一种阪崎克罗诺杆菌CRISPR分型方法与流程

本发明属于分子流行病学领域，具体涉及一种阪崎克罗诺杆菌crispr分型方法。

背景技术：

阪崎克罗诺杆菌(cronobactersakazakii)是重要的食源性致病菌，可以感染各年龄阶段的人群，感染婴幼儿尤其是早产儿，低体重儿或免疫受损婴儿可导致脑膜炎，坏死性小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达40％到80％，已经引起了全球的高度重视。国际食品微生物标准委员会(icmsf)将克罗诺杆菌属定义为“一种对特定人群产生严重的生命危害，或产生严重慢性后遗症的危险的微生物”。国际粮农组织和世界卫生组织把克罗诺杆菌属列为婴儿配方奶粉中的a类致病菌。阪崎克罗诺杆菌是克罗诺杆菌属最重要的一个种，其在食品，环境和临床样品中的检出率均是最高的。目前认为婴幼儿配方奶粉污染克罗诺杆菌是新生儿感染该菌的主要渠道，然而一些母乳喂养的婴幼儿，其宿主和传播模型尚不清楚。

近年来，随着技术的进步，除了脉冲场凝胶电泳(pfge)技术分辨率高，重复性好，被誉为病原微生物分子分型的“金标准”之外，其他以电泳为基础的限制性片段多态性(rflp)，扩增片段长度多态性(aflp)，随机扩增多态性dna(rapd-pcr)和肠杆菌基因间重复共有序列扩增(eric-pcr)等已经少用于病原菌的分子溯源了。大量基于基因测序的分型手段应用于病原菌的分子溯源如应用广泛的多序列分型方法(multi-locussequencetyping，mlst)以及核心基因组多序列分型方法(coregenomemulti-locussequencetyping，cgmlst)等，cgmlst分型效果是最佳的，但是基因组测序成本高，操作人员需要有较好的生物信息学分析基础。

通过基因水平转移和基因丢失而获得外部dna是驱动细菌基因组进化的主要驱动力，温和噬菌体通过整合入和活化释放出细菌染色体而积极参与这种进化。外源dna的获得对于宿主细胞来说有利也有弊，新的dna可以增加生物体在特定环境下的适应能力，然而复制和维持该整合核苷酸序列对于宿主细胞来说也是一种负担。细菌和噬菌体之间的长期生存斗争催化了多种细菌防御系统和噬菌体拮抗系统的产生。crispr-cas系统是近期发现的一种新的原核生物防御外来基因组包括噬菌体入侵的有效免疫机制。crispr-cas系统由crispr分子和cas基因组成。由于crispr-cas系统中的crispr分子保存了细菌遭受噬菌体等基因水平转移形式的外源dna分子入侵的信息，且间隔序列的排列顺序包含时间信息，对于追溯细菌遗传进化规律具有其他分型方法无法企及的优势，因此已经被用于一些病原菌的基因分型和分子溯源研究中，如结核分枝杆菌菌株的分型，沙门氏菌，鼠疫耶尔森菌和空肠弯曲杆菌等。

目前国外有文献报道(1.ogrodzkietal.futuremicrobiol11,1507-1519；2.zengetal.scientificreports7,40206；3.ogrodzkietal.frontiersinmicrobiology8,1875；4.zengetal.appliedandenvironmentalmicrobiology84:e00267-18)阪崎克罗诺杆菌存在两种crispr-cas系统(i-e型和i-f型)及大量crispr分子，并进一步根据crispr分子的整合位置将其分为6种不同类型的crispr分子(crispr1～crispr6)。其中crispr1，crispr2，crispr3和crispr6分子具有富含at碱基的前导序列，且不同菌株的同类型分子间隔序列数目变化大，且周边有cas基因，为有活性的crispr分子，说明阪崎克罗诺杆菌这四个crispr分子具有很强的遗传多样性，且与多序列分型方法(multi-locussequencetyping，mlst)型有一定的相关性。其中crispr1和crispr2在阪崎克罗诺杆菌中广泛存在，crispr3比例也比较高，而crispr6只在特定的菌株中出现，多数情况下为缺失状态。但目前并没有适合于阪崎克罗诺杆菌的crispr分型方法。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种阪崎克罗诺杆菌的crispr分型方法。

本发明的目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的阪崎克罗诺杆菌crispr分型方法，包括以下步骤：

a.提取待检测菌株培养物的dna；

b.分别取适量步骤a的dna，进行crispr1、crispr2、crispr3和crispr6位点的pcr扩增，其中crispr1位点的扩增引物为e-1f和e-1r，crispr2位点的扩增引物为e-2f和e-2r，crispr3位点的扩增引物为e-3f和e-3r或e-3f和e-3r6r，crispr6位点的扩增引物为e-6f和e-3r6r；

