本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种蜚蠊内生放线菌的抗真菌活性筛选方法及其发酵方法。
背景技术：
近年来，由于免疫抑制剂、抗生素和激素的广泛使用，以及器官移植、恶性肿瘤、艾滋病患者的增加，导致临床真菌感染日渐增多。真菌感染已成为癌症、艾滋病等患者主要死亡原因之一，真菌感染的日趋严重使得抗真菌药物需求日趋增长，因此，加强抗真菌药物研发刻不容缓。放线菌是药物研发的重要资源，人们至今已发现多种放线菌代谢产物有抗真菌活性，有些已应用到临床，获得较好疗效。长期以来，放线菌药物研究重点多集中在土壤放线菌。但是，土壤放线菌资源研究日趋达到极限，从中分离的活性产物95％以上都是已知化合物，发现新药几率大大降低。因此，世界各国科研人员在新菌株的来源、新菌株的分离手段和新的筛选方法方面越来越重视。
中药材蜚蠊作为世界上生命力最强的昆虫类群之一，其体内分布着大量的内生微生物。蜚蠊特殊的生活环境使得其体内内生菌在种类和功能上具有丰富的多样性，是获得良好活性物质的内生菌资源。
龚水明等检测了蜚蠊肠道内生放线菌wa2-4和wa2-5的抗真菌活性，并对菌株进行初步分类学鉴定(龚水明等，两株蜚蠊肠道内生放线菌抗真菌活性初步研究和分类鉴定，《中国热带医学》，2017年第17卷第5期，第445-448页)。发现菌株wa2-4和wa2-5发酵液对白色念珠菌和红色毛癣菌的生长均有抑制作用；扫描电子显微镜结果显示菌株wa2-4和wa2-5发酵液破坏了白色念珠菌的细胞膜结构，使红色毛癣菌的菌丝断裂成碎片；初步分类学鉴定结果显示，这两种菌株分别为链霉菌属和戈登氏菌属，与其各自亲缘菌株的16srdna序列同源相似性分别为93.5％和92.3％，均低于98.2％。
目前对于蜚蠊内生菌的筛选、培养、活性物质测定等研究还不成熟，离实际应用还有很长一段距离。因此，为了推动蜚蠊内生放线菌作为抗真菌药物的研究，提供更多治疗真菌感染的新药，有必要对蜚蠊肠道内生的放线菌进行体外抗真菌活性筛选，优化优势菌株的发酵条件。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种蜚蠊内生放线菌的抗真菌活性筛选方法及其发酵方法，以筛选出具有抗真菌活性的菌株，优化优势菌株的发酵条件。
本发明提供了一种蜚蠊内生放线菌的抗真菌活性筛选方法，包括以下步骤：
a、将经过分离纯化的蜚蠊内生放线菌单菌落重新接种至培养基内，培养5-7天后，挑取5×5mm的菌块，接种于种子培养基中培养3天，然后制备菌悬液，振荡混匀，得一级种子液；
b、将步骤a所得一级种子液转入液体发酵培养基中，置于摇床上培养5天，摇瓶发酵后，离心，得发酵液上清液；
c、将经过高压灭菌的pda培养基冷却至45℃左右，加入适量新鲜制备的白色念珠菌混悬液，混匀后，采用双层倒板法均匀倒入平板上，冷却至室温；将牛津杯均匀放在平板上，加入步骤b所得的发酵液上清液，培养3-4天后，观察并测量抑菌圈直径；
进一步地，上述步骤c可由以下步骤代替：
将步骤b所得发酵液上清液接种至经过高压灭菌的pda固体培养基的边缘，培养3-4天，分别将红色毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉点接至固体培养基中央，恒温培养4-5天后，观察抗真菌情况。
本发明还提供了一种蜚蠊肠道内生放线菌的发酵方法，步骤如下：将菌株接种于发酵培养基中，恒温培养5～7天。
优选地，所述发酵培养基为isp2液体发酵培养基。
优选地，所述菌株的接种量为8％。
优选地，所述发酵培养基的初始ph为8.0。
优选地，所述发酵培养基的装液量为210ml/300ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明利用牛津杯法和菌株对峙培养法对蜚蠊肠道内生放线菌进行筛选，可筛选出对真菌有显著抑制作用的菌株；
(2)本发明采用的蜚蠊内生放线菌菌株的发酵方法，综合考虑了初始ph值、装液量、接种量等关键因素对菌株发酵液抗真菌活性物质产生的影响，为抗真菌活性物质的扩大生产提供了重要的参考。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1
