一种检测人MDR1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用与流程

本发明属于生物医学领域临床检测技术中的核酸检测
技术领域：
，具体是涉及到一种检测人mdr1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用。
背景技术：
：聚合酶链式反应(pcr)技术是当前核酸检测中最常用技术之一，其中采用荧光标记的taqman探针法的实时荧光pcr技术在核酸检测、临床诊断及分子生物学研究等方面的应用已经非常成熟，该技术已经应用到实验室研究、食品安全、医药卫生等众多行业中，但是这些技术大多采用单个反应管检测单一靶核苷酸，当在单个反应管检测多个靶核苷酸时，由于要同时引入检测不同靶核苷酸的引物和探针序列，这些引入的引物和探针会因为互相之间存在杂交而产生干扰，同时因为涉及到位于人类mdr1基因同一个基因上的三个位点(1236位点、2677位点、3435位点)，非常困难找到既能区别野生型和突变型，且又能在单管中不会互相干扰的引物探针设计。同时，作为一个试剂盒，需要规避假阴性就需要加入内对照靶核酸序列以及能检测内对照靶核酸序列的引物探针，加剧了单管多重pcr技术的困难。目前，基因分型的方法主要有测序法、聚合酶链反应-限制性长度多态性技术、芯片法、以及荧光定量pcr法等。这些技术都必须经过繁琐的核酸提取、纯化过程来获得较高纯度的模板dna。增加操作的步骤，费时费力，且增加人为操作误差导致的假阳性率和假阴性率。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种检测人mdr1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用，各引物相互之间不干扰，特异性高，灵敏度、重复性好。本发明的内容包括一种检测人mdr1基因多态性的组合物，所述组合物包括用于检测人mdr1基因1236位点、2677位点、3435位点多态性的引物，所述检测人mdr1基因1236位点多态性的引物包括序列如seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示的引物；所述人mdr1基因2677位点多态性的引物包括序列如seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示的引物；所述人mdr1基因3435位点多态性的引物包括序列如seqidno.10、seqidno.11和seqidno.12所示的引物。还包括检测人mdr1基因1236位点多态性的探针，序列为seqidno.1，检测人mdr1基因2677位点多态性的探针，序列为seqidno.5，检测人mdr1基因3435位点多态性的探针，序列为seqidno.9。所述组合物还包括用于检测mdr1基因1236位点、2677位点、3435位点多态性的内标引物及内标探针，所述内标引物序列如seqidno.13和seqidno.14所示，所述内标探针序列如seqidno.15所示。本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有pcr检测试剂a和pcr检测试剂b，所述pcr检测试剂a包含序列如seqidno.2、seqidno.4、seqidno.6、seqidno.8、seqidno.10、seqidno.12、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.1、seqidno.5、seqidno.9、seqidno.13的多种引物和探针；所述pcr检测试剂b包含序列分别如seqidno.3、seqidno.4、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.1、seqidno.5、seqidno.9、seqidno.13的多种引物和探针。所述试剂盒还包括样本溶解液，所述样本溶解液包含tris-hcl缓冲液、十二烷基硫酸钠、edta、甘油和蛋白酶k。还包括：野生型对照品、突变型对照品和空白对照品；所述野生型对照品为包含有mdr1基因多态性位点1236位点、2677位点、3435位点的野生型重组质粒以及包含有内标基因的重组质粒的混合物；所述突变型对照品为包含有mdr1基因多态性位点1236位点、2677位点、3435位点的突变型重组质粒以及包含有内标基因的重组质粒的混合物；所述空白对照为不包含mdr1基因多态性位点及内标基因的生理盐水。