴分别针对两种不同的pcr检测类型，液体为连续形态，是相对普通pcr类型而言，而液滴为不连续形态，是相对数字pcr类型而言。

优选地，本发明系统中提供pcr扩增装置，通过设计针对普通pcr的液体流芯片和一种针对数字pcr的液滴流芯片以及与两种芯片相对应的线性pcr仪实现功能。所述液体流芯片的结构如示意图5所示，pcr反应体系从左侧样本孔缓慢流入芯片，首先流至上方的启动温度区完成酶的热启动和dna模板的变性，然后流入正式的pcr循环区，循环区由上方的变性温度区、下方的退火温度区和中间的过渡区组成，过渡区防止变性温度区与下方的退火温度区之间温度交换。液体流动的驱动力由样本孔处的气泵通过连续稳定的加压完成，通过调节压力的强弱控制液体的流动速度，从而调节液体在不同温度区的流动时间达到最佳pcr条件。液体最终流到右侧的pcr产物检测区，与试纸条反应区接触完成检测。所述液滴流芯片的结构如示意图6所示，pcr反应体系(水相)由左侧下部样本孔缓慢流入芯片，油相则由左侧上部油相孔缓慢流入芯片，水相和油相交互混合后形成液滴依次流入启动温度区和循环区，完成液滴pcr过程。液滴的生成和流动速度由分别控制样本孔和油相孔的气泵完成，通过调节气流达到最佳pcr条件。液滴最终流到右侧的液滴收集区并完成检测，所述液滴收集区可以是在远处的流道内，也可以是一个封闭的连通空间，二者的区别在于液滴的位置和排布有所差异。所述线性pcr仪的结构如示意图4所示，主要由上下两个不同温度模块构成，两个温度模块的正上部设计有两块与下部完全一样的温度模块，两部分之间有一个缝隙，恰好用于填充所述液体流芯片或液滴流芯片，温度模块的一端上部设计有两个气泵的开口，恰好与液滴流芯片上的样本孔和油相孔对应，温控模块的另一端正上方设计有用于液滴荧光读取或液体荧光读取的装置。特别地，对于利用胶体金试纸条检测的情况，读取装置则应为条带传感器。所述线性pcr仪可以由单组温度模块结构组成单通道，也可由多组温度模块结构组成多通道，如示意图7所示，通道数为2以上的任意整数，优选为8通道或16通道。进一步地，对于多通道的情况，检测装置可以是多个，也可以是一个，优选为1个。多组温度模块均匀排列形成圆盘状，圆盘可带动固定在其上的多组温度模块逆时针转动。

具体而言，本发明中的pcr产物检测装置设计在液滴存储区、扩增产物存储区或试纸条显色区的正上部，用于检测pcr的扩增结果，然后利用特定的检测仪将结果传输至显示器实现功能，该部分与所述线性pcr仪特定部分的工作描述相对应。本发明所述工作流程和各部分的可选择方案由附图1所示意。

按照上述针对各部分的描述，本发明提供了快速检测核酸样本的系统，可以针对不同应用场景和实际检测需求可针对性作选择并容易选配完成特定功能。根据不同样本和检测项目，本发明优选两套解决方案。

针对简单易处理的样本和定性类分子检测项目，优选的方案为免提取+液体流芯片+单通道线性pcr仪+试纸条检测。所述优选方案一的检测程序为：将简单处理好的样本加入液体流芯片的加样孔内与优化的pcrmix混合，将芯片放入单通道线性pcr仪内，启动后两部分温度模块加热至设定温度并保持恒定，液体在气泵作用下缓慢流入通道形成液体流，液体流通过启动温度区完成热启动并将模板完全解链，液体流继续流到循环区完成在变性温度区和退火区的循环流动完成pcr扩增，液体流继续流入试纸条的样本区进行显色，检测区的传感器感应试纸条的变化并将信号传输分析并在显示器上显示结果。