一种蜚蠊内生放线菌的抗真菌活性筛选方法，包括以下步骤：
a、将经过分离纯化的159株蜚蠊内生放线菌单菌落重新接种至培养基内，培养6天后，挑取5×5mm的菌块，接种于种子培养基中培养3天，然后制备菌悬液，振荡混匀，得一级种子液；
b、将步骤a所得一级种子液转入液体发酵培养基中，置于摇床上培养5天，摇瓶发酵后，离心，得发酵液上清液；
c、将经过高压灭菌的pda培养基冷却至45℃左右，加入适量新鲜制备的白色念珠菌混悬液，混匀后，采用双层倒板法均匀倒入平板上，冷却至室温；将牛津杯均匀放在平板上，加入步骤b所得的发酵液上清液，培养3天后，观察并测量抑菌圈直径。
实施例2
一种蜚蠊内生放线菌的抗真菌活性筛选方法，包括以下步骤：
a、将经过分离纯化的159株蜚蠊内生放线菌单菌落重新接种至培养基内，培养6天后，挑取5×5mm的菌块，接种于种子培养基中培养3天，然后制备菌悬液，振荡混匀，得一级种子液；
b、将步骤a所得一级种子液转入液体发酵培养基中，置于摇床上培养5天，摇瓶发酵后，离心，得发酵液上清液；
c、将步骤b所得发酵液上清液接种至经过高压灭菌的pda固体培养基的边缘，培养3天，分别将红色毛癣菌、黑曲霉、烟曲霉点接至固体培养基中央，恒温培养4天后，观察抗真菌情况。
实施例3
一种蜚蠊肠道内生放线菌的发酵方法，步骤如下：将经过实施例1、2筛选出来的优势菌株接种于发酵培养基中，恒温培养6天。
其中，发酵培养基为isp2液体发酵培养基；菌株的接种量为8％；发酵培养基的初始ph为8.0；发酵培养基的装液量为210ml/300ml。
对比例1
一种蜚蠊肠道内生放线菌的发酵方法，步骤如下：将经过实施例1、2筛选出来的优势菌株接种于发酵培养基中，恒温培养6天。
其中，发酵培养基为高氏1号液体发酵培养基；菌株的接种量为8％；发酵培养基的初始ph为8.0；发酵培养基的装液量为210ml/300ml。
对比例2
一种蜚蠊肠道内生放线菌的发酵方法，步骤如下：将经过实施例1、2筛选出来的优势菌株接种于发酵培养基中，恒温培养6天。
其中，发酵培养基为isp1液体发酵培养基；菌株的接种量为8％；发酵培养基的初始ph为8.0；发酵培养基的装液量为210ml/300ml。
对比例3
一种蜚蠊肠道内生放线菌的发酵方法，步骤如下：将经过实施例1、2筛选出来的优势菌株接种于发酵培养基中，恒温培养6天。
其中，发酵培养基为isp2液体发酵培养基；菌株的接种量为12％；发酵培养基的初始ph为8.0；发酵培养基的装液量为210ml/300ml。
对比例4
一种蜚蠊肠道内生放线菌的发酵方法，步骤如下：将经过实施例1、2筛选出来的优势菌株接种于发酵培养基中，恒温培养6天。
其中，发酵培养基为isp2液体发酵培养基；菌株的接种量为8％；发酵培养基的初始ph为6.0；发酵培养基的装液量为210ml/300ml。
对比例5
一种蜚蠊肠道内生放线菌的发酵方法，步骤如下：将经过实施例1、2筛选出来的优势菌株接种于发酵培养基中，恒温培养6天。
其中，发酵培养基为isp2液体发酵培养基；菌株的接种量为8％；发酵培养基的初始ph为8.0；发酵培养基的装液量为120ml/300ml。
试验例1
采用放大镜观察实施例1、2所得的抑菌圈直径，结果表明：159株内生放线菌中有45株内生放线菌对4种真菌表现出不同程度的抑制作用，其中，对黑曲霉有抑制作用的内生放线菌有44株，其次抗烟曲霉的为24株，26株对红色毛癣菌有抑制作用，对白色念珠菌有抑制作用的内生放线菌最少，为18株。具抗真菌活性的45株内生放线菌中，10株内生放线菌对4种真菌均有拮抗作用，分别编号为wa-1-19，wa-2-4，wa-2-5，wa2-7，wa-4-31，wa-8-44，wa11-1-1，wa11-1-3，wa12-1-13，wa23-4-4，其中wa23-4-4对4种真菌的拮抗作用最为显著。
试验例2
使用放大镜观察实施例3及对比例1-5所得菌株进行体外抗真菌试验，观察其抑菌圈直径，结果如下：
上述结果表明，培养条件经优化后的发酵液上清的抑菌能力明显优于约是培养条件未优化前的。因此，培养基条件优化有利于菌株的生长和抗真菌活性物质的合成。