本发明涉及植物活性肽
技术领域：
，更具体地，涉及一种复合植物水解蛋白肽的制备方法。
背景技术：
：目前生物活性肽在化妆品中的应用较为广泛，但来源单一，动物来源的胶原蛋白肽几乎统治了整个生物活性肽护肤市场。但依据现行文献资料查阅及古方记载，植物来源的活性肽同样具有较好的护肤功效。大豆粕、花生粕、燕麦麸皮是豆油、花生油、面粉生产的副产品，分别含有40％-50％大豆蛋白、47％-55％花生蛋白、15％-30％燕麦蛋白，且有较平衡的氨基酸组成，成本低廉，来源广泛，具有很高的开发和利用价值。目前大豆粕、花生粕和燕麦麸皮主要用于饲料、食品方面，附加值低。技术实现要素：本发明根据现有技术中的不足，提供了一种复合植物水解蛋白肽的制备方法。本发明基于前期燕麦蛋白肽、大豆蛋白肽研究，发现其体外保湿和抗氧化效果良好。因此，本发明将对其进行深加工，致力于开发植物来源的生物活性肽，并从中酶解提取分离出具有保湿修复功效的活性肽应用到护肤品中，使其具备良好的保湿修复功效，从而增加其附加值。本发明提供的制备方法具有较高的得率；所得复合植物水解蛋白肽中的有效成分含量高、杂质少，具有较好的保湿和修复活性。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种复合植物水解蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：s1：将大豆粕、花生粕、燕麦麸皮烘干，粉碎，混合后真空挤压膨化，然后冷却，再次粉碎后过筛，得到膨化后的粉末；s2：将s1所得膨化后粉末提取复合植物蛋白，得到复合植物蛋白提取物；s3：利用蛋白酶对s2中提取得到的复合植物蛋白提取物进行水解，得到复合植物水解蛋白肽；s1中真空挤压膨化的工艺为：-0.04～0.10mpa、物料含水量12％～20％、温度150℃～200℃、螺杆转速130r/min～200r/min；大豆粕、花生粕和燕麦麸皮的混合质量百分含量分别为20％～40％、40％～80％、10％～30％；s2中，将膨化后粉末进行碱溶酸沉得到复合植物蛋白提取物，碱溶酸沉的工艺为：在ph为9.0～12.0、液料比为10:1～40:1、提取时间为30～90min、提取温度为30℃～70℃条件下进行碱溶，然后在ph为3.0～6.0的条件下进行酸沉；s3中，所述蛋白酶为胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或多种。优选地，s3中，水解条件为酶用量为2～7％，水解温度为30℃～70℃，水解时间为20min～60min，ph为9.0～12.0。优选地，大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合质量百分比例为20％、50％、30％，真空度为-0.06,mpa、物料含水量为18％、温度为180℃、螺杆转速为180r/min。优选地，s2中ph为11.0、液料比为20:1、提取时间为60min、提取温度为50℃条件下进行碱溶，然后在ph为4.5的条件下进行酸沉。优选地，水解条件为酶用量4％，水解温度为50℃，水解时间为50min，ph为9.0。优选地，蛋白酶为碱性蛋白酶。本发明同时保护所述的制备方法制备得到的复合植物水解蛋白肽。进一步地，是保护所述的复合植物水解蛋白肽在化妆品中的应用。进一步地，所述复合植物水解蛋白肽按照1～3％的质量百分比添加到化妆品中。进一步地，所述复合植物水解蛋白肽用于提升化妆品的保湿和修复功效。为最大程度的提取大豆粕、花生粕和燕麦麸皮中的植物蛋白，本发明选用真空挤压膨化技术来处理大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合粉末，发明人发现大豆粕、花生粕、燕麦麸皮粉混合比例以及真空挤压膨化技术中真空度、物料含水量、温度、螺杆转速对蛋白提取率的影响较大，当大豆粕、花生粕和燕麦麸皮粉混合比例为1:2:2～2:2:3，真空挤压膨化的工艺条件为真空度-0.04～0.10mpa、物料含水量12％～20％、温度150℃～200℃、螺杆转速130r/min～200r/min时，真空挤压膨化处理后的大豆粕、花生粕和燕麦麸皮复合植物蛋白具有较高的提取率。在本发明中，大豆粕、花生粕和燕麦麸皮粉混合比例存在恰当的配比，否则会使得挤压膨化效果变差，从而直接影响蛋白的提取率；另外，真空度过低会使大豆粕、花生粕、燕麦麸皮混合粉在仪器中膨化真空度不够，膨化无法完成。而真空度过高则对仪器要求高，能耗大并会缩短仪器的使用寿命；物料含水量低会使豆粕、花生粕、燕麦麸皮混合粉膨化后样品硬，不易粉碎。