针对定量类分子检测项目，优选方案为自动化样本核酸提取+液滴流芯片+多通道线性pcr仪+液滴荧光读取装置。所述优选方案二的检测程序为：将自动化样本核酸提取仪与多通道线性pcr仪拼装为一体，样本加入到裂解液腔室完成裂解，结合液腔室下游填蜡槽处加热电阻启动并完成融通，提取仪动力系统启动圆盘逆时针旋转一次将结合液注入裂解液腔室完成混合；裂解液腔室下游填蜡槽处加热电阻启动并完成融通，提取仪动力系统启动圆盘逆时针旋转一次将混合液完全通过核酸吸附膜腔室并进入废液腔室，核酸结合到核酸吸附膜上；第一洗涤液腔室下游填蜡槽处加热电阻启动并完成融通，提取仪动力系统启动圆盘逆时针旋转一次将第一洗涤液通过结合液腔室和裂解液腔室并完全通过核酸吸附膜腔室并进入废液腔室，完成第一次洗涤；第二洗涤液腔室下游填蜡槽处加热电阻启动并完成融通，提取仪动力系统启动圆盘逆时针旋转一次将第二洗涤液通过第一洗涤液腔室、结合液腔室和裂解液腔室并完全通过核酸吸附膜腔室并进入废液腔室，完成第二次洗涤；洗脱液腔室外侧填蜡槽处加热电阻启动并完成融通，提取仪动力系统启动圆盘逆时针低速旋转一次将洗脱液注入核酸吸附膜上，然后垂直流道远端填蜡槽处加热电阻启动并完成融通，提取仪动力系统启动圆盘逆时针高速旋转一次将核酸吸附膜上洗脱后的溶液注入模板存储腔室，自动化提取仪继续按照以上所述流程完成下一个样本的提取操作。完成提取的样本处理芯片移动至液滴流芯片的位置，其上的模板存储腔室恰好与落在液滴流芯片样本孔正上方，推动模板存储腔室的活塞将dna模板注入芯片的样本孔内与pcr体系混合。液滴流芯片推入多通道线性pcr仪的一个扩增位置，两个气泵按照特定速度分别推动pcr反应体系(水相)和预装的油相体系缓慢流入芯片，水相和油相交互混合后形成液滴依次流入启动温度区和循环区，完成液滴pcr过程。当多通道线性pcr仪的转盘移动到液滴检测区时，液滴恰好流到后侧的液滴检测区，转盘停止一定时间完成检测并将检测结果传输至计算机与最初的样本编号实现统一对应。此时继续推入下一片液滴流芯片，继续完成下一个样本的检测实现自动化方案。所述各类芯片的转移通过机械传送容易实现，各步骤的控制通过设计特定软件容易实现，所述动力系统可以为电机。

实施例1自动核酸提取仪和样本处理芯片的结构和工作原理

此处提供的自动核酸提取方案为本发明的一种优选方案，其中样本处理芯片的结构示意见图2，自动核酸提取仪的结构示意见图3。样本处理芯片为圆盘状，中心为带齿轮的孔洞201，以锯齿孔洞201为中心，分散着4个腔室，分别为裂解液腔室202、结合液腔室203、第一第一洗涤液腔室204、第二洗涤液腔室205，裂解液腔室202连通结合液腔室203，结合液腔室203连通第一洗涤液腔室204，第一洗涤液腔室204连通第二洗涤液腔室205，构成圆弧形排列。其中裂解液腔室202容积上方开孔，用于添加待检测样本。与裂解液腔室202连通的另一端是核酸吸附膜腔室210。与核酸吸附膜腔室210连通的还有另一条通道，两个腔室分布在两段，靠中心端有一个洗脱液腔室206，远离中心端为模板存储腔室207，位于整个圆盘的外侧。在核酸吸附膜腔室210与模板存储腔室207连通流道中部设计一个垂直流道，连接一个半弧形腔室208，在连通另一个半弧形腔室209，两者在圆盘上相互对称。洗脱液腔室206外侧、垂直流道远端、裂解液腔室202下游、结合液腔室203下游、第一洗涤液腔室204下游和第二洗涤液腔室205下游均设计填蜡槽，结构由211示意。结合液腔室可有可无，洗涤液腔室可根据样本的不同，设置多个或一个。

