一种简易、低成本制备深海弹性蛋白酶Pseudoalterin的方法与流程

本发明涉及一种简易、低成本制备深海弹性蛋白酶pseudoalterin的方法，属于生物技术
技术领域：
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背景技术：
：海洋中含有地球上80％的生物，因此海洋生物资源总量巨大。研究表明海洋微生物因其独特的生活环境，分泌的蛋白酶可能具有特殊性质和潜在用途。目前，国内外对于海洋微生物分泌的弹性蛋白酶研究很少，总体开发利用程度低。细菌pseudoalteromonassp.cf6-2是从中国南海台湾岛西南面九龙甲烷礁区2441米深的海底沉积物中分离得到。研究表明，该菌株能够分泌一种m23家族弹性蛋白酶，pseudoalterin。该酶对弹性蛋白和肽聚糖都具有很高的降解活性。pseudoalterin作为弹性蛋白酶，在医学、食品学和日用化学上都有着广泛的应用潜力。在医药方面可作为治疗药物：(1)治疗高脂血症；(2)防治动脉粥样硬化；(3)抑制脂肪肝发展；(4)治疗慢性气管炎及其它结缔组织纤维增生性疾病；(5)外用于消除皮肤焦痂、碎屑，用于烧伤患者的治疗以及皮肤溃疡、口腔溃疡等症。在食品工业方面可用于对动物难以处理和食用的韧带、大动脉血管、筋腱等蛋白质废料进行加工。日用化学工业方面，该酶可用于疗效化妆品的生产。国外近年有报道将弹性蛋白酶加入化妆品，可增进、改善皮肤血液循环，并改善皮肤脂质代谢，增强皮肤、毛发的弹性、柔性，延缓皮肤老化，减少皱纹及色素沉着，还能促进头发生长，防止脱发等。pseudoalterin作为肽聚糖水解酶，该酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，具有溶菌作用，可用作天然的食品防腐剂，可广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐。另外因该酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理革兰氏阳性细菌可以得到原生质体，因此该酶可用作基因工程、细胞工程中细胞融合操作的工具酶。并且该酶对多种致病性革兰氏阳性细菌，特别是耐甲氧西林的多抗金葡菌具有很高的裂解活性，在治疗细菌感染等医疗方面以及化妆品等方面都具有很好的应用潜力。基于上述pseudoalterin的应用价值，研发一种pseudoalteromonassp.cf6-2分泌的弹性蛋白酶的简易且低成本制备技术将为该酶的商业开发，工业化生产及食品医学应用奠定基础。中国专利文献cn103320417a(申请号：cn201310228836.2)公开了一种深海弹性蛋白酶的低成本制备方法，该制备方法采用屠宰厂副产品牛心管代替弹性蛋白，进行细菌菌株cf6-2胞外弹性蛋白酶的产酶发酵，发酵成本降低70％以上，菌株cf6-2胞外酶活达到100.02±9.0u/ml，与之前的技术相比胞外酶活提高了1倍。然而牛心管虽然是屠宰厂的副产品，但仍可作为食品，例如烧烤行业常将其当做食材。大批量购买新鲜的牛心管需要到特定的地方进行购买，并且该制备方法中使用的是牛心管粉，需要将大量新鲜的牛心管外壁的脂肪去除干净，切成1平方厘米左右大小的块状，经真空冷冻干燥仪干燥48小时以上待块状牛心管完全脱水后用打磨机磨成粉状，过20目筛后得到发酵所用的牛心管粉，并且需要于-20℃保存。牛心管粉的制备过程繁琐，劳动强度大，费时费力，其繁琐高成本的处理方式限制了酶的开发应用。因此，有必要研发一种简易、低成本、高活性、高产量的深海细菌弹性蛋白酶pseudoalterin的制备方法。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，本发明提供一种简易、低成本制备深海弹性蛋白酶pseudoalterin的方法。发明概述：本发明在发酵培养基中添加甘氨酸，利用甘氨酸作诱导，进行细菌菌株cf6-2胞外弹性蛋白酶的产酶发酵，大大降低了生产成本。发明详述：本发明是通过如下技术方案实现的：一种简易、低成本制备深海弹性蛋白酶pseudoalterin的方法，包括：将深海细菌pseudoalteromonassp.cf6-2种子培养液接种于发酵培养基中，添加甘氨酸母液为诱导剂，进行发酵培养，得到的发酵液透析、离心、洗脱，得到深海细菌弹性蛋白酶。根据本发明优选的，深海细菌pseudoalteromonassp.cf6-2种子培养液是按如下方法培养得到：将深海细菌pseudoalteromonassp.cf6-2菌株接种于液体种子培养基中，在18-22℃条件下振荡培养10-14小时，得到种子培养液。