专利名称：一株可降解多环芳烃的海旋菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及--株可降解多环芳烃的海旋菌及其应用。
技术背景 多环芳烃(PolycyclicAromatic Hydrocarbons, PAHs)是指两个或两个以上苯 环以链状、角状或串状排列组成的化合物，主要来自于木材、化石燃料、煤焦油产品或食物 等有机质的不完全燃烧，多环芳烃在环境中分布广泛，在大气、水体、土壤、沉积物和食品中 都有检出。多环芳烃大多数为有毒物质，许多有三致效应，即致癌、致畸变和致突变，迄今 为止已发现的多环芳烃类致癌物及其衍生物已经超过400种,不乏苯并(a)芘这样的强致 癌物质。多环芳烃具有的半挥发性、亲脂性、高生物蓄积性和难降解等特性，使其能够在环 境中长时间存在、长距离迁移并富集于生物体，给人类健康和生态系统安全造成长期而严 重的危害。因此，1998年,美国、加拿大和欧洲共32个国家订立的《关于长距离越境空气 污染物公约》中将多环芳烃明确定为必须控制的持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants,POPs)。菲是一种三环芳烃,对不少水生生物有毒性效应,并且因为同时具有典 型的“K区，，和“湾区”结构而成为研究致癌性多环芳烃代谢机制的模式物质。环境中的多环芳烃除少部分可以发生光化学分解外，大部分主要依赖生物降解途 径慢慢消失,因此微生物降解是控制多环芳烃污染较为经济有效的方法。然而,多环芳烃污 染常常伴随着盐浓度较高的环境,例如多环芳烃随着石油的突发事故、落地油及含油污水 排放等对沿海湿地中的盐碱滩环境造成严重污染，含油和含盐量都比较高(盐度> 3.5% w/v)的油田采出水排放会使接纳环境中的盐度和多环芳烃含量同时升高，酿成污染。普通 降解菌虽然能有效降解多环芳烃却难以在较高的盐浓度下生长,而嗜盐降解菌的研发能够 解决这一矛盾，因此对控制多环芳烃污染有重要意义。目前已发现的多环芳烃降解菌中嗜盐微生物较少。Ashok等从炼油J ‘附近 的土壤中筛选到了四株能利用萘、蒽以及萘与菲共代谢的微生物，分别属于微球菌属 (Mi crococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)禾口产碱菌属(Alcaligenes),在丰富培养 基上最高能耐受7.5%NaCl。Sohn等从韩国某海湾淤泥中分离到一株新鞘氨醇杆菌 (Novosphingobium pentaromativorans)，该菌能够降解2 5个苯环的多环芳烃，其在 丰富培养基中可生长的盐度范围为 6%。Plotikova等从盐土环境中分离到了 15 株萘降解菌，分别属于红球菌属CRhodococcus)、节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属 (Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas),它们能够耐受5. 8% NaCl,其中6株还能利用 菲；通过其中部分菌株质粒的转座结合，获得了两株有新质粒的恶臭假单胞菌，其耐盐性有 所提高,并能降解萘、菲和水杨酸。以上文献报道都把多环芳烃降解与微生物的耐盐性联系 起来,提供了一些非常有价值的实验方案和研究思路。然而,这些耐盐微生物适宜生长的盐 度和生长的盐度范围都比较低(以PAHs为唯一碳源和能源时的盐度< 7. 5% ),不能适用 于高盐环境中多环芳烃污染的生物治理。因此，为解决高盐环境中多环芳烃的污染，亟待研 发能降解多环芳烃且生长的盐度范围宽、耐盐度高的嗜盐菌。
发明内容
本发明的目的是提供一株可降解多环芳烃的海旋菌。本发明所提供的海旋菌是从山东省东营市仙河镇胜利油田的土壤中筛选得到的。 根据其形态特征、培养特性、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析等证实属于海旋菌属 (Thalassospira)，将其命名为仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4。仙河海旋菌 (Thalassospira xianhensis) P-4已于2009年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为北京市朝阳区大屯路,中国科学院微生物研究 所)，保藏登记号为CGMCC No 2942。仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis)P-4CGMCC Ne 2942 为革兰氏阴性菌，细 胞呈弯杆状或螺旋状、无鞭毛，没有运动性，大小为(1. 03 - 1.65) μ mX (0. 33 0. 56) μ m。 该菌株的菌落呈圆形、光滑、隆起、奶油色或微黄色、有光泽、边缘整齐特征。仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis) P-4CGMCC Na 2942 属于好氧菌，可生长 PH范围为4. O 10. 0，最适生长pH值为7. 2 ；可生长温度范围为10 42。C，最适生长温度 为30°C;该菌株属于嗜盐微生物，能在0. 1 17%的盐度范围内进行生长繁殖，最适宜生长 的盐度范围为3 6%。仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis)P-4CGMCC Ne 2942 无法利用 D-阿拉伯 糖和α -乳糖产酸，可利用蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-木糖、D-半乳 糖和D 葡萄糖产酸；该菌株能水解吐温80和明胶，但不能水解可溶性淀粉；该菌株的氧化 酶、过氧化氢酶和尿素酶为阳性，DKA酶为阴性；该菌株能使硝酸盐还原为氮气，能利用戊 五醇、核糖醇、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯醇、D-纤维二糖、D-果糖、龙胆二糖、α -D-葡萄糖、 D-甘露糖、D-山梨醇、松二糖、D-半乳糖酸内脂、葡萄糖酸、D-葡萄糖胺酸、α-酮戊二酸、 D, L-乳酸、奎宁酸/金鸡纳酸、D 葡萄糖二酸、D 丙氨酸、L 丙氨酸、L 丙氨酰甘氨酸、 L-谷氨酸、甘氨酰天门冬氨酸、甘氨酰H,谷氨酸、L-脯氨酸和L 焦谷氨酸作为唯一 碳源和能源。仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis) P-4CGMCC Ne 2942 对抗生素中的氨节青 霉素、头孢噻酚钠、克拉霉素、氯林霉素、红霉素、盘尼西林和万古霉素敏感，而对头孢曲松、 头孢噻肟钠、环丙沙星、庆大霉素、链霉素和四环素具有抗性。仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC Ne 2942 细胞中的脂肪酸 主要包括十八碳《7c单不饱和脂肪酸(35.00% )、十六碳饱和脂肪酸(25.01% )、十六 碳《7c单不饱和脂肪酸(17.89% )、十四碳饱和脂肪酸(6. 16% )和环式十七碳饱和脂 肪酸(5. 22%),并含有少量的3-羟基____卜六碳饱和脂肪酸(3. 43% )、____卜八碳饱和脂肪酸 (1. 66% )和3-羟基十四碳饱和脂肪酸；主要呼吸醌为泛醌Q9。仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC Ne 2942 的 G+C 摩尔百分含 量为67. 1% ；该菌株的16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示，与已发表的海旋菌属的 模式菌株厦门海旋菌CGMCC 1. 3998T(Thalassospira xiamenensis CGMCCl. 3998τ)、深海海 旋菌 CGMCC 1. 3997T (Thalassospira profundimaris CGMCC1. 3997τ)和卢森坦海旋菌 DSM 14000T(Thalassospira lucentensis DSM 14000τ)的 16S rRNA 基因序列的同源性分别为 99. 2%,98. 9%和 98. 0%。
仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis)P-4CGMCC Ne 2942 与上述三株模式菌 株DNA杂交的同源性都比较低，分别为39%、12%和3% ；同时，该菌株的生理生化特性、 细胞壁脂肪酸组成也与上述三株模式菌株有明显差异，说明仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC Ne 2942是海旋菌属的一个新菌种。本发明的另一个目的是提供--种降解多环芳烃的方法。本发明所提供的降解多环芳烃的方法，是用所述仙河海旋菌 (Thalassospiraxianhensis)P-4CGMCC Ne 2942对待测样品进行处理，使多环芳烃得到降解。上述方法中，所述多环芳烃为萘、菲或芘。以仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC Ne 2942 为活性成分制备的 生物制剂也属于本发明的保护范围。本发明的仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis) P-4CGMCC Ne 2942 是海旋菌属 的新菌种，分离自石油污染的高盐环境,能够有效降解多环芳烃菲并利用菲作为生长的唯 一碳源。在盐度为5%、加有0. 1 %酵母粉的液体培养基中，9天内对菲(初始浓度为IOOmg/ D的平均降解速率可达10. 8mg/(L*d)；同时该菌株能够在较高盐度下和较大盐度范围内 生长,属于嗜盐细菌类，对控制盐环境中多环芳烃的污染有独特的优势。本发明的仙河海旋 菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC Ne 2942 可用于多环芳烃的降解。下面结合说明书附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明，并非对本发明的限 制。
图 1 为仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC Ne 2942 在扫描电子显 微镜下的形态照片图 2 为仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC Ne 2942 在透射电子显 微镜下的形态照片图 3 为仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC Ne 2942 的 16S rRNA 基因序列的系统发育分析 4 为仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC Ne 2942 对菲的降解曲 线图