核酸提取仪为圆盘状，稍大于样本处理芯片，中心设计为带齿轮的凸出轴301，可与样本处理芯片的中心孔洞201完全匹配，核酸提取仪的中心轴301与动力系统匹配完成旋转。核酸提取仪上分布有6个加热电阻302，位置恰好能与样本处理芯片上的填蜡槽211相对应，样本处理芯片的模板存储腔室207对应核酸提取仪的位置设计一个相匹配的用于固定方向的槽303。与核酸吸附膜腔室连通的还有另一条通道，两个腔室分布在两段，靠中心端有一个洗脱液腔室用于放置洗脱液，远离中心端为模板存储腔室，位于整个圆盘的外侧，用于放置纯化完成的核酸模板并容易完成自动化转移过程。在核酸吸附膜腔室与模板存储腔室连通流道中部设计一个垂直流道，连接一个半弧形腔室，再连通另一个半弧形腔室，两个半弧形腔室用于存放废弃的溶液，两者在圆盘上相互对称，保持整个圆盘的平衡并在很大程度上防止废液回流。其中填充加热可融性固体材料例如但不限定于石蜡，石蜡在加热条件下容易融化即打通相应的腔室，固体石蜡是用于防止液体交换并控制各腔室的液体按照特定的程序流通于混合从而顺利完成自动化核酸提取过程。所述涡轮式定点融通提取仪即为核酸提取仪，整体加热与离心的顺序及协调性由控制器中的软件微程序控制完成。自动核酸提取的工作原理为：

a.将待检测的样本加入裂解液腔室202完成裂解；

b.结合液腔室203下游填蜡槽(211)处加热电阻(302)启动并完成融通，核酸提取仪动力系统启动圆盘逆时针旋转一次将结合液注入裂解液腔室202完成混合；

c.裂解液腔室202下游填蜡槽(211)处加热电阻(302)启动并完成融通，提取仪动力系统启动圆盘逆时针旋转一次将混合液完全通过核酸吸附膜腔室210并进入废液腔室208和209(半弧形腔室)，核酸结合到核酸吸附膜腔室210内的核酸吸附膜上；

d.第一洗涤液腔室204下游填蜡槽(211)处加热电阻(302)启动并完成融通，提取仪动力系统启动圆盘逆时针旋转一次将第一洗涤液通过结合液腔室203和裂解液腔室202并完全通过核酸吸附膜腔室210并进入废液腔室208和209，完成第一次洗涤；

e.第二洗涤液腔室205下游填蜡槽(211)处加热电阻(302)启动并完成融通，提取仪动力系统启动圆盘逆时针旋转一次将第二洗涤液通过第一洗涤液腔室204、结合液腔室203和裂解液腔室202，在完全通过核酸吸附膜腔室210并进入废液腔室208和209，完成第二次洗涤；

f.洗脱液腔室206外侧填蜡槽(211)处加热电阻(302)启动并完成融通，提取仪动力系统启动圆盘逆时针低速旋转一次将洗脱液注入核酸吸附膜上；

g.垂直流道远端填蜡槽(211)处加热电阻(302)启动并完成融通，提取仪动力系统启动圆盘逆时针高速旋转一次将核酸吸附膜上洗脱后的溶液注入模板存储腔室207，完成全部提取过程。

实施例2单通道线性pcr仪和液体流芯片的结构和工作原理

此处提供的单通道液体流线性pcr扩增方案，其中单通道线性pcr仪的结构示意见图4，其中上方为平面图，下方为侧面图；液体流芯片的结构示意见图5。单通道线性pcr仪从平面结构看由上下两个不同恒温温度模块第一加热模块403和第二加热模块404构成，其间有一个空隙第二间隙406，防止温度模块间温度传递；从侧面结构看两个温度模块第一加热模块403和第二加热模块404的正上部设计有2块与下部完全一样的温度模块，两部分之间有一个缝隙第一间隙第一间隙407，容置pcr反应体系芯片。温度模块第一加热模块403和第二加热模块404的一端上部分别设计有两个气泵的驱动孔401和402，分别连接两个气泵(408示意)其中驱动孔401用于驱动油相，402用于驱动水相，气泵408对应温度模块的另一端有一个荧光检测装置及条带扫描装置405。油相驱动孔401只是在配合液滴流芯片(图6)进行数字pcr时使用，本优选实施例是为保证平台对常规pcr和数字pcr的兼容性，将全部配件搭载于同一线性pcr仪。液体流芯片左侧有一个加样和驱动孔402驱动的开孔501，芯片上设计多条流道，包括第一预备流道502，包括第一逶迤形启动流道503和第一逶迤形循环流道504，流道后设计第一收集流道505，连接胶体金试纸条506。液体流芯片线性pcr试纸条显色的工作原理为：