根据本发明优选的，液体种子培养基组分如下，均为重量份：蛋白胨0.5-1.5份，酵母粉0.1-0.8份，人工海水80-120份，ph为7.5～8.0；根据本发明优选的，深海细菌pseudoalteromonassp.cf6-2菌株先在固体培养基上活化后再接种于液体种子培养基中。进一步优选的，活化温度为18-22℃，活化培养时间为2～3天，固体培养基组分如下，均为重量份：蛋白胨0.5-1.5份，酵母粉0.1-0.8份，琼脂1.0-2.0份，人工海水80-120份，ph为7.5～8.0。根据本发明优选的，深海细菌pseudoalteromonassp.cf6-2种子培养液的接种量为0.5-2.5％(v/v)。根据本发明优选的，发酵培养温度为18-22℃，转速为150-200rpm，时间为24～36h。根据本发明优选的，发酵培养基的组分如下，均为重量份：酵母粉0.1-0.3份，酪素0.4-0.6份，cacl20.001-0.008份，na2hpo40.010-0.020份，人工海水80-120份，ph为8.5，甘氨酸母液在发酵培养过程中分次添加。根据本发明优选的，甘氨酸母液的浓度为1mol/l，是由7.5g甘氨酸溶解于人工海水中，用10mol/l的氢氧化钠调节ph至8.5，加人工海水定容至100ml，过滤除菌得到。根据本发明优选的，所述的分次添加为分2-3次添加，当发酵培养0h、6h、12h时进行添加，每次添加量为2～8mmol/l。进一步优选的，分2次添加时，为发酵培养0h、12h时进行添加，每次添加量为6～8mmol/l；分3次添加时，为发酵培养0h、6h、12h时进行添加，每次添加量为6～8mmol/l。根据本发明优选的，发酵培养后得到的培养物进行离心获得具有弹性蛋白酶pseudoalterin的发酵液，离心条件为：4℃下，离心转速为10000-12000rpm，离心时间为8-12min。根据本发明优选的，所述的透析为将发酵液过夜透析至ph9.0的50mmol/ltris-hcl缓冲液中，所述离心为4℃下，离心转速为10000-12000rpm，离心时间为14-18min。根据本发明优选的，所述的洗脱为离心得到的上清液以2ml/min速度穿过deae-sepharosefastflow层析柱后用0.1～0.3mol/lnacl进行梯度洗脱，取第一个洗脱峰的洗脱液。根据本发明优选的，分离纯化所用的层析柱尺寸为55mm×10cm，纯化温度为4℃。本发明的深海细菌pseudoalteromonassp.cf6-2菌株分离自中国南海沉积物，2010年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:武汉大学生命科学院保藏中心，其菌种保藏编号为cctccm2010189。有益效果1、本发明用甘氨酸代替屠宰厂副产品牛心管，进行细菌菌株pseudoalteromonassp.cf6-2胞外弹性蛋白酶的产酶发酵，甘氨酸是一种商业化产品，来源广，价格低，常温储存即可，发酵成本大为降低；2、本发明用甘氨酸代替屠宰厂副产品牛心管，进行细菌菌株pseudoalteromonassp.cf6-2胞外弹性蛋白酶的产酶发酵，不仅降低了发酵成本，并且因其易获得易储存没有其他副产物的特点，节省人力物力和时间，具有很好的环境效益和社会效益；3、本发明采用优化的发酵条件，使菌株pseudoalteromonassp.cf6-2胞外酶活达到136.37±3.2u/ml，发酵酶活与牛心管发酵技术相当。附图说明图1为实验例1甘氨酸的加入时间与深海细菌胞外弹性蛋白酶酶活的关系图；图2为实验例1甘氨酸的加入次数与深海细菌胞外弹性蛋白酶酶活的关系图；图3为实验例1甘氨酸的加入量与深海细菌胞外弹性蛋白酶酶活的关系图。具体实施方式下面结合说明书附图，对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。深海细菌pseudoalteromonassp.cf6-2菌株购自中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为cctccm2010189。人工海水由购自青岛海之盐水族科技有限公司的海水素配制而成，配制方法参照该产品的产品说明书。人工海水的浓度为3.5％(w/v)，是由877g海水素溶解于蒸馏水中，并加蒸馏水定容至25l，室温保存。酪素购自sigma公司，酵母粉购自oxoid公司，cacl2和na2hpo4购自国药集团化学试剂有限公司，甘氨酸购自biofroxx公司。