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材 料，如无特殊说明,均可从商业途径获得。实施例1、仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC No 2942 的分离及鉴一、采用醋酸-硝酸混合纤维素膜平板法分离菌株海盐合成培养基(SSDM)的 组成为=NaCl79. 45g/L、MgCl2 · 6H20 6. 9g/L、 MgSO4 ·7Η20 10. 45g/L, CaCl2 · 7Η20 0. 75g/L、KCl 2. lg/L,NaHCO3 0. lg/L,NaBrO. 25g/L、微 量元素溶液ImL/L ；以上各成分的含量对应盐度为10%的培养基(培养基的盐度等于培养基中各无机盐组分质量之和除以培养基的体积)，其它盐度的培养基可按此比例进行配制； 另含有(NH4)2SO4 4.0g/L，其余为水；采用5M KOH浓缩液调节培养基的pH至7. 5。其中，微 量元素溶液的组成为=Ca(NO3)2 · 4II20800mg/L、FeSO4. 7H20 400mg/L、CuSO4 · SII2O 80mg/L、 ZnSO4 · TW2Q 40mg/L、MnSO4 · 4H20 40rag/L、NaMO4 · 2H20 8mg/L、H3BO3 6mg/L、K2HPO4 500mg/ L,其余为水。
将菲溶解于乙醚中，配制成为浓度为lmg/mL的溶液。在盐度为5%的上述海盐合成培养基中加入质量百分含量为1. 5 1. 8%的琼脂 糖后,0. 06MPa条件下灭菌20min,随后趁热将培养基均匀倾倒于玻璃培养皿中，等培养基 凝固后,放置于37°C环境中，使固体培养基表面的水分完全蒸发。随后在平板培养基的表面 覆上已灭菌的醋酸_硝酸混合纤维素膜(微孔滤膜，孔径0. 45 μ m、直径90mm，购自北京经 科宏达生化试剂生物技术公司)，在膜上加ImL上述配制的浓度为lmg/mL的菲的乙醚溶液 并涂布均匀，待乙醚完全挥发后，盖好平板待用。同时将不含菲的乙醚涂布在上述纤维素膜 平板上作为空白对照。将采自山东省东营市仙河镇胜利油田的土壤样品加入到盐度为5%的上述海盐合 成培养基中，常温条件下200r/min振荡SOmin ；吸取ImL悬浮液于离心管中，5000r/min离 心IOmin ；弃去上清液,再加入相同体积的盐度为5%的上述海盐合成培养基进行洗涤。以 上洗涤过程重复3次,再将菌体沉淀进行一系列梯度稀释后涂布在上述含有菲的醋酸_硝 酸混合纤维素膜平板上，将涂布后的平板置于30°C条件F静置培养15天。实验设三次重 夏。结果表明，空白对照平板上没有任何菌落生长,说明没有外加菲作为碳源的平板 上,土壤样本中的微生物无法生长；相应的，加有菲的平板经过2d培养后发现有50余个单 菌落，说明这些单菌落对应的菌株能够降解菲并以菲为唯一碳源生长。挑取单菌落P-4作 进一步研究。二、菌株的形态特征SSDMY培养基的配制在盐度为5%的上述步骤一的海盐合成培养基中加入酵母 粉，使其在培养基中的终浓度为5. 0g/L，0. 06MPa条件下灭菌20min。将上述步骤一分离得到的菌株P 4接种至SSDMY培养基中，当细胞生长至对数生 长后期，菌落大小稳定后,进行单菌落平均状态的描述。主要包括菌落的大小、颜色、透明 度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规 贝IJ、放射状等)。将处于对数生长期的细胞,采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察细胞形 态,结果如图1和图2所示；同时进行革兰氏染色,于40X 100倍的光学显微镜下观察菌体 细胞的形态。结果表明，上述步骤一筛选到的菌株培养2d后，菌落直径为2 4mm，呈圆形、光 滑、隆起、奶油色或微黄色、有光泽、边缘整齐；在电子显微镜下观察，菌体细胞呈弯杆状或 螺旋状、无鞭毛,没有运动性,大小为(1. 03 1.65) μ mX (0. 33 0. 56) μ ra。三、菌株的生长特性上述步骤一筛选到的菌株属于革兰氏阴性、好氧细菌。该菌株最适生长PH值是 7. 2，可生长pH范围是4. 0 10. 0 ；最适生长温度为30°C，可生长的温度范围为10 42°C。该菌株的生长离不开无机盐,属于嗜盐微生物，能在0. 1 17%的盐度范围内进行生长繁 殖，适宜生长盐范围度为3 6%。四、菌株的生化特征1、碳源利用以SSDM为基本培养基,另包括以Biolog通用的95种碳源的糖、醇、酸作为唯一碳 源，检查菌株细胞的生长。2、糖类产酸糖类产酸培养基的组成为(NH4)2HPO4lg/L、MgSO4 · 7H2() 0. 2g/L、KCl 0. 2g/L、 酵母浸膏0. 2g/L、糖或醇类10g/L, pH7. 2 7. 5 ；上述培养基配好后,加入质量百分含量为 2%的溴百香里兰，使其在培养基中的终浓度为lmL/L。在糖类产酸培养基中分别加入D 半乳糖、海藻糖、D 葡萄糖、甘露糖、D 木糖、 D-果糖、麦芽糖和蔗糖，使其在培养基中的终浓度为1 调节培养基的PH为7. 5 ；再在每 升培养基中加入质量百分含量为1. 6%的溴甲酚紫水溶液1 2mL,该指示剂的变色范围为 PH4. 5 (黄色) 7. O (紫色)。将上述步骤一筛选到的菌株接种于上述培养基中后，35°C培 养24h后开始观察培养基的颜色。以不接种上述步骤一筛选到的菌株的试管为阴性对照。 培养基颜色变黄色者为产酸阳性菌株，阴性反应要连续观察7 14d。3、淀粉水解肉汤培养基的组成为牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L。在肉汤培养基中加入可溶性淀粉，使其在培养基中的终浓度为0.2%。