一种重组基因VIII型新城疫病毒弱毒株的制作方法

本发明涉及兽医病毒分子生物学技术和免疫学技术领域，利用反向遗传操作平台对筛选获得的基因ⅷ型毒株在f基因突变的基础上再进行hn基因片段的替换，获得了一株重组的基因viii型新城疫病毒弱毒株。

背景技术：

新城疫病毒(newcastlediseasevirus，ndv)对世界家禽养殖业危害巨大，它可以感染多种禽类，常导致养禽业产生巨大的经济损失[alexander,d.j.2001.gordonmemoriallecture.newcastledisease.brpoultsci42:5-22.]。该病毒在分类学上属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属(avulavirus)的成员[mayo,m.a.2002.virustaxonomy-houston2002.archvirol147:1071-1076.]。新城疫病毒有囊膜，基因组为单股、负链、不分节段的rna病毒，基因组结构模式为：3′-np-p-m-f-hn-l-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(np)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)、融合蛋白(f)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(hn)和大分子蛋白(l)即核蛋白(np)，p，m，f，hn和l蛋白。根据对鸡的毒力，ndv毒株可以为强毒(velogenic)、中等毒力(mesogenic)和弱毒(lentogen)三种类型。已有大量的研究已经阐明了病毒致病性的分子决定因素[huangz,krishnamurthys,pandaa,samalsk.newcastlediseasevirusvproteinisassociatedwithviralpathogenesisandfunctionsasanalphainterferonantagonist.journalofvirology2003aug；77(16):8676-85.]，其中大部分是关于f和hn蛋白对病毒毒力的作用，特别是f蛋白裂解位点处的氨基酸序列是病毒毒力的主要决定因素[sealbs.nucleotideandpredictedaminoacidsequenceanalysisofthefusionproteinandhemagglutinin-neuraminidaseproteingenesamongnewcastlediseasevirusisolates.phylogeneticrelationshipsamongtheparamyxovirinaebasedonattachmentglycoproteinsequences.functintegrgenomics2004oct；4(4):246-57.]。ndv毒力差异的分子基础主要决定于f0蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列，强毒的裂解位点两端有成对的碱性氨基酸序列，其模式基序为¹¹²r/k-r-q-k/r-r-f¹¹⁷；弱毒的裂解位点则缺少聚碱性氨基酸序列，其模式基序为¹¹²-e/g-r/k-q-e/g-r-l¹¹⁷。hn蛋白也是ndv毒力的重要决定因素。已有的研究证明，hn蛋白氨基酸序列的长短与毒力有关，利用反向遗传操作技术，roemer-oberdoerfer等已证实hn蛋白的不同长度与ndv的毒力和致病性有着非常重要的关系(roemer-oberdoerfera,wernero,veitsj,etal.contributionofthelengthofthehnproteinandthesequenceofthefproteincleavagesitetonewcastlediseaseviruspathogenicity.jgenvirol.2003,84(11):3121-3129.)。hn基因编码区的长度有多种类型，所编码的hn蛋白长度有616、585、581、580、578、577、572、571个氨基酸等多种。含有616个氨基酸的hn前体蛋白只存在于无毒力的毒株中，如d26、ulster和queensland等毒株，在强毒株中未发现，而含有571个氨基酸的hn蛋白只存在于强毒株中，其它长度的hn蛋白在强弱毒株中均存在。