物料含水量高，水分的润滑作用增强，混合粉在机筒内受到的剪切、摩擦作用减弱，导致蛋白提取率下降；膨化温度过低样品膨化度不够；挤压过程中温度过高会引起多糖分解成小分子糖类，同时与蛋白质发生美拉德反应，影响总蛋白提取率；螺杆旋转产生的剪切作用对混合粉中的蛋白结构进行机械破裂，破坏了蛋白质分子间的二硫键及疏水的表面氨基酸残基，使原来被包裹住易被酶解的位点暴露出来，使蛋白质对酶作用的敏感性显著提高，利于酶对蛋白的水解作用，当螺杆转速过高时，混合粉在机腔内的停留时间变短，进而使易被酶解的位点暴露减少。本发明的发明人还尝利用不同的酶来水解复合蛋白以得到保湿和修复功效较好的复合植物水解蛋白肽。经过众多尝试之后发明人发现，当选用碱性蛋白酶水解可以得到保湿和修复功效最好的蛋白肽。采用碱性蛋白酶水解得到的复合植物活性肽的经体外吸湿保湿实验验证其24h保湿率为6.68％以上，吸湿率为32.56％以上；复合植物水解活性肽对小鼠成纤维细胞增殖和迁移作用的影响体发现，其具有良好的修复作用。与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：(1)大豆粕、花生粕和燕麦麸皮主要用于饲料、食品方面，附加值低，本发明将对其进行深加工，从中酶解提取分离出具有保湿修复功效的活性肽应用到护肤品中，以增加其附加值；(2)本发明采用真空膨化技术对大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合粉进行预处理，可有效提高其蛋白提取率；(3)本发明制备出了具有良好护肤效果的复合植物活性肽，打破了仅动物蛋白肽在护肤品中应用的局面，得到了制备工艺简单，制备成本低的植物来源的活性肽。具体实施方式以下结合具体实施例进一步说明本发明，给出了部分详细的实施方式和具体的操作过程。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。实施例1：(1)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮在60℃烘干，粉碎。大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合质量百分比例为40％、50％、10％，在真空度-0.04,mpa、物料含水量15％、温度160℃、螺杆转速140r/min条件下挤压膨化，得到大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品；(2)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品粉碎，称取5.00g混合粉，在ph11.0、液料比20:1(ml/mg)、提取时间60min、提取温度50℃条件下提取后经ph4.5条件下酸沉，得到复合植物蛋白提取物；(3)利用胃蛋白酶对复合植物蛋白进行水解，水解条件为酶用量4％，水解温度45℃，水解时间45min，ph9.0，冷冻干燥得到复合植物蛋白水解肽粉，测定水解肽保湿和修复活性。实施例2(1)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮在60℃烘干，粉碎。大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合质量百分比例为20％、50％、30％，在真空度-0.06,mpa、物料含水量18％、温度180℃、螺杆转速180r/min条件下挤压膨化，得到大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品；(2)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品粉碎，称取5.00g混合粉，在ph11.0、液料比20:1(ml/mg)、提取时间60min、提取温度50℃条件下提取后经ph4.5条件下酸沉，得到复合植物蛋白提取物；(3)利用碱性蛋白酶对复合植物蛋白进行水解，水解条件为酶用量4％，水解温度50℃，水解时间50min，ph9.0，冷冻干燥得到复合植物蛋白水解肽粉，测定水解肽保湿和修复活性。实施例3(1)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮在60℃烘干，粉碎。