将上述步骤 一筛选到的菌株点接于上述培养基平板上(每个平板点接5株)，35°C培养2 5d形成菌 苔后,在平板上滴加Lugal氏碘液(同革兰氏染色的碘液)，使碘液覆盖在平板表面。如在 菌苔周围或菌苔下(将菌苔移去后观察)的培养基由蓝色变为透明，则为淀粉水解阳性菌 株；若菌苔下和菌苔周围的培养基都为深蓝色,说明该菌株为淀粉水解阴性。4、明胶水解明胶水解培养基的组成为蛋白胨5g/L、明胶100 150g/L, pH7. 2 7. 4。将明胶水解培养基调pH为7. 2 7. 4，分装于试管中，使管中培养基的高度约为 4 5cm。取上述步骤一筛选到的菌株穿刺接种于上述培养基中，20°C培养2d后观察结果。 为判断阴性结果，需培养3 4周。若培养基部分或者全部变成可流动的流体,则为明胶水 解阳性菌株；若仍为固态,则说明是明胶水解阴性菌株。5、吐温80水解在盐度为5 %的SSDMY培养基中加入吐温80，使其在培养基中的终浓度为1 %，将 上述步骤一筛选到的菌株接种于上述培养基中，每个平板点接3 5株，35°C培养2 4d， 菌落周围有白色晕圈出现为阳性反应。6、氧化酶活性将上述步骤一筛选到的菌株接种在SSDMY固体培养基上，30°C培养24h。在一干净 的培养皿内放一张“新华1号”定性滤纸，滴加质量百分含量为的四甲基对苯二胺盐酸 盐溶液使滤纸浸湿，用竹签挑取菌苔,在滤纸上画线。Imin之内滤纸变紫色者为阳性反应， 反之为阴性反应。7、过氧化氢酶活性
将上述步骤--筛选到的菌株接种于SSDMY固体培养基斜面上,30°C培养24h,在菌 苔上加入数十滴体积百分含量为3%的H2O2溶液，立即检查结果。在5min之内出现气泡者 为阳性反应，但是往往立即出现气泡，个别菌株也会在Imin之内出现气泡；无气泡出现者 为阴性反应。8、DNA 酶活性提取上述步骤一筛选到的仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC No 2942的DNA，在盐度为5 %的SSDMY培养基中分别加入上述DNA和甲苯胺兰 (Toluid^blue),使它们在培养基中的终浓度分别为2%。和0. 1%。，将上述步骤一筛选到的 菌株接种于上述培养基中，每个平皿点接3 5株，35°C培养2 4d,如果菌落周围有粉红 色晕圈出现则为反应阳性，反之为阴性。9、脲酶活性在盐度为5 %的SSDMY培养基中加入酚红，调节p:H值，使溶液呈橙黄色,0. 06MPa 灭菌20min,待培养基冷却至40 50°C时加入过滤除菌的尿素溶液,使其在培养基中的终 浓度为2%，制作试管斜面。将上述步骤一筛选到的菌株划线接种于上述试管斜面上，35 培养2 4d后观察结果,培养基变成粉红色为阳性，反之为阴性反应。10、硝酸盐还原反应硝酸盐还原能力检测培养基的组成为蛋白胨10g/L、琥珀酸钠10g/L、NaN03lg/L、 K2HPO4 lg/L、MgSO4 0. 5g/L、KCl 0. 2g/L ;pH7. 2。将上述步骤一筛选到的菌株接种于上述培养基中，分别在接种2、5和7d后检查硝 酸盐还原情况，以不接种上述步骤一筛选到的菌株的培养基作为空白对照。具体检查方法如下在白色比色皿中加入1滴含有上述步骤一筛选到的菌株的菌 液，再加入Griess试剂A、B各1滴，如出现粉红、玫瑰红、橙色或棕色，则表明硝酸盐被还原 成亚硝酸；如加入Griess试剂后无颜色变化，可加入二苯胺试剂3 5滴，若出现蓝色反 应,说明培养液中的硝酸盐依然存在,则该菌为硝酸盐反应阴性；如果加入二苯胺试剂后无 任何颜色出现，说明亚硝酸盐被进一步分解为其他产物,为硝酸盐反应阳性。以上实验结果表明，上述步骤一筛选到的菌株除无法利用D-阿拉伯糖和α -乳糖 产酸外，可利用其它糖类，如蔗糖、麦芽糖、D 果糖、D 甘露醇、D 甘露糖、D 木糖、D 半乳 糖和D 葡萄糖产酸；该菌株能水解吐温80和明胶,但不能水解可溶性淀粉；该菌株的氧化 酶、过氧化氢酶和尿素酶为阳性，DNA酶为阴性；该菌株能使硝酸盐还原为氮气；该菌株能 利用戊五醇、核糖醇、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯醇、D-纤维二糖、D-果糖、龙胆二糖、α -D-葡 萄糖、D-甘露糖、D-山梨醇、松二糖、D-半乳糖酸内脂、葡萄糖酸、D 葡萄糖胺酸、α -酮戊 二酸、I), L 乳酸、奎宁酸/金鸡纳酸、葡萄糖二酸、D 丙氨酸、L 丙氨酸、L 丙氨酰甘氨 酸、L-谷氨酸、甘氨酰-L-天门冬氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-焦谷氨酸作为唯 一碳源和能源。五、抗生素抗性上述步骤一筛选到的菌株对抗生素中的氨苄青霉素、头孢噻酚钠、克拉霉素、氯林 霉素、红霉素、盘尼西林和万古霉素敏感；而对头孢曲松、头孢噻肟钠、环丙沙星、庆大霉素、 链霉素和四环素具有抗性。
六、与海旋菌属模式菌株生理生化特征的比较
将上述步骤一筛选到的菌株的生理生化特征与海旋菌属模式 菌株的生理生化特征相比较，结果如表1所示。其中，卢森坦海旋菌DSM 14000T (Thalassospiralucentensis DSM 140001)来自德国微生物和细胞培养物保藏 中心(German CollectionofMicroorganisras and Cell Culture, DSMZ)、深海海旋菌 CGMCC 1. 3997T (Thalassospira profundimaris CGMCC 1. 3997τ)和厦门海旋菌 CGMCC 1. 3998T (Thalassospira xiamenensis CGMCC 1. 3998τ)均来自中国普通微生物菌种保藏管 理中心。表1筛选得到的菌株与海旋菌属模式菌株的生理生化特征比较 表1中，+表示结果为阳性，-表示结果为阴性，ND表示未检测，W表示反应较弱。七、菌株的细胞化学成分分析1、呼吸醌的检测(1)取质量大于Img的上述步骤一筛选到的菌株，lOOOOr/min离心IOmin,用30mL 质量百分含量为的NaCl溶液洗涤菌体，离心。(2)将上述步骤(1)得到的菌体沉淀转入50mL离心管中，加入质量百分含量为 的NaCl溶液IOraL和由氯仿-甲醇组成的混合液(氯仿和甲醇的体积比为2 l)20mL,