自新城疫(nd)1926年被发现以来，至今已发生了多次大的流行，而每一次流行都有不同基因型的毒株出现。90年代之后出现了新城疫的第4次大流行，给我国及世界养禽业造成了巨大的经济损失，这次大流行的新城疫病毒以基因vii型为主，但v、vi和viii等其他基因型病毒也有存在。近年来有专家提出，在亚洲和中东地区多个国家新出现的基因viih和viii以及viiia和viiib亚型新城疫病毒可能会导致全球第5次新城疫大流行(millerpj，haddasr，simanovl，etal.identificationofnewsub-genotypesofvirulentnewcastlediseaseviruswithpotentialpanzooticfeatures.infectgenetevol.2015，29：216-29.)。在控制疫病的过程中，使用疫苗是最有效最经济的方法，新城疫的疫苗已使用了几十年，由于nd疫苗的广泛使用，此病已基本上得到了有效的控制，但临床上非典型nd的发生仍然比较普遍，nd依然是威胁养禽业的主要疾病之一，免疫失败的原因除免疫程序不合理、免疫抑制病的存在之外，疫苗毒株与流行毒株的基因型和抗原性不匹配可能是主要原因之一，这说明常规疫苗对于ndv强毒的攻击并不能提供理想的保护。从我国近年来nd流行特点来看，临床上所分离到的ndv毒株大多数属于基因vii型[liu,x.f.,h.q.wan,x.x.ni,y.t.wu,andw.b.liu.pathotypicalandgenotypicalcharacterizationofstrainofnewcastlediseaseisolatedfromoutbreaksinchickenandgooseflocksinsomeregionsofchinaduring1985-2001.archivesofvirology,2003,148(7):1387-1403.]，而常规的nd疫苗株的基因型主要为i和ii型(如v4、lasota等)，在遗传距离上常规nd疫苗株与ndv流行株相差较远，这使强毒感染时家禽在早期出现大量排毒现象，导致非典型nd的发生。目前，基因viii型毒株在非洲、南亚和东南亚等许多国家和地区仍有流行，我国80年以来也有分离发现，而使用的疫苗从已有的报道看仍是基因i、ii弱毒株，并没有与viii型相匹配的疫苗毒株，因此创制ndv基因viii型弱毒疫苗株具有重要经济价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于发明一种低毒力的基因ⅷ型新城疫病毒弱毒株，为未来提供一种基因viii型弱毒活疫苗，也即提供一种与流行ndv基因viii型相匹配的疫苗候选株。

本发明提供的重组基因ⅷ型新城疫病毒弱毒株，是新城疫病毒ndv-rhr09-lasota-hn，它的保藏号为cctccno：v201830。

本发明还公开了所述重组基因ⅷ型新城疫病毒弱毒株ndv-rhr09-lasota-hn的全基因组序列，如seqidno.1所示。

本发明中的弱毒疫苗候选株ndv-rhr09-lasota-hn是从耐热强毒株ndv/hr09经过反向遗传操作系统对病毒f基因进行突变改造，在获得致弱的ndv/rahr09株的基础上，进一步将疫苗株lasota的hn基因全长片段替换ndv/rahr09相应片段而获得。ndv/hr09株是发明人所在实验室从送检病料中分离鉴定而获得。该毒株经f基因片段构建的系统进化树证明属于基因ⅷ型。本发明首先建立了hr09株的反向遗传操作系统，对病毒f基因裂解位点碱基序列进行突变，使病毒f基因相应编码的氨基酸由¹¹²r-r-q-k¹¹⁵-r-f¹¹⁷突变为具有典型弱毒株特征的氨基酸序列¹¹²g-r-q-g¹¹⁵-r-l¹¹⁷，拯救获得弱毒的ndb/rahr09株，该毒株的mdt值>120h，icpi值为0.057。为了使病毒的毒力进一步减弱，引入lasota株的hn基因，构建获得了保留ndv基因viii型f基因抗原特性、具有lasota株hn基因的重组病毒ndv-rhr09-lasota-hn。该毒株mdt>120h，icpi值为0.026，免疫保护试验，每组12只1日龄spf鸡肌肉注射接种10⁶eid50剂量，3周后以10⁵eid50剂量的基因vii型zj1毒株进行点眼、滴鼻攻毒，结果表明，免疫鸡抗体hi效价以本毒株组最高，3周龄时平均达到6.35±0.6，显著高于lasota株，攻毒保护率为100％。

本发明ndv-rhr09-lasota-hn的构建方法如下：

(1)基因ⅷ型hr09株反向遗传操作系统构建与弱毒株的拯救

构建hr09株基因组cdna的全长克隆以及含有该毒株np、p和l基因的3个真核表达载体，经共转染bsr-t7/5细胞，拯救获得感染性克隆，验证反向遗传平台构建成功。设计两对引物，经overlappcr的方法将hr09株f蛋白裂解位点第112、115和117位的碱性氨基酸突变成与弱毒株相关的非碱性氨基酸，构建全长cdna转录载体prndv/hr09，将转录载体prndv/hr09与3个辅助表达质粒共转染bsr-t7/5细胞，拯救出病毒ndv/rahr09。病毒生物学特性鉴定结果为mdt值>120h，icpi值为0.057，表明拯救的ndv/rahr09已致弱。

