本发明涉及缓释材料及微生物技术领域，具体涉及一种利用乳化法制备解磷微生物缓释海藻酸钠微球的方法。
背景技术：
海藻酸钠(sa)是一种线性嵌段共聚物，属于天然杂多糖，主要从褐藻中提炼得到。海藻酸钠具有相容性好、无毒无害、可降解等优点，其主链上带有羧基，在与二价阳离子(mg2+除外)接触瞬间，通过古洛糖酸上的na+与二价阳离子交换而发生凝胶化反应，形成热不可逆性凝胶。
缓释微球是用特殊材料将功能分子或菌种包埋得到的一种微球制剂。缓释微球能够在一定条件下缓慢释放所包埋的物质，或者成为一个受外界环境影响较小的微反应器进而产生特定物质并释放出来。由于海藻酸钠优良的生物相容性，将其作为微生物的包覆材料可以在一定程度上保证菌种活性。此外，海藻酸钠还具有良好的生物降解性，未来应用于生物肥料中可以很大程度上避免对环境的污染。
缓/控释肥料和微生物肥料已经慢慢被人们所熟知，而将两者结合起来却不多见。通过微生物的缓释可以提高工程菌种与当地微生物的竞争能力，包覆后的微球在一定程度上降低了环境变化对微生物活性的影响，这样一来不仅提高了微生物肥料的有效作用时间，而且降低了化学肥料的使用频率和用量，有助于减轻环境污染。
本发明利用磷矿矿区现场的解磷微生物菌群或土壤解磷菌群作为包覆菌种，通过筛选、富集、驯化进一步提高了其对环境的适应性和固定磷的能力，由此制成的肥料具有见效快、作用时间长等优势。此外，通过乳液法制成的微球粒径较小、分散性更好，更重要的是有利于大量生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有微生物缓释微球制备技术复杂以及所使用的微生物菌种性能不足等问题，改用乳化法合成解磷微生物缓释海藻酸钠微球，并对菌种进行了筛选、富集和驯化处理使其具有更好的环境适应性，在一定程度上提高了微生物肥料的有效作用时间，并且此解磷微生物缓释海藻酸钠微球的制备方法简单、易行，在技术和经济上具有较大的优势，对环境无害保障其可以广泛应用。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
利用乳化法制备解磷微生物缓释海藻酸钠微球的方法，包括以下步骤：
(a)以低品位磷矿粉为驯化剂，对磷矿矿区微生物菌群或农田土壤微生物菌群等进行筛选、富集、驯化，得到目标解磷微生物菌群备用；
(b)将培养好的目标解磷微生物菌群加入到海藻酸钠溶液中，得到解磷微生物菌群-海藻酸钠混合溶液；
(c)配制w/o型反向乳液；
(d)将解磷微生物菌群-海藻酸钠混合溶液加入到w/o型反向乳液中，再加入cacl2溶液和有机溶剂，经固液分离、洗涤、干燥，得到解磷微生物缓释海藻酸钠微球。
进一步的，步骤(a)中筛选方法如下：按照50-100g:1l的比例将磷矿矿区土壤或农田土壤与无菌水混合，搅拌均匀后取上层浑浊液，依次用纱布、滤纸过滤多次，所得滤液即为筛选好的初始菌液。从磷矿矿区或农田土壤取样主要是因为这些地方的样品中解磷微生物种类较多，容易筛选到适应性较好的解磷微生物。
进一步的，步骤(a)中富集方法如下：将体积比为15-30:1的富集培养基和筛选好的初始菌液置于培养器中，在28-30℃下恒温振荡培养3-5天，取第一次培养后的菌悬液按照同样的方法重复培养3-4次，得到富集好的解磷微生物菌群悬浮液。通过多次富集可以提高优势解磷菌的活性和菌群密度，确保所得菌群具有高效解磷能力。
进一步的，步骤(a)中驯化方法如下：将体积比为5-15:1的驯化培养基和富集好的解磷微生物菌群悬浮液置于培养器中，在28-30℃下恒温振荡培养3-5天，取第一次驯化培养后的菌悬液按照同样的方法重复驯化培养3-4次，在此过程中逐渐提高驯化培养基中低品位磷矿的含量，最终得到具有较好适应性的目标解磷微生物菌群。通过多次驯化提高所得菌群的适应能力，对后续缓释肥料的制备具有重要意义，实际使用过程中缓释的少量解磷微生物菌群只有具备较好的适应能力才能在土壤中定殖并发挥作用。
所述富集培养基按照重量份数计的配方为：葡萄糖10.0份，(nh4)2so40.1份，mgso4或其水合物0.25份，kcl0.2份，mgcl2或其水合物0.5份，ca3(po4)21份，蒸馏水1000份，ph＝7.0。驯化培养基在富集培养基的基础上阶梯式增加了1-5份低品位磷矿粉。