a.调节温度模块第一加热模块403和温度模块第二加热模块404分别至特定温度，调节气泵408的气流速度恰当，将待扩增的pcr反应体系加入芯片第一样本孔501，将芯片整体沿缝隙第一间隙407完成插入线性pcr仪，此时第一样本孔501恰好与水相驱动孔402完全吻合，第一逶迤形启动流道503和第一逶迤形循环流道504上半部分流道恰好与两块等温温度模块第一加热模块403完全贴合，第一逶迤形循环流道504下半部分流道恰好与另两块等温温度模块第二加热模块404完全贴合；

b.在气泵408的驱动下，水相在流道内形成液体流沿着第一预备流道502缓慢移动至第一逶迤形启动流道503，完成酶的热启动和dna模板的变性；

c.液体流继续流入第一逶迤形循环流道504，分别经过上方的变性温度区、中间的短过渡区和下方的退火温度区完成一次pcr循环，液体流经若干个流道(通常为20-50个)完成整个pcr过程；

d.扩增完成液体流最终流到右侧的第一收集流道505，与胶体金试纸条506的反应区接触，完成显色过程，条带扫描装置405检测到试纸条506上条带变化，将信号传输到电子显示器上完成整体检测过程。

在一些实施例中，pcr需要三个温度，所以所述单通道pcr仪包括温度组件、三个温控仪和检测组件，所述温度组件包括上下相对设置的上加热组件和下加热组件，且所述上加热组件和下加热组件之间留有容置pcr反应体系芯片的第一间隙，所述上加热组件和下加热组件均包括并排设置的第一加热模块、第三加热模块和第二加热模块，所述第一加热模块、第三加热模块之间留有第三间隙，所述第三加热模块和第二加热模块之间留有第四间隙，第三间隙和第四间隙防止串温，所述上加热组件和下加热组件中的两个第一加热模块与一个温控仪连接，所述上加热组件和下加热组件中的两个第二加热模块与第二个温控仪连接，所述上加热组件和下加热组件中的两个第三加热模块与第三个温控仪连接，所述检测组件包括所述第三间隙或第四间隙上设有的荧光检测装置和/或条带扫描装置，所述第一加热模块和第二加热模块上分别贯穿设有一个驱动孔，且两个驱动孔均连接有一个气泵作为驱动件，所述pcr产物检测装置包括荧光检测装置、检测试纸条和液滴读取仪器。

实施例3单通道线性pcr仪与液滴流芯片的结构和工作原理

此处提供的单通道液滴流线性pcr扩增方案为本发明系统中的一种优选方案，其中单通道线性pcr仪的结构示意见图4，已在实施例2中作详细描述；液滴流芯片的结构示意见图6。液滴流芯片左侧有一个水相加样孔即第二样本孔601和一个油相孔即第三样本孔602，两个流道形成t型交汇后，流道连接第二逶迤形启动流道603和第二逶迤形循环流道604，其后设计检测流道605以及第二收集流道606。液滴流芯片线性pcr液滴读取的工作原理为：