实施例1甘氨酸母液的制备：称取7.5g甘氨酸，溶解于人工海水中，用10mol/l的氢氧化钠将ph调节为8.5，加入人工海水定容至100ml；然后经膜孔径为0.22μm的滤器过滤除菌，置于室温备用。实施例2一种简易、低成本制备深海弹性蛋白酶pseudoalterin的方法，步骤如下：(1)将深海细菌pseudoalteromonassp.cf6-2菌株，在温度为20℃条件下，于固体培养基活化培养2～3天，然后接种于液体种子培养基，在20℃条件下振荡培养12小时，获得深海细菌pseudoalteromonassp.cf6-2种子培养液；固体培养基组分如下，均为重量份：蛋白胨1.0份，酵母粉0.5份，琼脂1.5份，人工海水100份，ph为7.5。121℃高温高压灭菌20min，置于室温备用。液体种子培养基组分如下，均为重量份：蛋白胨1.0份，酵母粉0.5份，人工海水100份，ph为7.5～8.0；(2)按1％的体积百分比将步骤(1)制得的种子培养液接种于发酵培养基，在温度为20℃，转速为180rpm条件下进行发酵培养，当发酵培养0h、12h时进行分两次添加甘氨酸母液，每次添加量为2～8mmol/l，发酵培养时间为24h～36h。所述发酵培养基组分如下，均为重量份：酵母粉0.2份，酪素0.5份，cacl20.005份，na2hpo40.015份，人工海水100份，ph为8.5。115℃高温高压灭菌30min，置于室温备用。(3)将步骤(2)制得的培养物在4℃10000g离心10min取上清，获得具有弹性蛋白酶pseudoalterin的发酵液。(4)将步骤(3)制得发酵液过夜透析至ph9.0的50mmol/ltris-hcl缓冲液中，后于4℃10000g离心15min，上清液以2ml/min速度穿过deae-sepharosefastflow层析柱后用0～0.3mol/lnacl进行梯度洗脱，层析柱尺寸为55mm×10cm，纯化温度为4℃，取第一个洗脱峰的洗脱液，制得深海细菌弹性蛋白酶。实验例1甘氨酸的加入对深海弹性蛋白酶胞外酶活的影响一、甘氨酸的加入时间对深海弹性蛋白酶胞外酶活的影响：控制其他变量，只改变甘氨酸的加入时间，分别在0h和6h时加入2mmol/l甘氨酸来研究不同时间点加入甘氨酸对pseudoalterin产量的影响，以不加甘氨酸的发酵培养基为阴性对照，结果如图1所示。从图1中可以看出不加入甘氨酸的发酵培养基基本没有弹性蛋白酶pseudoalterin的产生；发酵培养基中加入2mmol/l甘氨酸后，有明显的弹性蛋白酶pseudoalterin的产生，并且培养6h后再加入甘氨酸的产酶量比0h时加入甘氨酸的产酶量高。二、甘氨酸的加入次数对深海弹性蛋白酶胞外酶活的影响：控制其他变量，只改变甘氨酸的加入次数，分别在0h、6h和12h单个时间点上单次加入2mmol/l甘氨酸来研究甘氨酸的加入次数对pseudoalterin产量的影响；分别在0h和6h、0h和12h、6h和12h两个时间点上两次加入2mmol/l甘氨酸来研究甘氨酸的加入次数对pseudoalterin产量的影响；分别在0h、6h和12h三个时间点上三次加入2mmol/l甘氨酸来研究甘氨酸的加入次数对pseudoalterin产量的影响。以不加甘氨酸的发酵培养基为阴性对照，结果如图2所示。从图2中可以看出在多个时间点上加入2mmol/l甘氨酸时产酶量高于只在单个时间点上加入2mmol/l甘氨酸时产酶量。并且在0h、6h和12h三个时间点上三次加入2mmol/l甘氨酸时产酶量最高。三、甘氨酸的加入量对深海弹性蛋白酶胞外酶活的影响：控制其他变量，只改变甘氨酸的加入量，在0h、6h和12h三个时间点上三次分别加入2mmol/l、4mmol/l、6mmol/l和8mmol/l甘氨酸来研究甘氨酸的加入量对弹性蛋白酶pseudoalterin产量的影响。以不加甘氨酸的发酵培养基为阴性对照，结果如图3所示。从图3中可以看出在0h、6h和12h三个时间点上三次加入6mmol/l甘氨酸时产酶量最高。实验例2原料成本对比采用实施例2的方法进行生产深海弹性蛋白酶，同时与中国专利文献cn103320417a一种深海弹性蛋白酶的低成本制备方法进行对比，在产酶量相同的情况下，酶活及原料成本对比如下表1所示。表1酶活及原料成本对比项目酶活原料成本实施例2136.37±3.2u/ml1.1元/100份中国专利文献cn103320417a100.02±9.0u/ml1.4元/100份实施例3同实施例2所述的一种简易、低成本制备深海弹性蛋白酶pseudoalterin的方法，不同之处在于：步骤(3)当发酵培养0h、6h、12h时进行分三次添加甘氨酸母液，每次添加量为2～8mmol/l，发酵培养时间为24h～36h。当前第1页12