进一步的，步骤(a)中所得目标解磷微生物菌群为混悬液或者冷冻离心后的菌泥。
进一步的，步骤(b)中解磷微生物菌群-海藻酸钠混合溶液中海藻酸钠的质量分数为0.5％-3％，目标解磷微生物菌群与海藻酸钠的质量比为1:5-10。配制时可加热至50℃左右并机械搅拌促进海藻酸钠溶解，或者将溶液的ph调至碱性促进溶解，溶解完成后冷却至室温才可加入菌液或菌粉。
进一步的，步骤(c)中w/o型反向乳液的配制方法具体为：将液体石蜡加入到乳化剂中，磁力搅拌均匀即可。所述乳化剂选自吐温80、司盘80、蔗糖硬脂酸酯等非离子型乳化剂中的一种或几种。乳化剂和液体石蜡的体积比为1：10-50。
进一步的，步骤(d)中解磷微生物菌群-海藻酸钠混合溶液与w/o型反向乳液混合时的体积比为1:2-10，加入的cacl2溶液质量分数为01％-10％，其加入量为w/o型反向乳液体积的0.4-1.0倍。
进一步的，步骤(d)具体过程为：将微生物菌群-海藻酸钠混合溶液加入到w/o型反向乳液中，超声搅拌10-60min，再加入cacl2溶液并以100-400rpm的转速搅拌10-60min，静置10-40min后加入有机溶剂，接着以5000-8000g的离心力进行离心，分离得到下层微球，反复用有机溶液和无菌水洗涤3-6次，最后在-50℃至-30℃环境下冷冻干燥6-10h。
更进一步的，所述有机溶剂选自石油醚、丙酮、乙酸乙酯等低细菌毒性、易挥发或微溶于水的有机溶剂中的一种或几种。固液分离前加入有机溶剂能够稀释原本粘稠的反应液，使微球更易离心沉积下来。
本发明的乳液法又可称为反相乳液-内部凝胶法，在分散剂和乳化剂的作用下使海藻酸钠溶液形成一种w/o型反向乳液，ca2+加入乳液后从油相扩散穿过油水界面在海藻酸钠微滴表面固化，形成粒径较小的海藻酸钠微球。通过乳液法合成的微球在分散剂和乳化剂的作用下不会发生团聚，其形态及粒径分布情况较好，适合大批量生产。
本发明的有益效果为：(1)通过乳液法合成解磷微生物缓释海藻酸钠微球，实现了微生物菌种的保活和保释，可以大幅度提高生物肥料的肥效和有效时长，将肥料养分的速效性与缓释性相结合，有助于减少化学肥料的使用，改善土壤板结和水体富营养化等问题；(2)选用的包覆材料为海藻酸钠，具有良好的生物降解性和生物相容性，不会对土壤造成污染，乳化法得到的微球粒径较小，可以采用和普通微生物肥料相同或类似的方式加工包装；(3)普通微生物肥料直接施入土壤后，受土壤湿度、温度、孔隙度以及与当地微生物竞争等影响，使其很难在根部很好地定殖及扩大繁殖，存在有效期较短、难以大范围使用等问题，而本申请中通过对微生物进行富集、驯化培养以及微球包覆缓释处理，基本解决了这些问题，达到了延长有效期的目的。
具体实施方式
为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行进一步说明。
本发明富集菌种所使用的富集培养基成分(简称nbrip，以重量份数计)为：葡萄糖10.0份，(nh4)2so40.1份，mgso4·7h2o0.25份，kcl0.2份，mgcl2·6h2o0.5份，ca3(po4)21份，蒸馏水1000份，ph＝7.0。驯化培养基的配方与富集培养基基本相同，不同之处在于将ca3(po4)2替换为低品位磷矿粉，且其用量随着驯化次数的增加逐渐加大，从1份逐渐增加到5份。低品位磷矿使用前需磨细过筛，选择粒径在100-200目之间的矿粉备用。
实施例1
(1)筛选：取磷矿矿区土壤20g，与200ml的无菌水混合，机械搅拌30min后，将所得混合物依次用纱布、滤纸过滤，收集滤液作为供试菌液。
富集：将5ml供试菌液加入到40mlnbrip培养基中，在恒温振荡器(培养温度30℃，转速165rpm)中培养3d。取5ml第一次富集后的菌液按照上述方法重复富集3次，得到具有解磷效果的磷矿矿区微生物菌群。
驯化：取5ml对数期的上述磷矿矿区微生物菌群，将其加入到40ml驯化培养基中在30℃培养3d。取5ml第一次驯化后的菌液加入到驯化培养基中(逐渐提高低品位磷矿粉含量)，重复驯化3次，得到具有较好适应性的目标解磷微生物菌群，将其培养至对数期待用。