a.调节单通道线性pcr仪(图4)温度模块第一加热模块403和温度模块第二加热模块404分别至特定温度，调节408处两个气泵分别对水相和油相气流速度恰当，将待扩增的pcr反应体系加入芯片的水相加样孔第二样本孔601，将用于液滴生成的矿物油(或硅油等)加入芯片的油相加样孔第三样本孔602，将芯片整体沿单通道线性pcr仪(图4)的缝隙第一间隙407完成插入，此时加样孔第二样本孔601恰好与水相驱动孔402完全吻合，加油孔第三样本孔602恰好与油相驱动孔401完全吻合，第二逶迤形启动流道603和第二逶迤形循环流道604上半部分流道恰好与两块等温温度模块第一加热模块403完全贴合，第二逶迤形循环流道604下半部分流道恰好与另两块等温温度模块第二加热模块404完全贴合；

b.在408处两个气泵的驱动下，水相和油相沿着流道缓慢移动交汇形成液滴流，液滴流继续流动至第二逶迤形启动流道603，完成酶的热启动和dna模板的变性；

c.液滴流继续流入第二逶迤形循环流道604，分别经过上方的变性温度区、中间的短过渡区和下方的退火温度区完成一次pcr循环，液滴流经若干个流道(通常为20-50个)完成全部液滴的pcr过程；

d.扩增完成后液滴流最终流到右侧的检测流道605，到以及第二收集流道606内有液体时(通过对气泵的压力的调节，控制液滴的速度，从而在已知的一定时间后，液滴流到检测流道605)，408处两个气泵停止驱动，液滴读取仪405快速扫描检测流道605内的液滴，将液滴扩增的荧光信号经计算机分析后传输到到电子显示器上完成整体检测过程。

实施例4多通道线性pcr仪的结构和工作原理

此处提供的多通道线性pcr仪为本发明的一种优选方案，其结构示意见图7，按照单通道线性pcr仪(图4所示，其结构和工作原理在实施例2中作详细描述)的液滴驱动部分401和402和温控部分第一加热模块403和第二加热模块404为一个温度单元即温度单元703，多通道线性pcr仪则是由转盘701和多个固定并均匀分布在转盘701上的温度单元703以及液滴读取仪704构成。多通道线性pcr仪进行多样本检测的工作原理为：当温度单元处于702的位置为初始位，当温度单元处于液滴读取仪704的位置为终止位，设置程序指令为每个温度单元恰好位于初始位702时，转盘701停止一定时间，此时按照实施例4所述方式将加完样的液滴流芯片插入pcr反应单元。转盘701停止期间，恰好位于终止位704的芯片完成pcr扩增，经704处的液滴读取仪扫描液滴检测区完成一个检测，并触动推杆将检测完的704处的液滴流芯片推出，该位置恢复为空位继续转动至初始位702进入下一块芯片的扩增和检测程序，以此类推，多通道线性pcr仪循环工作即可完成多通量并且做到随到随检。控制转盘701的转速，使进入初始位的芯片转动至终止位时，恰好完成pcr过程，液滴全部位于液滴流芯片(图6)所示检测流道605，第二收集流道606则可以调控不同温度单元可能存在的少量误差。

实施例5全自动液滴数字pcr检测系统的结构和工作原理

此处提供的全自动液滴数字pcr系统为本发明的一种优选方案，其结构示意见图8，主要由右侧的自动核酸提取仪(图3)和左侧的多通道线性pcr仪(图7)以及将二者实现机械连接的部件构成。其实现全自动的工作原理为：

a.将待检测样本加入样本处理芯片(图2)的裂解液腔室202，分别扫描样本和样本处理芯片使二者对应。然后将样本处理芯片放在中心轴811上，所有样本处理芯片依次操作，依次摞在中心轴811上；

b.将位置801的待测样本处理芯片掉落至位置802处理区完成自动化核酸提取，位置803则对应图3自动核酸提取仪的中心轴301，自动核酸提取仪的结构及样本处理芯片的结构和工作原理在实施例1中作了详细描述。

c.提取完毕后控制将核酸模板区805(对应图2模板存储腔室207)旋转至最左侧，打样孔恰好与下方的液滴流芯片807(图6示意结构)的第二样本孔601相匹配；

d.扫码仪806同时对样本处理芯片802和液滴流芯片807进行扫码，使得二者对应，同时启动推射杆804将核酸模板(推射杆是类似注射器中的活塞杆)805注入芯片807中；

e.处理完的芯片被推动至多通道线性pcr仪(图7示意结构)转盘810(对应图7的转盘701)的初始位702，然后按照实施例4所详述的多通道线性pcr仪工作原理进行检测，直至出具结果；

f.检测完的芯片802被推处丢弃，将新的801位置的样本处理芯片推至位置802处理区按照上述流程完成新一轮检测，从而成功实现全自动化检测，并做到随到随检。

实施例6液体流芯片+单通道线性pcr技术在药物基因组方面的应用(以华法林用药cyp2c9基因检测为例)