振荡均匀直至菌体分散，4°C 10000r/min离心IOmin0(3)离心后样品分三层，上层是水，中层是残渣物，F层是氯仿(脂溶性成分)，用 滴管小心去除上层水层，将下层氯仿层转移至IOOmL茄形瓶中。(4)再次用20mL由氯仿—甲醇组成的混合液(氯仿和甲醇的体积比为2 1)对 中间混层进行萃取,振荡30min以上’ 4°C lOOOOr/min离心IOmin,小心将氯仿层转移合并至 上述步骤(3)的IOOmL茄形瓶中，重复萃取残渣过程1次，合并萃取液。(5)将萃取液合并在IOOmL茄形瓶中，40°C水浴，用旋转蒸发仪浓缩蒸干后，在茄 形瓶中加入20mL正己烷,摇床振荡30min,用滴管转移至SOmL离心管中。(6)加入IOmL纯水于离心管中，剧烈振荡清洗两次,小心移出上层溶液至IOOmL茄 形瓶中，用旋转蒸发仪浓缩蒸千后，加入20mL正己烷溶解(此步注意不要引入水)。(7)将两个Sep-Park Plus Silica连接,用5mL正己烷冲洗小柱子，将上述步骤 (6)制备的样品上柱,使流速控制在10-20滴/min以内，再用20raL的正己烷以同样流速洗 柱子。(8)采用含2%体积百分含量乙醚的正己烷洗脱液20mL进行洗脱，甲基萘醌类 (menaquinone)洗出液接入到50mL茄形瓶中；再用含10%体积百分含量乙醚的正己烷洗脱 液20mL进行洗脱,泛醌(ubiquinone)洗出液接入到另一 50mL茄形瓶中。(9)将上述步骤(8)中的两个样品分别用旋转蒸发仪蒸发掉溶剂,加入2_3mL丙 酮，小型摇床上摇动数分钟，最后分别转移至保存管中(溶液颜色与样品有关)。(10)将保存管抽至真空，加入200uL丙酮，随后采用高效液相色谱分析，采用C18反 相色谱柱，流动相为甲醇和异丙醚的混合液(体积比9 2)。结果表明，上述步骤一筛选到的菌株主要以辅酶Q9(泛醌9)作为主要呼吸醌。2、脂肪酸检测(1)溶液的配制溶液I :将45g氢氧化钠溶于300mL甲醇的水溶液中(甲醇和水的体积比为1:1); 溶液II :将190mL比重为1. 19g/mL的浓盐酸和275mL甲醇溶于135mL蒸馏水中；
溶液III 将200mL正己烷与200mL乙醚混合均匀；溶液IV 将10. Sg氢氧化钠溶于900inL蒸馏水中； 溶液V 饱和的氯化钠溶液(质量百分含量为26. 5% )。(2)提取方法和步骤取适量上述步骤一筛选到的菌株的培养物置于SmL螺口玻璃管中，加入ImL溶液 I,拧紧螺盖,沸水浴5rain,取出振荡5-IOs,再度拧紧螺盖,继续沸水浴25rain ；待样品冷却后，加入2mL溶液11,拧紧螺盖振荡，随后精确控制温度为80 士 1°C,水 浴lOmin，冰浴冷却；此步骤需严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏；在冷却的样品管中加入1. 25mL溶液III,快速振荡IOmin左右，弃去下层水相；在剩余的有机相中加入:ML溶液IV及几滴溶液V，快速振荡5rain左右,取三分之 二的上层有机相置于气相色谱样品瓶中备用。(3)分析方法采用气相色谱仪(IIP 6890)，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器 (FID)及气相色谱化学工作站(HP Chemstation ver A 5. 01)；色谱柱为Ultra-2柱(长 25m,内径0. 2mm,液膜厚度0. 33 μ m)；炉温为二阶程序升温起始温度170"C,每分钟升温 5°C至260°C，随后以40°C /min升温至31(TC，维持1. 5min ；进样口温度250V，载气为氮气， 流速为0.5mL/min，分流进样模式，分流比100 1,进样量2 μ L ；检测器温度为30CTC，氢气 流速3()mL/min,空气流速216m:L/min,补充气(氮气)流速3(M,/min。结果表明，上述步骤一筛选到的菌株细胞壁脂肪酸中主要是十八碳C07C单不 饱和脂肪酸(35.00% )、十六碳饱和脂肪酸(25. 01%)、十六碳《7c单不饱和脂肪酸 (17. 89% )、十四碳饱和脂肪酸(6. 16% )和环式十七碳饱和脂肪酸(5. 22% )，还含有少量 的3-羟基_____卜六碳饱和脂肪酸(3. 48% )、十八碳饱和脂肪酸(1. 66% )和3-羟基____卜四碳饱 和脂肪酸。将该菌细胞壁中脂肪酸组成与深海海旋菌CGMCC 1.3997τ、厦门海旋菌CGMCC 1. 39981和卢森坦海旋菌DSM 140001进行比较，结果如表2所示。表2筛选得到的菌株与海旋菌属模式菌株的脂肪酸组成比较 八、菌株的16S rRNA基因序列测定和系统发育分析提取上述步骤一筛选到的菌株的总DNA,采用细菌16S rDNA通用引物，正向引物为 5 ‘ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘,反向引物为 5 ‘ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ‘进行 PCR 扩增。