(2)替换lasota株hn基因重组病毒ndv-rhr09-lasota-hn拯救

利用rt-pcr扩增获得lasota株hn基因orf序列，在上述已经建立的反向遗传操作平台基础上，利用overlappcr和酶切联接等方法，将lasota株hn基因orf序列替换掉hr09株基因组中相应的片段，构建重组病毒基因组全长cdna克隆，再与已经构建好的3个辅助质粒共转染bsr-t7/5细胞，拯救获得重组病毒。

(3)重组ndv-rhr09-lasota-hn弱毒株毒力鉴定与免疫保护试验

将拯救获得的重组弱毒株在鸡胚生长传代，待病毒在鸡胚生长稳定后进行生物特性鉴定，测定病毒的mdt、icpi值，确定病毒的毒力强弱。

将本发明毒株与传统疫苗毒株lasota株进行免疫比较试验。试验包括空白对照组共3组，每组12只spf鸡，1日龄进行10⁶eid50剂量免疫肌注接种，每周分别测定各组鸡的hi抗体效价，免疫3周后以流行的基因vii型zj1毒株按10⁵eid50剂量进行攻毒，最后统计攻毒后各组鸡的病死率，结果证明本发明毒株抗体产生比对照组水平高，并具有完全的免疫保护(保护率100％)。

本发明获得的ndv-rhr09-lasota-hn弱毒株，保留了ndv基因ⅷ型ndv/hr09毒株f蛋白的抗原性，经替换弱毒株lasota株hn基因orf后，重组病毒的毒力比单独f基因突变致弱获得的毒株毒力还要弱，同时也具有较好的免疫原性，免疫鸡对流行强毒株的攻击获得100％保护，抗体产生的水平高。

附图说明

图1是hr09株全基因组cdna转录载体的构建示意图。

图2是rt-pcr分段扩增的全基因组6个片段电泳图。m：200bp；1-6分别为v1，r1，r2，r3，l1，v2片段。

图3是ndv/hr09株全基因组cdna转录载体酶切鉴定结果图。m:dl150001.质粒pndv/hr09；2、3经hpai酶切后的pndv/hr09。

图4是辅助质粒共转染后gfp表达效果图。

图5是病毒感染性克隆pcr鉴定结果图。m:200bpmarker1、2:引物9扩增片段

图6是r2和r3片段构建示意图。

图7是重组病毒全长质粒构建模式图。

本发明的ndv-rhr09-lasota-hn株于2018年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉大学；分类命名为：新城疫病毒ndv-rhr09-lasota-hn；保藏编号为cctccno:v201830。

本发明中涉及的ndv/rahr09株于2017年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉大学；分类命名为：新城疫病毒基因ⅷ型ndv/rahr09；保藏编号为cctccno:v201739。

具体实施方式

本发明所涉及的生物材料：

lasota株购自中国兽医药品监察所(cvccno:av615)。

zj1株(liuxf,wanhq,nixx,etal.pathotypicalandgenotypicalcharacterizationofstrainofnewcastlediseasevirusisolatedfromoutbreaksinchickenandgooseflocksinsomeregionsofchinaduring1985-2001.archvirol,2003,148(7):1387-1403.)。

ndv/hr09株(caoy,liuq,zhangx,huh,wuy.2017.completegenomesequenceofheatresistantnewcastlediseasevirusstrainhr09.genomeannounc5:e01149-17.)。genbank登录号：mf285077。

一、基因ⅷ型ndv/hr09株反向遗传操作系统的建立

试验涉及的主要试验材料与方法如下：

细胞及鸡胚：能稳定表达t7rna聚合酶的bsr-t7/5细胞和微基因组tvt-lgt由中国农业科学院上海兽医研究所惠赠，tvt7r(0.0)转录载体由本实验室保存，spf鸡胚由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。