以口腔上皮细胞为样本，经一步法快速处理并与pcrmix混合均匀，该步骤基于北京全式金生物生产的animaltissuepcrkit(货号：ad201)进行样本处和扩增，其大致流程为：

1)取试剂盒中的ad180μl与ad220μl混合，用消毒棉签轻轻擦取少量口腔上皮细胞，并插入上述混合液中约10分钟，向体系中加入ad380μl并混合均匀备用，为处理好的裂解物。

2)利用ncbi在线查找并设计cyp2c9基因的引物如下：

上游引物：5′-ctgaattgctacaacaaatgtg-3′,为配合进行试纸条检测，其5′标记生物素。

下游引物：5′-gatactatgaatttgggacttc-3′，为配合进行试纸条检测，其5′标记地高辛。

3)按照以下用量进行pcr扩增体系的制备：

将体系混匀后，分成a和b两个组，每组40μl。

4)其中a组加入液体流芯片，基于本发明所述液体流芯片+单通道线性pcr仪+试纸条的方法进行扩增和检测，该方法的原理和大致流程参照本发明实施例2所详述。b组则放入常规pcr仪，按照普通pcr程序并利用agilent2100bioanalyzer进行产物检测。两种方法均按照以下温度程序完成pcr扩增：

94℃5min

94℃20s

58℃20s(35cycles)

5)a组方法的检测结果由附图9所示，b组方法的检测结果由附图10所示。结果表明，基于本发明的液体流芯片、线性pcr方式和试纸条检测的一体化方法对于cyp2c9基因的检测与常规方法无差异，证明本发明的有效性。

所述试纸条的检测原理(现有的技术)为：扩增完成的体系中包含两端分别标记有生物素和地高辛的目标扩增产物及游离的上下游引物，体系首先在试纸条的结合区与包埋带链霉亲和素标记的胶体金混合，目标扩增产物的生物素端与胶体金的链霉亲和素端特异性结合，体系继续移动至检测线区(t线)，结合胶体金的目标产物另一端地高辛与t线区标记的抗地高辛抗体特异性结合，形成胶体金检测带，残留的带链霉亲和素标记的胶体金继续移动至参照线区(c线)，游离胶体金的链霉亲和素与c线区标记的生物素特异性结合，形成胶体金内参带。

实施例7液体流芯片+单通道线性pcr技术在宫颈癌筛查的应用(以高危16型hpv基因检测为例)

以确诊16型hpv感染的患者宫颈拭子为样本，经一步法快速处理并与pcrmix混合均匀，所述流程、检测方法、对比方案与实施例6所述完成一致，其差异在于使用的引物不同，利用ncbi在线查找并设计16型hpv病毒特异性区域的引物如下：

上游引物：5′-cgtaaccgaaatcggttgaac-3′,为配合进行试纸条检测，其5′标记生物素。

下游引物：5′-cagcctctacataaaaccatc-3′，为配合进行试纸条检测，其5′标记地高辛。

基本本发明所述方法的检测结果由附图11所示，常规检定方法的检测结果由附图12所示。结果表明，基于本发明的液体流芯片、线性pcr方式和试纸条检测的一体化方法对于16型hpv病毒的检测与常规方法无差异，证明本发明的有效性。

实施例8液滴流芯片+单通道线性pcr技术在病原体定量检测的应用(以hbv基因定量检测为例)