本发明提供一种样品处理方法，该方法使用本发明的试剂盒，包括如下步骤：1)取预处理好的人基因组核酸样本2份，将2份样本分别与所述pcr检测试剂a和pcr检测试剂b混合，其中，seqidno.1、seqidno.5、seqidno.9所示探针分别被rox、cy5、fam荧光标记，seqidno.15所示探针被vic或hex荧光标记；进行pcr扩增反应，采集cy5，fam，rox，vic或hex荧光信号；2)结果判断：反应结束后保存结果，根据分析后图像调节baseline的start值、end值以及threshold值(用户可根据实际情况自行调整，start值可以在3～15、end值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线，仪器的阈值不建议建议手动调节，如果需要，用户可以根据扩增结果设置为外控信号高度的1/8处)。当野生型对照品和突变型对照品有cy5，fam，rox，vic或hex荧光信号起线，空白对照均无cy5，fam，rox，vic或hex荧光信号起线，样品检测管vic或hex的ct≤35时，判断实验成功；根据两个样品检测管a、b中rox荧光信号的δct值情况判读mdr1基因1236位点的分型，根据两个样品检测管a、b中cy5荧光信号的δct值情况判读mdr1基因2677位点的分型，根据两个样品检测管a、b中fam荧光信号的δct值情况判读mdr1基因3435位点的分型。pcr扩增反应的程序包括：基因分型判读遵循如下规则：计算方式：δctfam＝ctfam(b)-ctfam(a)-(cthex(b)-cthex(a))δctcy5＝ctcy5(b)-ctcy5(a)-(cthex(b)-cthex(a))δctrox＝ctrox(b)-ctrox(a)-(cthex(b)-cthex(a))，当seqidno.15所示探针被vic荧光标记时，cthex为ctvic；若rox/cy5/fam判定无ct值，则默认为ct值为40，列入计算，本发明还包括一种试剂盒在检测人mdr1基因多态性方面的应用。第一方面本发明主要内容为优化设计了一种样本溶解液，与样本混合短暂静置后，取样配合本发明的mdr1基因pcr检测试剂a、mdr1基因pcr检测试剂b直接进行实时荧光pcr扩增，无需经过复杂繁琐的核酸提取纯化步骤即可实现对目标基因的检测。第二方面，本发明主要内容为优化设计出在两种单个pcr反应管中多重检测样品中人类mdr1基因的1236位点、2677位点、3435位点的反应体系，其包括：(1)mdr1基因pcr检测试剂a、mdr1基因pcr检测试剂b。mdr1基因pcr检测试剂a检测mdr1基因1236位点、2677位点、3435位点野生型，mdr1基因pcr检测试剂b检测mdr1基因1236位点、2677位点、3435位点突变型。(2)单个pcr反应管中含有的taqdnapolymerase、氯化镁、dntps(datp、dctp、dgtp和dttp)、内对照核酸、靶核酸引物对、内对照核酸引物对、两种靶核酸探针和内对照核酸探针。其中各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团检测波长互不相同；(3)进行pcr反应，并实时检测不同波长的荧光；(4)根据荧光定量pcr扩增各通道结果计算出的ct值作差，根据得出的δct值判断样本mdr1基因型(1236c>t,2677g>t,3435c>t)。在本发明的第二方面，所述实时荧光pcr方法所检测的样品是含有靶核酸的离体样品，如血液、血液制品、脱落细胞等。所述实时荧光pcr方法仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸的基因分型。在本发明的第二方面的方法中，样品是经过本发明第一方面样本溶解液与样本混匀短暂静置的混合液，不可用其他方法富集的核酸溶液进行检测，有失败或假阴性的风险。本文中，“单个pcr反应管”指所述实时荧光pcr方法在技术上是在同一个容器中进行的，没有必要更换容器。最优选择其中所述容器是pcr反应管，其他可以进行pcr反应并可进行实时荧光检测的容器也在本发明的保护范围内。在本发明第一方面的实时pcr方法中，在同一个容器中就可以完成pcr扩增和实时检测的步骤，整个过程不必更换容器，因而方便了操作者。操作者只需要向容器中加入样品与各种试剂即可，就可以通过市售的普通实时荧光pcr仪来自动完成目标基因位点的检测，非常方便于使用者，也便于机械实现自动化。在本文中，“多重检测”是指同时检测多种靶核酸，即至少一种。在本发明的第一方面的方法中，由于至少检测了内对照和一种靶核酸，因此检测的核酸至少有两种。当要检测的靶核酸种类不止一种时，同时检测的核酸相应增加。其中，每种核酸只能是dna。在本发明的具体实施方式中，优先选择进行二重检测、三重检测检测。在本发明的第二方面的方法中，检测的靶核酸可以是其中的一种、两种、三种，分别为mdr1基因pcr检测试剂a检测mdr1基因1236位点、2677位点、3435位点野生型，mdr1基因pcr检测试剂b检测mdr1基因1236位点、2677位点、3435位点突变型。