PCR反应条件为先94°C 6min;然后94°C 45s, 54°C 45s, 72°C 90s，共30个循环； 最后72°C延伸IOminoPCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后连接到T-Easy载体上,送英俊生物有限公 司进行测序；采用Clustal X程序(1. 64b),系统发育分析通过MEGA (2. 1)软件采用近邻结 合法和最大简约法分析。结果表明，上述步骤一筛选到的菌株的16S rRNA基因序列如序列表中序列1所 示,其16S rRNA基因序列的系统发育分析图如图3所示。根据获得的16S rRNA基因序列比对和系统发育分析结果判定，上述步骤一 筛选到的菌株属于海旋菌属(Thalassospira)，并且与已发表的模式菌株厦门海旋菌 (T. xiamenensis)、深海海旋菌(T. profundimaris)和卢森坦海旋菌(T. Iucentensis)的 16S rRNA基因序列的同源性分别为99. 2%,98. 9%和98. O0丄九、与海旋菌属模式菌株的DNA-DNA杂交分析1、菌体细胞基因组DNA纯度的测定提取上述步骤一筛选到的菌株的总DNA,取10 μ L DNA样品于1. SmL离心管中，加 入190 μ L 0. 1 X SSC溶液进行溶解,使总体积为200 μ L,即将DNA样品稀释20倍，用枪吸打 数次,将DNA样品混匀、打碎。用紫外分光光度计分别测量260nm,280nm,230nm和270nm时 的紫外吸收值，适合做DNA/DNA杂交实验的DNA样品必须符合以下条件0D(260nm)/0D(280nm) > 1. 8，说明蛋白质含量符合要求；OD (260nm) /01) (230nra) > 2. 0,说明糖含量符合要求；OD (260nm) > OD (270nm),说明酚含量符合要求。2、G+C摩尔百分含量的测定采用热变性温度法测定DNA样品的G+C摩尔百分含量，仪器包括紫外分光光度计 (Lambda Bio 20型)、温度控制仪(PTP-1)、循环水浴。整个测定过程由UV Winlab软件控 制。具体测定过程如下(I)Tm值的测定将上述DNA样品用0. IX SSC溶液进行适当稀释，使其吸光度为0. 2 0. 5 ；依次 打开UV Winlab软件中的DNADEF. MTD窗口禾Π PE Applications软件中的Templab窗口设 定合适的参数，然后开始测定。在两个比色杯中各加入ImL 0. IX SSC溶液，将比色杯放入比色架内，根据计算机 的提示进行仪器的调零；然后将比色杯取出，加入100 μ L上述稀释好的DNA样品溶液，插入 温度传感器探头,将比色杯放回可加热的比色架内，通过计算机控制温控仪升温，在30rain 内使样品温度由70°C均匀的上升到90"C,其间记录DNA样品在260nm处的吸光值,得到DNA 样品的变性曲线。测定结束后，利用计算机相关软件计算出变性曲线的一阶导数曲线，记录 一阶导数曲线峰值所对应的温度，即为DNA样品的解链温度，即Tm值。(2) DNA的G+C摩尔百分含量的计算如果DNA的G+C摩尔百分含量值在25 % 75 %的范围内，其Tm值与DNA的G+C 摩尔百分含量之间呈线形关系。为消除温度误差及其他实验误差，需用大肠杆菌K12菌株 (购自北京经科宏达生化试剂生物技术公司)的DNA作为参照。在0.1 XSSC溶液中，G+C摩尔百分含量的计算公式为DNA 的 G+C 摩尔百分含量=51. 2+2. 08 X [Tm (X) -Tm (R)]。其中，Tm(X)为上述步骤一筛选到的菌株的Tm值Jm(R)为大肠杆菌K12菌株的 Tm值。3、DNA-DNA 杂交试验(I)DNA样品的剪切用于DNA-DNA杂交的样品浓度要求A26。(260nm吸光度)大于 2. 0 (约100 μ g/mL)。先将上述步骤一筛选到的菌株的DNA用0. 1 X SSC调到A26tl = 2. 0左 右,为使样品的浓度一致,要求各样品的A26ci值的差异小于0. 1。取SmL上述步骤一筛选到的 菌株的DNA置于5mL离心管中，加入0. 72mL 10 X SSC溶液,使缓冲液的终浓度为2 X SSC。用 超声波剪切DNA样品，其输出功率为6W，剪切的时间为4min，间隔时间为2s，重复3次。因超 声波剪切时会产生相当的热量，可能导致剪切的DNA样品发生降解，因此在剪切过程中DNA 样品应置于冰上。剪切完毕后迅速将样品按0. 6mL分装在1.5mL离心管中，置于 2(TC保存。 通过琼脂糖凝胶电泳来检测样品的剪切质量。一般要求DNA片段的大小集中在2 X IO5 5 X IO5Da (400 800bp)。(2) DNA变性将上述剪切过的DNA用0. 1 X SSC溶液精确配制成OD26ci为1. 5-2. 0， 根据公式T()R (最适复性温度)=0. 51 X (G+C摩尔百分含量)+47°C，计算TOR值，根据TOR 值设定温度，预热比色杯。(3)打幵分光光度计和电脑，选择合适的程序，固定波长为260·，固定温度为 TOR,用2 X SSC溶液调零，总时间为30min，每隔15s测一次吸光度值。(4)吸取200 μ L上述制备的DNA样品，分别和200 μ L预备杂交的DNA (即同一属 的模式菌株深海海旋菌CGMCC 1. 3997τ、厦门海旋菌CGMCC 1. 3998τ或卢森坦海旋菌DSM 14000τ的基因组DNA)混合，将上述DNA混合液分别加到1. 5mL离心管中，同时加400 μ L 10 X SSC于另一离心管中，将上述离心管全部放入1000C水浴IOmin后，用预热的枪头吸 取96 μ L热的1.0XSSC溶液加入到装有上述DNA混合液的热的离心管中，使其终浓度为 2 X SSC,迅速吸取稀释后的DNA混合溶液200 μ L加入到预热到TOR温度值的比色杯中，测 定吸光度，并做出复性曲线。