以确诊携带hbv病毒的患者血液为样本，分别利用qiagen公司生产的qiaampdspvirusspinkit(货号：61704)进行病毒核酸提取，然后利用本发明的液滴流芯片配合单通道线性pcr仪和液滴荧光读取装置进行hbv病毒拷贝数定量检测。对比的方法为利用湖南圣湘公司生产的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(国械(准)字2013第3401888号)进行hbv病毒拷贝数定量检测，然后将两种方法的结果进行对比。利用qiaampdspvirusspinkit提取试剂盒结合本发明所述方法的大致流程为：

1)取200μl血清样本，依次加入25μlqiagenprotease、200μlbufferal、6μlcarrierrna，涡旋混匀后放置56℃孵育15分钟；

2)加入250μl无水乙醇，涡旋混匀后室温放置5分钟；

3)将混合物加到离心柱上，离心机上6000g离心1分钟，弃下层溶液；

4)向离心柱上加入500μlbufferaw1，离心机上6000g离心1分钟，弃下层溶液；

5)向离心柱上加入500μlbufferaw2，离心机上6000g离心1分钟，弃下层溶液；

6)向离心柱上加入500μl无水乙醇，离心机上6000g离心1分钟，弃下层溶液；

7)继续在20000g空转3分钟，离心柱至于56℃干燥3分钟；

8)向离心柱上加入50μlbufferave，室温放置5分钟，离心机上20000g离心1分钟，收集下层溶液备用，为待检dna模板；

9)利用ncbi在线查找并设计hbv病毒特异性区域的引物/探针如下：

上游引物：5′-atgtgtctgcggcgttttatc-3′

下游引物：5′-acamacgggcaacatacctt-3′

探针：fam-catcctgctgctatgcctcatcttct-hbq1

10)利用thermo公司生产的quantstudio^tm3ddigitalpcrmastermix(货号a26358)进行数字pcr，将步骤8得到的dna模板稀释1000倍，并按照以下用量进行pcr扩增体系的制备：

11)pcr体系混合完成后加入液滴流芯片的水相孔，并向油相孔中加入20μl矿物油，然后基于本发明所述液滴流芯片+单通道线性pcr仪+液滴荧光读取装置的方法进行扩增和检测，该方法的原理和大致流程参照本发明实施例3所详述。并按照以下温度程序完成pcr扩增：

其检测结果由附图13所示。

利用圣湘乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒方法的大致流程为：

1)分别取定量参考品a-d和待检样本各200μl，没管加入100μldna提取溶液2，震荡混匀15秒后室温静置10分钟；

2)瞬时离心后，将离心管置于磁分离器上，3分钟后缓慢将液体吸除；

3)每管加入600μldna提取溶液3和200μldna提取溶液4，震荡混匀5秒，瞬时离心后将离心管置于磁分离器上，3分钟后缓慢将液体吸除干净；

4)没管加入50μlpcrmix(49μlpcr反应液+1μl酶混合液)，将管壁上棕色残留物完全重悬，将液体转移至pcr管备用；

5)将扩增体系转移到abi7500进行荧光定量检测，并按照以下温度程序完成pcr扩增：

其检测结果由附图14所示。

对比两种方式的检测，结果表明：基于本发明方法定量的hbv拷贝数浓度为1.94×10⁵copies/μl，基于圣湘试剂盒方法定量的hbv拷贝数浓度为1.97×10⁵copies/μl，两者基本一致，表明本发明所述液滴流芯片/线性pcr方法的有效性。

实施例9液滴流芯片+单通道线性pcr技术在特异性位点肿瘤筛查中的应用(以粪便样本中微量kras基因突变检测为例)

以粪便为样本，检测其中人源细胞微量kras突变。首先利用qiagen公司生产的qiaampfastdnastoolminikit(货号：51604)对粪便进行核酸提取，大致流程为：