本发明人经过大量的样品试验、数据分析及总结，从设计的数对引物探针中优选出四对引物探针并验证了最优工作浓度，可以满足本试剂盒对靶核酸检测的高特异性、高灵敏度和重复性的要求，并且在混合体系中三对引物探针不存在互相干扰的情况。具体引物探针设计为：1.针对mdr1基因1236位点，根据文献报道，优选其高度保守区域作为扩增区域，针对该区域设计的引物对序列为野生型引物seqidno.2和突变型引物seqidno.3，下游引物为序列为seqidno.4，探针序列为seqidno.1。2.针对mdr1基因2677位点，根据文献报道，优选其高度保守区域作为扩增区域，针对该区域设计的引物对序列为野生型引物seqidno.6和突变型引物seqidno.7，下游引物为序列为seqidno.8，探针序列为seqidno.5。3.针对mdr1基因3435位点，根据文献报道，优选其高度保守区域作为设计区域，针对该区域设计的引物对序列为野生型引物seqidno.10和突变型引物seqidno.11，下游引物为序列为seqidno.12，探针序列为seqidno.9。在确定了mdr1基因1236位点、2677位点、3435位点引物探针序列及反应浓度之后，设计加入了作为试剂盒控制假阴性的内对照引物探针。本试剂盒采用的内对照靶标为人体基因组的一种管家基因，对应的引物为seqidno.13和seqidno.14，荧光探针为seqidno.15。在本发明的第二方面，在筛选优化mdr1基因1236位点、2677位点、3435位点和内对照核酸的引物及荧光探针序列后，对步骤(1)中所述单个pcr反应管做了进一步升级，优化dntps、酶、氯化镁等组分使用浓度；混合了其他pcr所需反应试剂，如ph缓冲剂和盐。还加入了一定体积的甘油，用以延长酶在pcr条件下的活性。在本发明的具体实施中，ph缓冲剂优先选择的是bicine-koh、k-acetate；盐优先选择的是kcl；还加入了bsa(牛血清白蛋白)作为蛋白酶保护剂，分别确定各套探针引物序列反应的环境范围，最终在两套体系中获得交集，本发明确定步骤(1)所述单个多重pcr反应管的体系如下：表1mdr1基因多重实时荧光pcr反应体系a序号组分终浓度1bicine-kohph8.2100mm2k-acetate125mm3glycerol8％(v.v)4bsa20μg/ml5kcl5mm6edta1μm7tthdnapolymerase1u/test8taqdnapolymerase2u/test9dntps2mm10mgcl22.5mm11seqidno.215pmol/test12seqidno.415pmol/test13seqidno.615pmol/test14seqidno.815pmol/test15seqidno.1015pmol/test16seqidno.1215pmol/test17seqidno.137.5pmol/test18seqidno.147.5pmol/test19seqidno.15pmol/test20seqidno.55pmol/test21seqidno.95pmol/test22seqidno.153.25pmol/test表2mdr1基因多重实时荧光pcr反应体系b序号组分终浓度1bicine-kohph8.2100mm2k-acetate125mm3glycerol8％(v.v)4bsa20μg/ml5kcl5mm6edta1μm7tthdnapolymerase1u/test8taqdnapolymerase2u/test9dntps2mm10mgcl22.5mm11seqidno.315pmol/test12seqidno.415pmol/test13seqidno.715pmol/test14seqidno.815pmol/test15seqidno.1115pmol/test16seqidno.1215pmol/test17seqidno.137.5pmol/test18seqidno.147.5pmol/test19seqidno.15pmol/test20seqidno.55pmol/test21seqidno.95pmol/test22seqidno.153.25pmol/test在本发明的第二方面的方法中，不同种探针之间所标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，这样就能够同时且快速地顺序扫描不同的检测波长，分别记录下各种荧光基团的荧光变化，从而能够进行同时检测。在本文中，探针具有本领域技术人员所熟知的含义，其为能与扩增出的靶核酸单链结合的单链dna。通常，在每种探针的核苷酸序列的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。