所述的引物e-1f，其序列如sedidno.1所示，

所述的引物e-1r，其序列如sedidno.2所示，

所述的引物e-2f，其序列如sedidno.3所示，

所述的引物e-2r，其序列如sedidno.4所示，

所述的引物e-3f，其序列如sedidno.5所示，

所述的引物e-3r，其序列如sedidno.6所示，

所述的引物e-6f，其序列如sedidno.7所示，

所述的引物e-3r6r，其序列如sedidno.8所示；

c.分别对步骤b所述的crispr1、crispr2、crispr3和crispr6位点的pcr扩增产物进行dna测序；

d.提取crispr1、crispr2、crispr3和crispr6位点序列中的间隔序列，根据四者的间隔序列组合确定阪崎克罗诺杆菌的crispr型别。

优选，所述的步骤b的pcr扩增体系为：采用50μl的pcr扩增体系，其中含有hsdnapolymerase0.5μl，5×primestarbuffer10μl，dntp4μl，10μmol/l的上游引物和下游引物各0.5μl，待检细菌dna模版1μl～2μl，补齐ddh2o至50μl；扩增条件为：98℃预变性1min，然后98℃10s，57～58℃5s，72℃4min，共30次循环；72℃延伸5min。

优选，所述的步骤b中，若利用引物e-3f和e-3r经pcr扩增反应后检测无条带，则利用引物e-3f和e-3r6r进行pcr扩增。

优选，所述的步骤c的dna测序引物为步骤b的pcr扩增引物。

发明人在crispr1、crispr2、crispr3和crispr6这四类crispr分子中均发现靶向噬菌体和质粒等外源物质的间隔序列，说明这些序列中含有菌株的重要侵染信息，可以应用于该菌感染来源的追踪和传播模型的构建，并可联合数据库实现全国甚至全球标准化分子溯源，可以推广至食品、检验检疫等领域。本发明方法省时，经济，分辨率高，易于操作，对实验室设备及软件要求低，且含有重要的时间顺序信息，利于菌株分子溯源。

对于奶粉中阪崎克罗诺杆菌的污染溯源及婴幼儿感染该菌的监测是疾病预防控制机构的重要任务之一，但目前的疾病控制机构存在高端分型设备不足及技术人员水平参差不齐等诸多问题。本发明的分型方法由于原理简单，操作容易，成本低廉，反应快速，高效，准确，无环境污染，且对实验室的设备要求不高，因此能在更广泛的应用于食品、检验检疫等领域，同时可以进行疾病的监测和预警。

本发明的crispr分型方法具有以下优势：

1.操作简单方便，对设备要求低；

2.平均分型成本低，相对于mlst，花费为其三分之一(菌株含有两个crispr分子)到二分之一(菌株含有三到四个crispr分子)；

3.与mlst分型方法相比具有更好的分辨率；

4.由于crispr间隔序列具有特殊的时间顺序，使得该分型方法具有细菌遗传分化及地域等多重信息的优势，更适合用于疾病爆发或食品安全事件的分子流行病学溯源。

本发明的分型方法可在未能配备复杂昂贵分型设备的实验室及基层疾控单位实施，具有较好的推广及应用价值。

附图说明

图1是阪崎克罗诺杆菌的crispr分型示意图。

图2是阪崎克罗诺杆菌crispr的pcr扩增电泳图谱。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：136株阪崎克罗诺杆菌的crispr分型方法，及其与mlst分型方法的分辨率比较

(1)菌株

用于本次实验的菌株选自我中心保存的分离自我国多个地区的136株阪崎克罗诺杆菌，已完成传统生化鉴定和分子检测，确定为阪崎克罗诺杆菌。

(2)细菌dna提取

采用magen公司的细菌基因组dna提取试剂盒分别提取上述待测136株菌株的基因组dna，以阪崎克罗诺杆菌atcc29544为阳性对照，ddh2o为阴性对照。提取的dna于-20℃保存。

(3)引物合成

表1crispr分子扩增的引物表

pcr扩增中所用的引物浓度均为10μmol/l。

(4)pcr扩增

4.1crispr1扩增pcr反应体系：

crispr1扩增pcr反应条件为：98℃预变性1min，然后98℃10s，58℃5s，72℃4min，共30次循环后，72℃最后延伸5min。

4.2crispr2扩增pcr反应体系：

crispr2扩增pcr反应条件为：98℃预变性1min，然后98℃10s，57℃5s，72℃4min，共30次循环后，72℃最后延伸5min。

4.3crispr3扩增pcr反应体系：

crispr3扩增pcr反应条件为：98℃预变性1min，然后98℃10s，57℃5s，72℃4min，共30次循环后，72℃最后延伸5min。

4.4若e-3f和e-3r扩增出条带，则加扩crispr6；若无条带，则不需要扩增crispr6。

crispr6扩增pcr反应体系：

crispr6扩增pcr反应条件为：98℃预变性1min，然后98℃10s，57℃5s，72℃4min，共30次循环后，72℃最后延伸5min。

反应结束后，取5μlpcr反应产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统上观察结果。图2为扩增出的阪崎克罗诺杆菌crispr位点电泳图，marker为dl5000，由图可见，不同菌株中的crispr位点序列长短不一。分型结果各不相同，详见表2。