(2)将20ml质量分数为2％的海藻酸钠水溶液加入到5ml处于对数生长期的目标解磷微生物菌群菌悬液中，搅拌混合均匀，得到混合液a。
(3)将3ml吐温80加入到50ml液体石蜡中，接着以400rpm的转速搅拌约10min，得到稳定的w/o型反向乳液称为混合液b。
(4)将混合液a加入到混合液b中，超声搅拌20min使两相混合均匀。得到混合乳液c。
(5)接着向混合乳液c中加入50ml质量分数为2％的氯化钙溶液，常温搅拌30min，接着静置30min，再加入50ml石油醚搅拌均匀，最后在8000g下离心20min，弃去上层液体保留下层微球。
(6)向微球中加入50ml丙酮溶液，超声振荡10min后抽滤。微球用丙酮洗涤5次后再用无菌水反复洗涤多次，最后将微球置于-50℃环境中冷冻干燥8h，得到解磷微生物缓释海藻酸钠微球。
实施例2
(1)筛选：取农田土壤20g，与200ml的无菌水混合，机械搅拌30min后，将所得混合物依次利用纱布、滤纸过滤，收集滤液作为供试菌液。
富集：将5ml供试菌液加入到40mlnbrip培养基中，在恒温振荡器(培养温度25℃，转速160rpm)中培养3d。取5ml第一次富集后的菌液按照上述方法重复富集3次，得到具有解磷效果的土壤微生物菌群。
驯化：取5ml对数期的上述微生物菌液，将其加入到40ml驯化培养基中在25℃培养3d。取5ml第一次驯化后的菌液加入驯化培养基中(逐渐提高低品位磷矿浓度)，重复驯化4次，得到具有较好适应性的目标解磷微生物菌群。将其培养至对数期待用。
(2)将20ml质量分数为1.5％的海藻酸钠水溶液与5ml处于对数生长期的菌悬液混合均匀，得到混合液a。
(3)将3ml吐温80加入到50ml液体石蜡中，接着以400rpm的转速搅拌约10min，得到稳定的w/o型反向乳液称其混合液b。
(4)将混合液a加入到混合液b中，超声搅拌20min使两相混合均匀得到混合乳液c。
(5)向混合乳液c中加入50ml质量分数为2％的氯化钙溶液，常温搅拌30min，接着静置30min，再加入50ml乙酸乙酯搅拌均匀，最后在9000g下离心20min，弃去上层液体保留下层微球。
(6)向微球中加入50ml丙酮溶液，超声振荡10min后抽滤。微球用丙酮洗涤4次后再用无菌水反复洗涤多次，最后将微球置于-50℃环境中冷冻干燥8h，得到解磷微生物缓释海藻酸钠微球。
实施例3
(1)筛选：取磷矿矿区土壤20g与200ml的无菌水混合，机械搅拌30min后，将所得混合物依次利用纱布、滤纸过滤，收集滤液作为供试菌液。
富集：取5ml供试菌液，将其加入40mlnbrip培养基中，在恒温振荡器(培养温度30℃，转速165rpm)中培养3d。取5ml第一次富集所得菌液按照上述方案重复富集3次，得到具有解磷效果的磷矿矿区微生物菌群。
筛选：取5ml对数期的上述微生物菌液，将其加入到40ml驯化培养基中培养3d。取5ml第一次驯化后的菌液，将其加入到驯化培养基中(逐渐提高低品位磷矿浓度)，按照同样的方法重复驯化3次，得到具有较好适应性的目标解磷微生物菌群。
(2)取目标磷磷矿矿区微生物菌群(菌悬液)培养至对数期，在9000g下离心30min，收集离心管中沉淀的菌泥备用。
(3)将20ml质量分数为2％的海藻酸钠水溶液与2g菌泥混合均匀，得到混合液a。
(4)将1ml吐温80和0.5ml司盘80加入到50ml液体石蜡中，接着以400rpm的转速搅拌约20min，得到稳定的w/o型反向乳液称其为混合液b。
(5)将混合液a加入到混合液b中，超声搅拌25min使两相混合均匀，得到混合乳液c。
(6)向混合乳液c中加入50ml质量分数为3％的氯化钙溶液，常温搅拌30min，接着静置30min，再加入50ml乙酸乙酯搅拌均匀，最后在9000g下离心20min，弃去上层液体保留下层微球。
(7)向微球中加入50ml乙酸乙酯溶液，超声振荡10min后抽滤。微球用丙酮洗涤3次后再用无菌水反复洗涤多次，最后将微球置于-50℃环境中冷冻干燥8h，得到解磷微生物缓释海藻酸钠微球。