1)取粪便样本约200mg，加入1mlinhibitexbuffer，持续涡旋震荡1分钟，并于16000g离心1分钟；

2)轻轻吸取600μl上清，加入25μl蛋白酶k溶液，加入600μlbufferal，涡旋混匀后置于70℃孵育10分钟；

3)加入600μl无水乙醇，涡旋混匀，分3次过离心柱，在16000g离心1分钟并去除下层溶液；

4)加入500μlbufferaw1，在16000g离心1分钟并去除下层溶液；

5)加入500μlbufferaw2，在16000g离心1分钟并去除下层溶液，继续在16000g空摔3分钟；

6)加入200μlbufferate，在16000g离心1分钟，收集下层洗脱液备用，为dna模板；

7)利用ncbi在线查找并设计人类kras基因g12c位点突变的引物/探针如下：

上游引物：5′-aaatgactgaatataaacttgtggt-3′

下游引物：5′-ctctattgttggatcatattcgtc-3′

探针：fam-agttggagcttgtggcgtaggcaag-hbq1

8)利用ncbi在线查找并设计gapdh基因特异区段作为内参，其引物/探针如下：

上游引物：5′-gctgcttttaactctggtaaagtg-3′

下游引物：5′-tagcactcaccatgtagttgag-3′

探针：vic-tgatgcatctatgaacgcttc-hbq1

9)利用thermo公司生产的quantstudio^tm3ddigitalpcrmastermix(货号a26358)进行数字pcr，并按照以下用量进行pcr扩增体系的制备：

将体系混匀后，分成a和b两个组，每组20μl。

10)其中a组取20μlpcr体系加入液滴流芯片的水相孔，并向油相孔中加入20μl矿物油，然后基于本发明所述液滴流芯片+单通道线性pcr仪+液滴荧光读取装置的方法进行扩增和检测，该方法的原理和大致流程参照本发明实施例3所详述。b组则放入abi7500进行荧光定量检测。两种方法均按照以下温度程序完成pcr扩增：

a组方法的检测结果由附图15所示，b组方法的检测结果由附图16所示。结果表明，基于本发明的液体流芯片、线性pcr方式和试纸条检测的一体化方法对于kras基因g12c突变位点检测到1.25copies/μl的低频突变，而常规荧光定量pcr未检测到kras突变，证明本发明的方法灵敏度更高。

实施例10多通道自动化核酸提取仪+多通道线性pcr技术在circulatingtumordna靶向用药指导中的应用(以血液中egfr基因稀有突变检测为例)

选取10例肺癌手术患者的血液样本，检测其egfr基因t790m位点的突变情况，为靶向用药阿法替尼做用药指导。

按照实施例1所描述的核酸提取方法进行自动化核酸提取，样本1至样本10各取1ml，随机在1-20分钟内加入相应的样本处理芯片并随机放入自动化核酸提取仪上，至工作结束后获得10份dna模板，在abi公司生产的qubit3.0上对各组模板进行浓度测定，结果如下表所示。

提取所得dna样本浓度测定值

利用ncbi在线查找并设计人类egfr基因t790m位点突变的引物/探针如下：

上游引物：5′-atgcgaagccacactgacg-3′

下游引物：5′-ccaggaggcagccgaag-3′

探针：fam-gcagctcatcatgcagctcatgcccttcg-hbq1

内参基因依旧使用gapdh基因，其引物/探针参考本发明实施例9所述。利用thermo公司生产的quantstudio^tm3ddigitalpcrmastermix(货号a26358)进行数字pcr，并按照以下用量进行pcr扩增体系的制备：

继续按照实施例4所述多通道线性pcr仪的详细工作方法进行10份样本的检测，分别将扩增反应体系加入相应的液滴流芯片中，随机放入多通道线性pcr仪，直至检测结果全部完成。与初始基于高通量测序的结果作对比如下表所示。

t790m突变情况结果判定及与初始结果对比

多通道线性pcr仪的对10个样本的检测结果由图17所示意，其统计分析的结果如上表所示。本实施例基于本发明的自动化核酸提取仪和多通道线性pcr仪成功完成对10例样本的自动化检测，具有很强的便捷性和可靠性。其检测的结果与高通量测序的结果完全一致，进一步说明本发明所述方法的科学性，基于本发明的若干优选方案均能体系其优势。

本发明所公开的实施例的上述说明，使本领域技术人员能够实现或使用本发明，同时，以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明实施例的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明实施例的保护范围之内。本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。