大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合质量百分比例为30％、40％、30％，在真空度-0.06,mpa、物料含水量15％、温度180℃、螺杆转速190r/min条件下挤压膨化，得到大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品；(2)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品粉碎，称取5.00g混合粉，在ph11.0、液料比20:1(ml/mg)、提取时间60min、提取温度50℃条件下提取后经ph4.5条件下酸沉，得到复合植物蛋白提取物；(3)利用木瓜蛋白酶对复合植物蛋白进行水解，水解条件为酶用量5％，水解温度40℃，水解时间40min，ph10.0，冷冻干燥得到复合植物蛋白水解肽粉，测定水解肽保湿和修复活性。实施例4(1)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮在60℃烘干，粉碎。大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合质量百分比例为40％、40％、20％在真空度-0.08,mpa、物料含水量18％、温度180℃、螺杆转速160r/min条件下挤压膨化，得到大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品；(2)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品粉碎，称取5.00g混合粉，在ph11.0、液料比20:1(ml/mg)、提取时间60min、提取温度50℃条件下提取后经ph4.5条件下酸沉，得到复合植物蛋白提取物；(3)利用中性蛋白酶对复合植物蛋白进行水解，水解条件为酶用量4.5％，水解温度50℃，水解时间50min，ph9.0，冷冻干燥得到复合植物蛋白水解肽粉，测定水解肽保湿和修复活性。实施例5(1)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮在60℃烘干，粉碎。大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合质量百分比例为20％、50％、30％，在真空度-0.06,mpa、物料含水量18％、温度180℃、螺杆转速180r/min条件下挤压膨化，得到大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品；(2)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品粉碎，称取5.00g混合粉，在ph11.0、液料比20:1(ml/mg)、提取时间60min、提取温度50℃条件下提取后经ph4.5条件下酸沉，得到复合植物蛋白提取物；(3)利用胰蛋白酶对复合植物蛋白进行水解，水解条件为酶用量4％，水解温度50℃，水解时间50min，ph9.0，冷冻干燥得到复合植物蛋白水解肽粉，测定水解肽保湿和修复活性。实施例6(1)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮在60℃烘干，粉碎。大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合质量百分比例为20％、50％、30％，在真空度-0.06,mpa、物料含水量18％、温度180℃、螺杆转速180r/min条件下挤压膨化，得到大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品；(2)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品粉碎，称取5.00g混合粉，在ph11.0、液料比20:1(ml/mg)、提取时间60min、提取温度50℃条件下提取后经ph4.5条件下酸沉，得到复合植物蛋白提取物；(3)利用中性蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶复合酶对复合植物蛋白进行水解，水解条件为酶用量4％，水解温度50℃，水解时间50min，ph9.0，冷冻干燥得到复合植物蛋白水解肽粉，测定水解肽保湿和修复活性。对照例1本对照例中除了步骤(1)中直接大豆粕、花生粕和燕麦麸皮烘干之后即真空挤压膨化之外，其它工艺与实施例2相同。(1)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮在60℃烘干，粉碎。