采用的荧光基团及淬灭基团是市售的，如可以采用fam/sybr-green,vic/joe/hex,ned/tamra/cy3,rox/texasred和cy5等常规产品，它们的检测波长互不相同，也可以委托公司直接合成有荧光标记的探针。在本发明的具体实施方式中，各靶核酸采用的荧光标记如下表：表3各靶核酸对应荧光种类在第二方面，本发明提供了用于本发明第二方面所述方法的检测试剂盒，其包括dna聚合酶、dntps、靶核酸引物对、内对照核酸引物对、一种或几种靶核酸探针和内对照核酸探针，其中前述各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同。其中，不同的试剂可以分装在不同的容器中，容器可以是瓶、盒、注射器等容纳上述试剂的容器。检测试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示按照本发明第二方面所述方法进行操作。根据需要，如方便运输、存放，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。在第三方面，本发明提供了本发明第二方面所述的检测试剂盒在制备用于本发明第一方面所述方法的检测试剂产品中的应用。检测试剂产品可以是检测试剂盒本身，也可以是合并装有多个检测试剂盒的更大包装产品。根据前文所述，本领域技术人员很同意理解其中检测试剂盒的成分以及其中方法的流程。表4序列表seqidno.1aggtgctgagtgggcagacggtseqidno.2ctggtagttcttgtagcgcseqidno.3ctggtagttcttgtagcgtseqidno.4gactgttgtgctcttccctcseqidno.5tgggaaggtgagtcaaactaaatgtseqidno.6gtaagaaagaactagaagatgseqidno.7gtaagaaagaactagaagattseqidno.8gcatagtaagcagtagggagtaacseqidno.9agcaaaggaggccaacatacatgseqidno.10ggtggtgtcacaggaagaaatcseqidno.11ggtggtgtcacaggaagatattseqidno.12ttacattaggcagtgacttgatseqidno.13tgccacccagaagactgtggatggseqidno.14ctttggtatcgtggaaggactcaseqidno.15gccatcacgccacagtttcc本发明的有益效果：1、利用本发明试剂盒的样本溶解液可以快速释放人血液样本或者口腔拭子悬液样本中的基因组核酸，整个试验过程无须单独提取样本中的dna，只需将样本直接与样本溶解液充分混合即可作为pcr扩增的模板，减少了操作步骤，避免了常规核酸提取过程中的环境污染。2、利用本发明试剂盒可以快速对人mdr1基因进行分型，具有操作简单快捷，敏感度高，特异性强，结果判读客观等优势。3、本试剂盒所用探针为taqman探针，成本低廉；同时，本发明的所有反应全程闭管进行，pcr反应后不用对产物进行回收、纯化、酶切、电泳等步骤，既节约了检测成本，缩短了检测周期，还降低了pcr产物引起的假阳性污染。4、本试剂盒包含内标基因的引物和探针，通过对内标基因的检测，减少了因操作过程产生的假阴性。5、本发明试剂盒采用的是普通荧光定量pcr平台，平台使用范围广，相对于测序法、芯片法更容易实现高通量检测，更能满足临床需要。附图说明图1为实施例1的mdr1基因pcr检测试剂a的检测结果图。图2为实施例1的mdr1基因pcr检测试剂b的检测结果图。图3为实施例2的mdr1基因pcr检测试剂a的检测结果图。图4为实施例2的mdr1基因pcr检测试剂b的检测结果图。具体实施方式以下本文将通过具体实施例来描述本发明，其中所用检测试剂来自湖南健基生物技术有限公司，所用探针、引物委托上海百利格生物技术公司合成，所用化学试剂采购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，所用dnapolymerase来自宝生物工程(大连)有限公司。本发明试剂盒组成如下：表1试剂盒的组成实施中使用试剂盒的操作步骤(1)样本预处理a.用1.5mlep管取50μl人口腔拭子悬液，加入50μl样本溶解液混合，移液器捶打数次混匀，室温静置10min；b.