(5)pcr扩增产物测序

利用扩增的引物进行crispr分子测序，测序任务由华大基因完成。

(6)crispr分型

阪崎克罗诺杆菌的crispr分型示意图如图1所示。

利用crisprfinder提取crispr1、crispr2、crispr3和crispr6位点序列中的间隔序列(spacer)，通过重复序列(repeat)判断crispr分子的正反方向，富含at碱基的启动序列为新插入序列，从离该前导序列最远处的spacer开始计算顺序号。分别将不同crispr分子中提取的spacer去冗余后存为单独的序列库，每个spacer给与一个特定编号。每株菌的crispr分子的spacer通过blast找到序列库中的相应spacer，这些分子的排列组合给与一个特定序列组合编号，最后根据四种crispr分子的序列组合编号的结果确定阪崎克罗诺杆菌的crispr型别，其中缺失的crispr分子记为编号零。

(7)mlst分型

主要选取了阪崎克罗诺杆菌七个管家基因进行扩增测序，将所得序列信息上传至专门的网站(https://pubmlst.org/cronobacter/)获取相应的mlst型别，具体实验操作方法见mlst网站。

(8)两种分型方法的分辨率的比较

表2136株阪崎克罗诺杆菌的mlst分型和crispr分型结果

分辨率评价用simpson多样性指数(d)量化表示，其计算公式为：d＝1-∑[nj(nj-1)]/[n(n-1)]，其中nj表示第j带型的菌株数量，n表示实验菌株总数。d值越大说明分辨率越强。

两种分型方法的分辨率分别为：

多位点序列分型mlst：d＝0.9790

crispr分型方法：d＝0.9964

由此可见crispr分型方法的分辨率高于mlst分型方法。

(9)两种方法分型耗费比较

crispr分型耗费：68rmb～136rmb

mlst分型耗费：238rmb

实施例2：crispr分型和mlst分型方法分子溯源能力的比较

(1)下载1994年法国新生儿重症监护病房爆发阪崎克罗诺杆菌感染后从病人和喂养配方奶中分离出的23株菌株(包括st4、st12和st13三种st型)的全长基因组序列(masoodetal.bmcgenomics16:750)，按照实施例1中的方法确定crispr分子类型和数量，并提取间隔序列进行分型。

(2)挑选出实施例1中st4、st12和st13三种st型菌株进行crispr分型和mlst分型方法的比较，结果如下表3所示。

表338株阪崎克罗诺杆菌crispr和mlst分型结果比较

如表3所示，法国新生儿重症监护病房爆发阪崎克罗诺杆菌感染案例中从病人体内分离出的三种st型菌株，分别有st4(13株)，st12(5株)和st13(5株)。实施例1中无st12型菌株检出，有11株st4和4株st13食品分离株。比较st4菌株的分型结果，可以看到除一株st4法国临床株(767)为cr8型外，其余所有st4型法国临床菌株均为cr2型，而767的全基因组snp分析显示该菌株与其他st4型临床株相比，有较多的差异snp位点(masoodetal.bmcgenomics16:750)，上述结果说明crispr分型方法优于mlst分型效果。crispr分型方法可以将11株中国食品分离出的st4型菌株分为cr1、cr2、cr3、cr4、cr5、cr6、cr7、cr9、cr10和cr11在内的10种cr型。st12和st13型法国临床株分别为cr50和cr52型，而中国食品分离出的4株st13菌株则为cr53、cr65和cr66三种型别。mlst分型方法不能区分法国婴幼儿阪崎克罗诺杆菌感染暴发时的菌株和中国食品分离株，而crispr分型方法则可以将这些菌株很好的区分开来，具有更强的分子溯源能力，对于疾病爆发或污染溯源时的分子流行病学追踪具有重要的意义。

综上所述，本发明的crispr分型方法具有以下优势：

1.操作简单方便，对设备要求低；

2.平均分型成本低；

3.与mlst分型方法相比具有更好的分辨率；

4.由于crispr间隔序列具有特殊的时间顺序，使得该分型方法具有细菌遗传分化及地域等多重信息的优势，更适合用于疾病爆发或食品安全事件的分子流行病学溯源。

基于上述的优势，该分型方法可在未能配备复杂昂贵分型设备的实验室及基层疾控单位实施，具有较好的推广及应用价值。

序列表

<110>广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120>一种阪崎克罗诺杆菌crispr分型方法

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cctgacctggtaaacagagtagcg24

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cgatttccagacgtwcggcgttaa24

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cagttragatggtgtacycgcata24

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aragggcagccgrtctttaacaag24

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gttgagcttaaaccctccccttgc24

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gtcagcggyaccttcagcagtt22

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gtcaacttttatarggccttcgc23

<210>8

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

caggcattccggtaatattcgctc24