大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合质量百分比例为20％、50％、30％进行混合，得到混合粉；(2)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合粉，称取5.00g混合粉，在ph11.0、液料比20:1(ml/mg)、提取时间60min、提取温度50℃条件下提取后经ph4.5条件下酸沉，得到复合植物蛋白提取物；(3)利用胃蛋白酶对复合植物蛋白进行水解，水解条件为酶用量4％，水解温度45℃，水解时间45min，ph9.0，冷冻干燥得到复合植物蛋白水解肽粉，测定水解肽保湿和修复活性。对照例2本对照例中除了步骤(1)中大豆粕、花生粕和燕麦麸皮比例和真空度不同之外，其它工艺与实施例2相同。(1)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮在60℃烘干，粉碎。大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合质量百分比例为10％、20％、70％，在真空度-0.01mpa、物料含水量15％、温度160℃、螺杆转速140r/min条件下挤压膨化，得到大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品；(2)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品粉碎，称取5.00g混合粉，在ph11.0、液料比20:1(ml/mg)、提取时间60min、提取温度50℃条件下提取后经ph4.5条件下酸沉，得到复合植物蛋白提取物；(3)利用木瓜蛋白酶对复合植物蛋白进行水解，水解条件为酶用量4％，水解温度45℃，水解时间45min，ph9.0，冷冻干燥得到复合植物蛋白水解肽粉，测定水解保湿和修复活性。对照例3本对照例中除了步骤(1)中大豆粕、花生粕和燕麦麸皮比例和真空度不同之外，其它工艺与实施例2相同。(1)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮在60℃烘干，粉碎。大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合质量百分比例为50％、10％、40％，在真空度-0.11，mpa、物料含水量15％、温度160℃、螺杆转速140r/min条件下挤压膨化，得到大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品；(2)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品粉碎，称取5.00g混合粉，在ph11.0、液料比20:1(ml/mg)、提取时间60min、提取温度50℃条件下提取后经ph4.5条件下酸沉，得到复合植物蛋白提取物；(3)利用碱性蛋白酶对复合植物蛋白进行水解，水解条件为酶用量4％，水解温度45℃，水解时间45min，ph9.0，冷冻干燥得到复合植物蛋白水解肽粉，测定水解肽保湿和修复活性。对照例4本对照例中除了步骤(1)中的物料含水量和螺杆转速与实施例1不同之外，其它工艺与实施例1相同。(1)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮在60℃烘干，粉碎。大豆粕、花生粕和燕麦麸皮混合质量百分比例为10％、10％、80％，在真空度-0.04,mpa、物料含水量10％、温度160℃、螺杆转速220r/min条件下挤压膨化，得到大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品；(2)将大豆粕、花生粕和燕麦麸皮膨化样品粉碎，称取5.00g混合粉，在ph11.0、液料比20:1(ml/mg)、提取时间60min、提取温度50℃条件下提取后经ph4.5条件下酸沉，得到复合植物蛋白提取物；(3)利用碱性蛋白酶对复合植物蛋白进行水解，水解条件为酶用量4％，水解温度45℃，水解时间45min，ph9.0，冷冻干燥得到复合植物蛋白水解肽粉，测定水解肽保湿和修复活性。实施例1～6及对照例1～4的步骤(2)中复合植物蛋白提取率，步骤(3)中水解肽保湿和修复活性测试结果见下表1。(1)提取率提取率是指步骤(2)中得到复合植物蛋白提取率为酸沉后蛋白复溶，测定其总蛋白含量，其总蛋白含量与5.00g混合粉的比值即为复合植物蛋白提物率。(2)总蛋白含量采用凯氏定氮法(gb5009.5-85)测定复溶物中总蛋白浓度为c。提取物中总蛋白含量＝(c×v1)/m1×100其中c为测量后样品浓度，v1为复溶后样品体积，m1为称取的5.00g的混合粉。