(5)根据下面的公式计算杂交率 式中Va、Vb、Vffl分别表示样品A、B和混合样品M(A+B)的复性速率。4、DKA-DKA杂交分析结果上述实验结果表明，上述步骤一筛选到的菌株的DNA与已发表的模式菌株厦门海 旋菌(T. xiamenensis)、深海海旋菌(T. profundimaris)和卢森坦海旋菌(T. Iucentensis) 的DNA同源性都比较低，分别为39 %、12 %和3 %。且该菌株的G+C摩尔百分含量为61. 6 %， 而厦门海旋菌、深海海旋菌和卢森坦海旋菌的G+C摩尔百分含量分别为52. 6%、47. 0%和 54. 7%0基于以上测定结果，将....I;述步骤一筛选到的菌株鉴定为仙河海旋菌 (Thalassospira xianhensis)P-4，并于2009年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJfeas 北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研 究所)，保藏登记号为CGMCC No 2942。实施例2、仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCCNe 2942 降解菲的性 能将菲溶于二甲基甲酰胺中，过滤除菌；在盐度为5%的上述实施例1的海盐合成培 养基中加入酵母粉，使其在培养基中的终浓度为0.1%，同时在培养基中加入....Li述过滤除菌 的菲溶液，使菲在培养基中的终浓度为100mg/L。将仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis) P-4CGMCC Ne 2942 按照 5 % 的接种
量接入上述培养基中，在30 、转速为200r/min的好氧避光条件下培养10d。同时，以 不加菲但是加入二甲基甲酰胺的培养基作为对照，用于检查仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC No 2942是否能利用二甲基甲酰胺；以不接种细菌的作为空白对照， 用于扣除菲挥发的影响；以接种仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis) P-4CGMCC Ne 2942 死菌体的作为死菌对照,用于扣除菌体吸附的影响。培养过程中，定时取样，向所取样本中加入等体积的乙酸乙酯，120r/min振荡 5min,以充分萃取吸附在菌体表面的颗粒物，随后10000r/min离心5min，取有机相，重复 萃取3次,合并有机相在真空旋转蒸发仪中去除乙酸乙酯,加入1.00 μ L甲醇,避光 2(rc 保存待测。利用高效液相色谱法(HPLC)检测菲的浓度；Waters 600E液相色谱仪,色谱柱 % Supelcosil LC18-DB,流动相(甲醇和水，体积比为80 20)，流速lmL/min，检测波长 254nm。实验设三次重复。菲的降解曲线如图4所示，结果表明，仙河海旋菌 (Thalassospira xianhensis)P-4CGMCCNe2942在9天内对菲的平均降解速率可达 10. 8mg/ (L · d)。实施例3、仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCCNe 2942 降解萘的性 能将萘溶于二甲基甲酰胺中，过滤除菌；在盐度为5%的上述实施例1的海盐合成培 养基中加入酵母粉，使其在培养基中的终浓度为0. 1%，同时在培养基中加入上述过滤除菌 的萘溶液，使萘在培养基中的终浓度为100mg/L。将仙河海旋菌仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis) P-4CGMCC Ne 2942 按照 5%的接种量接入上述培养基中，在30°C、转速为200r/min的好氧避光密封(为保证氧气供 给，300mL培养瓶中加30mL培养基)条件下培养10d。同时，以不加萘但是加入二甲基甲酰 胺的培养基作为对照，用于检查仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis)P-4CGMCC Na 2942 是否能利用二甲基甲酰胺；以不接种细菌的作为空白对照，用于扣除萘挥发的影响；以接 种仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis) P-4CGMCC Ne 2942死菌体的作为死菌对照,用于 扣除菌体吸附的影响。培养IOd后取样，利用高效液相色谱法(HPLC)测定萘的降解率；Waters 600E液 相色谱仪,色谱柱为Supelcosil LC18-DB，流动相(甲醇和水,体积比为80 20),流速ImL/ min,检测波长276nm。实验设三次重复。结果表明，培养IOd后，加有萘的含活菌的样本中未检出萘，而 加有萘的空白对照和含死菌对照中均检出明显的萘；加有二甲基甲酰胺的含活菌对照、加有萘的空白对照和含死菌对照中始终没有颜色变化,而加有萘的含活菌样本中的颜色逐渐 由无色变为黄色，说明仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC Ne 2942能够降
