专利名称：幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法
技术领域：
本发明属于蛋白质组学领域，尤其是一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法。
背景技术：
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori, Hp)在1983年由澳大利亚医生发现,呈螺旋状，为革兰氏阴性菌，定殖于人胃部。幽门螺旋杆菌感染是引起人类消化道疾病的重要原因，能够导致慢性胃炎、严重萎縮性胃炎、消化道溃疡和胃癌等相关疾病。幽门螺旋杆菌存在多种毒カ因子，包括鞭毛蛋白(f lagellin)、空泡毒素(vacuolating cytotoxin, VacA)、细胞毒素相天蛋白(cytotoxin associated gene A,CagA)和尿素酶(urease)等。鞭毛蛋白是幽门螺旋杆菌鞭毛的主要组成蛋白，是细菌运动的动力，鞭毛蛋白本身可以抵御酸性环境，对鞭毛具有保护作用，运动能力较强的菌株其致病性较高。空泡毒素VacA能够分泌到细菌外部，对胃上皮细胞造成损伤，产生空泡性病变，另外能够改变细胞膜的离子通透性，导致细胞整体病变。所有幽门螺旋杆菌存在VacA编码基因，但是只有约50%的菌株表达VacA蛋白。细胞毒素相关蛋白(CagA)分子量为128kD，存在于60-70%的幽门螺旋杆菌菌株中，具有CagA为I型菌株，具有较强致病性，CagA阴性为II型菌株，致病性较弱，在胃炎患者中中，CagA抗体阳性率为70-75%，在十二指肠溃疡患者中，CagA抗体阳性率几乎为100%。尿素酶产生高浓度氨，导致细胞空泡病变。西方国家30-50%的人群感染过幽门螺旋杆菌，我国幽门螺旋杆菌感染率高达70-90%,随着年龄增长，感染率有增加的趋势。感染人群中的10%的患者会出现临床症状，包括胃炎、胃十二指肠溃疡等，若不接受抗菌素治疗，感染可持续终生，其中部分患者可能导致胃癌。目前检测幽门螺旋杆菌感染的方法较多，包括检测患者血清中的幽门螺旋杆菌抗体、粪便中幽门螺旋杆菌的抗原、尿素呼气试验、定量PCR方法、细菌培养方法和病理学检测方法等。其中，检测患者血清中的幽门螺旋杆菌抗体，包括酶联免疫吸附试验、免疫印记和胶体金等方法，具有特异性高，能够定量分析的特点，但是试验中涉及的幽门螺杆菌抗原，为部分纯化的幽门螺旋杆菌全抗原，其特异性和稳定性等方面不能完全满足检测要求。
发明内容
本发明在于在于克服现有技术的不足之处，提供一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，本蛋白组可以用于基因工程疫苗和临床诊断试剂盒的候选抗原。本发明实现目的的技术方案如下一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，步骤如下(I)分别扩增6种毒カ蛋白基因，针对6种毒カ蛋白设计引物，引物序列见序列I至序列12，引物分别插入限制性内切酶位点；(2)分别克隆6种毒カ蛋白编码基因；
(3)分别亚克隆6种毒カ蛋白编码基因到表达载体上；(4)大肠杆菌宿主细胞内分别表达6种毒カ蛋白；(5)纯化；所述6种韋カ蛋白为细胞韋素相关蛋白CagA、空泡韋素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B。而且，所述步骤(2)的6种毒カ蛋白编码基因分别克隆到TOPO TA Cloning Kits 试剂盒或T-EASAY试剂盒的质粒载体上。而且，所述步骤(3)的6种毒カ蛋白编码基因分别亚克隆到表达载体pQE30上。而且，所述步骤(5)利用Ni-NTA纯化填料制备的层析柱，分离纯化这6种重组毒力蛋白。本发明的有益效果和优点是本发明涉及的6种毒カ蛋白包括细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B，其编码基因或氨基酸序列具有高度保守性和特异性，并且与患者的症状相关，因此制备的毒力蛋白可以用于基因工程疫苗和临床诊断试剂盒的候选抗原，以及临床用药指导以及流行病学调查等多个领域。
图I为本发明幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因的PCR扩增产物分析，其中，IcagA，2vacA，3ureA，4ureB，5flaA，6fIaB ；图2为本发明重组质粒的限制性内切酶图谱。使用的限制性内切酶分别为BamHI和Sail，图谱中1.3kb和2. 5kb的条带来自基因表达的辅助质粒pREP4，vector为克隆基因的载体，大小为3. 4kb，三角形代表克隆的基因片段，大小与预期相同，其中ureB基因的部分片段与载体片段连接在一起，大小与预期也相同；图3重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白表达与纯化结果分析，其中ICagA，2VacA，3FlaA，4FlaB，5UreA,6UreB,。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进ー步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明采用生物信息学方法，利用幽门螺旋杆菌基因组序列信息，经过比对分析，确定6种幽门螺旋杆菌重要毒力蛋白，包括细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B。这6种蛋白氨基酸序列或编码基因核苷酸序列具有高度保守性，并且具有特异性，即与其它病原微生物蛋白或基因同源性很低；另ー方面这些毒力蛋白的存在与患者的症状相关。综上所述，本发明制备的毒力蛋白可以用于基因工程疫苗和临床诊断试剂盒的候选抗原。利用生物信息方法，设计特定引物，引物插入适当限制性内切酶位点，保证扩增DNA片段能够准确连接到表达载体上。引物合成后，以幽门螺旋杆菌染色体DNA为模板，利用PCR方法分别扩增该6种毒カ蛋白编码基因，经琼脂糖凝胶电泳分析，确定扩增产物是否存在。