(3)保湿活性①吸湿性测定将样品置于烘箱中，在105℃下烘干3h，然后再放入硅胶干燥器中冷却至室温。准确称取1.0g，分别置于用饱和硫酸铵水溶液维持相对湿度(rh)为81％。饱和氯化钙水溶液维持rh为32％的干燥器内吸湿，24h、72h后称各试样的质量。测试条件为：25℃，相对湿度32％；吸湿率(ra)＝(wn-w0)/w0×100％w0为放置前样品质量，wn为放置后的样品质量。②保湿性测定在干燥恒重后的样品中加入质量分数为10％的水，然后将其置于rh为81％、32％及硅胶干燥器内。24h、72h后称各试样的质量。测试条件为：25℃，相对湿度81％。保湿率(rr)＝hn/h0×100％h0为放置前水分质量，hn为放置后水分质量。(4)修复活性①对nih/3t3细胞增殖影响用将步骤(3)得到的复合植物水解蛋白肽配制成5mg/ml的贮存液。每次点板前将贮存液用无血清的培养基稀释成6个终浓度(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml，现配现用。选取对数期生长的nih/3t3细胞，消化及离心、计数后，用含10％胎牛血清的dmem培养基稀释成3*104个ml-1的浓度，用排枪接种在96孔板上，每孔100ul。在5％co237℃恒温培养箱中培养4-5h(保证细胞已贴壁)，吸出96孔板内的培养基，用pbs洗两遍后加入含不同浓度样品的培养液。每一种药物6个复孔，继续培养48h后釆用亚甲基蓝法测定对照和不同处理浓度的吸光值。在培养48h后，吸出96孔板内的培养基，用pbs洗两遍后换入50ul亚甲基蓝染液，继续置于5％co237℃°恒温培养箱中继续培养60min。吸弃亚甲基蓝染液，用蒸馏水轻轻洗六遍，并且要保证每孔洗的次数一样。控干孔板中的蒸馏水(或自然干燥数分钟)后，每孔加入100ul亚甲基蓝洗液，室温下放置于振摇板上振摇，致蓝色结晶全部溶解。使用酶联免疫检测仪检测每孔在570nm处的吸光值(od值)。增殖率按照下面公式计算：②对nih/3t3细胞迁移的影响以不同时刻进入划痕内的细胞数为指标，选出的促进细胞增殖率最高对应浓度条件下对细胞迁移的影响。将nih/3t3细胞以4*105个ml-1的浓度接种在24孔培养板内，每孔500ul，加入含10％fbs的dmem培养基，在5％co237℃°恒温培养箱中培养过夜，形成单层细胞。待细胞覆盖率达80％后，用10ul枪头比着直尺(已灭菌)，尽量垂直，在单细胞层纵向划痕，制造培养细胞的伤口模型。划痕后吸去培养液，用pbs小心清洗三次去除划下的细胞，注意贴壁缓慢加入pbs，以免冲散单层贴壁细胞影响试验拍照结果。清洗后随机分为对照组、空白组和样品组来加样，每组8个复孔。此时在倒置荧光显微镜(*100)下拍摄照片作为0h。放入5％co237℃恒温培养箱中培养，伤口形成后6h、12h及24h拍摄照片，采用image-proplusversion6.0(ipp)图像分析软件计算不同时刻进入划痕内的细胞数。表1实施例1～6及对照例1～4中得到的复合植物蛋白及复合植物蛋白水解肽的性能测试应用试验例一本应用试验例给出了两种配方(wt％)的乳液：配方1：沙棘果油10.0g，角鲨烷3.0g，甘油5.0g，丙三醇4.0g，聚山梨醇酯-802.0g，实施例2提取得到的复合植物活性肽2.0g，卡波9400.1g，三乙醇胺0.1g，加水至100g；配方2：沙棘果油10.0g，角鲨烷3.0g，甘油5.0g，丙三醇4.0g，聚山梨醇酯-802.0g，卡波9400.1g，三乙醇胺0.1g，加水至100g。选用30名志愿受试者在其双手手臂内侧选取4块2*2大小的区域，每块区域均涂抹0.2g配方1或配方2样品，左手各涂一块配方1和配方2样品，右手同理。在使用4h、8h、12h、24h后，利用经皮水分流失仪测定涂抹区域水分含量。测试结果如表2。表示2应用实施例1所得复合植物活性肽保湿试验4h水分含量％8h水分含量％12h水分含量％24h水分含量％配方125.5635.1235.6334.58配方220.1224.5620.1419.23应用实施例二选用30名志愿受试者各使用2个月后，同时以配方2作为对照，对配方1使用效果进行修复效果打分评价；满分为十分，8分以上为优，6～8分为良好，3～6分为一般，3分以下为无效果，评价结果如下表3。表3实施例2所得复合植物活性肽的修复效果评价效果指标配方1评价人数配方1占比(％)配方2平均人数配方2占比(％)优620.0026.67良好1860.001343.13一般413.331033.33无效果26.67516.67由上可得，从大豆粕、花生粕和燕麦麸皮中提取的复合生物活性肽具有良好的保湿和修复功效，在化妆品领域有良好的应用前景。当前第1页12