解萘。 实施例4、仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P 4CGMCCNe 2942 降解芘的性 能将芘溶解于乙醚中，配制成为浓度为lmg/mL的溶液。在盐度为5%的上述海盐合成培养基中加入质量百分含量为1. 5 1. 8%的琼脂 糖后,0. 06MPa条件下灭菌20min,随后趁热将培养基均匀倾倒于玻璃培养皿中，等培养基 凝固后,放置于37°C环境中，使固体培养基表面的水分完全蒸发。随后在平板培养基的表面 覆上已灭菌的醋酸_硝酸混合纤维素膜(微孔滤膜，孔径0. 45 μ m、直径90mm，购自北京经 科宏达生化试剂生物技术公司)，在膜上加ImL上述配制的浓度为lmg/mL的芘的乙醚溶液 并涂布均匀，待乙醚完全挥发后，盖好平板待用。同时将不含芘的乙醚涂布在上述纤维素膜 平板上作为空白对照。将仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis) P-4CGMCC Ne 2942 接种于 SSDMY 液体 培养基中，常温条件下140r/min振荡培养4天；吸取ImL菌悬液于离心管中，5000r/min离 心IOmin ；弃去上清液，将菌体沉淀涂布在上述含有芘的醋酸-硝酸混合纤维素膜平板上， 将涂布后的平板置于3CTC条件下静置培养15天。结果表明，空白对照平板上没有任何菌落生长，说明没有外加芘作为碳源的平板 上，仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC Ne 2942无法生长；相应的，在加有 芘的平板上，仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC Ne 2942能够生长，说明仙 河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC Ne 2942能够降解芘并以芘为唯一碳源生 长。序列表<110>清华大学<120> 一株可降解多环芳烃的海旋菌及其应用<130>CGGNARZ92153<160>1<210>1<211>1456<212>DNA<213> 仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4<400>1agagtttgat cctggctcag aacgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgtac 60gagaaggttc tttcgggaac tggagagtgg cgcacgggtg agtaacgcgt ggggacctac 120ctcttagtgg gggataacgg ttggaaacga ccgctaatac cgcatacgcc cttcggggga 180aagatttatc gctaagagat ggacccgcgt tggattagat agttggtgag gtaacggctc 240accaagtcag cgatccatag ctggtttgag aggatgatca gccacactgg gactgagaca 300cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga 360tccagccatg ccgcgtgagt gaagaaggcc ttcgggttgt aaagctcttt cagatgcgaa 420
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仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4，其保藏登记号为CGMCC №2942。
2.仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis)P-4CGMCC Ne 2942在降解多环芳烃中的
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述多环芳烃为萘、菲或芘。
4.一种降解多环芳烃的方法，是用权利要求1所述仙河海旋菌 (Thalassospiraxianhensis)P-4CGMCC No 2942对待测样品进行处理,使多环芳烃得到降
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于所述多环芳烃为萘、菲或芘。
6.一种降解多环芳烃的生物制剂，其活性成分为权利要求1所述仙河海旋菌 (Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC Ne 2942。
7.根据权利要求6所述的生物制剂，其特征在于所述多环芳烃为萘、菲或芘。
全文摘要
本发明公开了一株可降解多环芳烃的海旋菌及其应用。本发明的仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC№2942是海旋菌属的新菌种，分离自石油污染的高盐环境，能够有效降解多环芳烃菲并利用菲作为生长的唯一碳源。在盐度为5％、加有0.1％酵母粉的液体培养基中，9天内对菲(初始浓度为100mg/L)的平均降解速率可达10.8mg/(L·d)；同时该菌株能够在较高盐度下和较大盐度范围内生长，属于嗜盐细菌类，对控制盐环境中多环芳烃的污染有独特的优势。本发明的仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC№2942可用于多环芳烃的降解。
文档编号C12R1/01GK101838617SQ20091008001
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月17日 优先权日2009年3月17日
发明者宁大亮, 王慧, 赵百锁 申请人:清华大学