利用TA克隆的方法，将毒カ蛋白编码基因的扩增产物分别克隆到TOPOTA Cloning Kits试剂盒质粒载体上，转化大肠杆菌，在含有X-GAL和IPTG的LB平板上涂板，挑选白色菌落进行液体培养提取质粒DNA，质粒DNA经过限制性内切酶酶切后，利用琼脂糖凝胶电泳分析。含有毒力蛋白编码基因的质粒，经过限制性内切酶酶切，制备含有毒力蛋白编码基因的DNA片段，进ー步亚克隆到经过同样限制性内切酶酶切的表达载体pQE30上，转化子经过分析确定正确后，用于蛋白表达的实验。正确转化子中的重组质粒携帯幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因，在IPTG的诱导下，毒力蛋白编码基因在大肠杆菌宿主细胞内表达，这6种重组毒力蛋白的N端分别携带6个His标记，便于纯化。通过优化诱导表达条件，大量表达重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE方法，鉴定重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白是否表达、是否可溶、是否形成包涵体以及表达量的多少。表达的6种重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白，采用Ni-NTA纯化填料制备的层析柱，进 行分离纯化。6种重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白N端均具有6XHis的标签，通过与Ni-NTA填料结合，经过洗涤和洗脱等步骤，制备单ー的重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白纯品。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE方法，鉴定重组幽门螺旋杆菌毒力蛋白纯化的程度以及制备的数
且雄里寺。具体制备方法如下一、幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因的扩增与克隆(I)利用BHI培养基液体培养幽门螺旋杆菌，IOOOOg离心5min收集细菌细胞；(2)利用TE缓冲液重悬细胞，加入0. 1% SDS破壁，然后加入10 y g/mL蛋白酶K，37°C过夜消化，用苯酚氯仿抽提若干次至无白色膜状物存在，氯仿抽提一次，加入2. 5倍体积95%こ醇沉淀染色体DNA，IOOOOg离心IOmin弃上清，用70%こ醇洗涤一次，沉淀干燥后加入TE缓冲液重悬成为染色体DNA溶液；(3)扩增幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因。扩增体系包括I U L提取的幽门螺旋杆菌染色体DNA为模板(0. I ii g)、4 ii L设计的扩增引物(20pmol/L)、10iiL 缓冲液(IOX) ,8u L dNTPs (2. 5mmol/L) U U L Taq DNA 聚合酶(2. 5u)和76 ii L ddH20。在PCR仪上进行扩增，扩增參数为I个循环95°C预变性5min35个循环95°C 变性 Imin56 で复性 Imin72 で延伸 2minI 个循环72°C保温 IOmin。6种幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因大小不同，设计的引物保证特异性的同时，弓丨物加入了不同的限制性内切酶位点，保证扩增的基因能够亚克隆到表达载体质粒上，并且毒力蛋白编码基因与载体质粒上的组氨酸编码序列连接中不产生移码突变。6种毒カ蛋白编码基因PCR扩增所用引物序列如表I所示。表I、扩增幽门螺旋杆菌毒力蛋白编码基因的引物
权利要求
1.一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，其特征在于步骤如下 (1)分别扩增6种毒カ蛋白基因，针对6种毒カ蛋白设计引物，引物序列见序列I至序列12，引物分别插入限制性内切酶位点； (2)分别克隆6种毒カ蛋白编码基因； (3)分别亚克隆6种毒カ蛋白编码基因到表达载体上； (4)大肠杆菌宿主细胞内分别表达6种毒カ蛋白； (5)纯化； 所述6种毒カ蛋白为细胞毒素相关蛋白CagA、空泡毒素蛋白VacA、鞭毛蛋白亚基A、鞭毛蛋白亚基B、尿素酶亚基A和尿素酶亚基B。
2.根据权利要求I所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，其特征在于所述步骤⑵的6种毒カ蛋白编码基因分别克隆到TOPO TA Cloning Kits试剂盒或T-EASAY试剂盒的质粒载体上。
3.根据权利要求I所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，其特征在于所述步骤(3)的6种毒カ蛋白编码基因分别亚克隆到表达载体pQE30上。
4.根据权利要求I所述的幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，其特征在于所述步骤(5)利用Ni-NTA纯化填料制备的层析柱，分离纯化这6种重组毒力蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种幽门螺旋杆菌毒力蛋白质组的制备方法，步骤如下(1)分别扩增6种毒力蛋白基因，针对6种毒力蛋白设计引物，引物序列见序列1至序列12，引物分别插入限制性内切酶位点，这6种重组毒力蛋白的N端分别携带6个His标记；(2)分别克隆6种毒力蛋白编码基因；(3)分别亚克隆6种毒力蛋白编码基因到表达载体上；(4)大肠杆菌宿主细胞内分别表达6种毒力蛋白；(5)纯化。本6种蛋白编码基因或氨基酸序列具有高度保守性和特异性，并且与患者的症状相关，因此制备的毒力蛋白可以用于基因工程疫苗和临床诊断试剂盒的候选抗原。
文档编号C12N9/80GK102643850SQ201210113718
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者杨洪江, 金守光 申请人:天津天佛罗生物技术有限公司