用1.5mlep管取50μl人抗凝全血，加入100μl红细胞裂解液，移液器吹打数次混匀，10000rpm/min离心1min弃上清，加入50μlddh2o吹打混匀，再加入50ul样本溶解液，震荡混匀，室温静置10min；(2)将两份10ul样本混合液分别与40ul反应体系a(mdr1基因pcr检测试剂a39ul+酶混合液1ul)、反应体系b(mdr1基因pcr检测试剂b39ul+酶混合液1ul)混合，再将pcr八联管置于荧光pcr仪中进行荧光pcr扩增反应，采集cy5、fam、rox、hex或vic荧光信号；(3)结果判断：当野生型对照品和突变型对照品分别在检测试剂a和检测试剂b中有cy5、fam、rox、hex或vic荧光信号起线，空白对照均无cy5、fam、rox、hex或vic荧光信号起线，样品检测管hex或vic的ct≤35时，判断实验成功；根据两个样品检测管a、b中rox荧光信号的δct值情况判读mdr1基因1236位点的分型，根据两个样品检测管a、b中cy5荧光信号的δct值情况判读mdr1基因2677位点的分型，根据两个样品检测管a、b中fam荧光信号的δct值情况判读mdr1基因3435位点的分型；(4)pcr扩增反应的程序包括：基因分型判读遵循如下规则：计算方式：δctfam＝ctfam(b)-ctfam(a)-(cthex(b)-cthex(a))δctcy5＝ctcy5(b)-ctcy5(a)-(cthex(b)-cthex(a))δctrox＝ctrox(b)-ctrox(a)-(cthex(b)-cthex(a))，若rox/cy5/fam判定无ct值，则默认为ct值为40，列入计算。实施例1三重检测使用上述方法对该样本进行检测，结果如图1所示，基因型为3435ct，2677gg，1236cc。在图1中，以图的最右侧线条为准，从上往下的线条依次为荧光标记：rox、fam、cy5、hex。在图2中，以图的最右侧线条为准，从上往下的线条依次为荧光标记：fam、rox、hex、cy5。实施例2三重检测使用上述方法对该样本进行检测，结果如图2所示，该样本基因型为3435cc,2677gg,1236cc。在图3中，以图的最右侧线条为准，从上往下的线条依次为荧光标记：rox、fam、cy5、hex。在图4中，以图的最右侧线条为准，从上往下的线条依次为荧光标记：rox、cy5、hex、fam。<110>湖南健基生物技术有限公司<120>一种检测人mdr1基因多态性的组合物、试剂盒、样品处理方法和应用<160>15<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1aggtgctgagtgggcagacggt22<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2ctggtagttcttgtagcgc19<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3ctggtagttcttgtagcgt19<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4gactgttgtgctcttccctc20<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列<400>5tgggaaggtgagtcaaactaaatgt25<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<400>6gtaagaaagaactagaagatg21<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7gtaagaaagaactagaagatt21<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<400>8gcatagtaagcagtagggagtaac24<210>9<211>23<212>dna<213>人工序列<400>9agcaaaggaggccaacatacatg23<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10ggtggtgtcacaggaagaaatc22<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<400>11ggtggtgtcacaggaagatatt22<210>12<211>22<212>dna<213>人工序列<400>12ttacattaggcagtgacttgat22<210>13<211>24<212>dna<213>人工序列<400>13tgccacccagaagactgtggatgg24<210>14<211>23<212>dna<213>人工序列<400>14ctttggtatcgtggaaggactca23<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15gccatcacgccacagtttcc20当前第1页12