实验试剂：细胞培养基dmem购自上海源培生物科技有限公司，新生胎牛血清购自gimini公司，easytaqdna聚合酶、peasytm-blunt克隆载体、pcr2.1克隆载体、trans-t1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；trizolreagent、m-mlv反转录体系、高保真dna聚合酶、dntp购自北京全式金生物技术有限公司，dna凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司，dnamarker购自宝生物工程(大连)有限公司，q5、限制性内切酶(apaⅰ、bsmbⅰ、mluⅰ、bbsⅰ、speⅰ、notⅰ、xbaⅰ)等购自neb公司，t4dnaligase、限制性内切酶fspaⅰ购自thermofisher公司。endofreeplasmidmidikit购于北京康为世纪生物科技有限公司。其它普通生化试剂均为国产分析纯试剂。

引物设计与合成：根据ndv/hr09的全基因序列(genbank登录号：mf285077)，运用primerpremier5.0软件设计6对引物对其全基因进行分段扩增，构建示意图见图1。将基因组13048位碱基作为拯救病毒的分子标记。引物序列见表1，辅助质粒构建引物见表2，引物均由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。

表1.ndv/hr09株全长cdna分段扩增引物

表2.构建ndv/hr09辅助质粒所用引物

1.hr09株全基因组cdna各片段的克隆与测序

按照文献的方法提取病毒rna并进行反转录。以获得的cdna为模板，目的片段l1用高保真dna聚合酶扩增，其余目的片段均用q5酶进行扩增。

pcr反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳对所有pcr产物进行检测，紫外线下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，切碎，并参照dna凝胶回收试剂盒说明书，对扩增的目的片段进行回收，按照peasytm-bluntcloningkit说明书进行，将回收的产物与peasytm-blunt克隆载体放置于1.5ml的指形管中连接(片段l1的胶回收产物与pcr2.1载体连接)，每管加入30μltrans-t1感受态细胞，轻轻混匀，立即放入冰中，冰浴30min；42℃水浴锅中热激30s，放置冰上冷却5min；加入600μllb培养基，37℃摇床上按照200r/min的转速振荡1h，取出后5000r/min离心5min；剩余约100μl上清，将沉淀重悬后涂布在含氨苄青霉素的lb平板上，37℃温箱倒置培养12～16h；次日挑选5个单菌落分别接种含氨苄青霉素的lb液体培养基培养过夜。按照peasytm-bluntcloningkit说明书提供的方法，用通用引物m13f和m13r通过pcr方法进行鉴定。pcr鉴定阳性的克隆送至安徽通用公司测序。测序正确的克隆分别命名为t-r1、t-r2、t-r3、t-v1、t-v2、t-np、t-p、t-l1、t-l2、t-l3。

对ndv/hr09全长基因组进行分段扩增，获得共6个dna片段，经鉴定，片段大小与预期一致(如图2)。

2.ndv/hr09株全基因组cdna转录载体的构建

ndv/hr09全基因组各片段重组质粒的提取：将含有各目的片段克隆的母液分别接种含氨苄青霉素的lb培养基进行培养，利用endofreeplasmidmidikit，按照使用说明书提取质粒，并进行浓度和纯度的测定。

ndv/hr09基因组5’端及3’端的连接：质粒t-v1和t-v2经notⅰ和mluⅰ双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下分别回收2300bp和6100bp左右的目的片段，t4连接酶连接后，转化感受态细胞，鉴定阳性的克隆命名为t-v。质粒t-v用bsmbi酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收4500bp片段，转录载体tvt7r(0.0)用bbsi酶切电泳后回收3100bp片段，利用t4连接酶连接，转化感受态细胞，鉴定阳性的克隆命名为tvt-v。

ndv/hr09基因组tm(2296nt～13048nt)的连接：以质粒t-r1和t-r2为模板，r1-f/r2-r为引物，overlappcr扩增r12片段，预期片段大小为4519bp。扩增片段连接pcr2.1克隆载体，转化感受态细胞，挑取载体speⅰ位点位于r12片段下游的克隆测序。正确的克隆命名为t-r12。

用限制性内切酶bsmbⅰ和speⅰ分别对质粒t-r12和t-r3进行双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下分别回收8500bp和2800bp左右的目的片段，t4连接酶连接后，转化感受态细胞，鉴定阳性的克隆命名为tr123。

质粒tr123与tl2经speⅰ和fspaⅰ双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收12300bp和3500bp左右的片段，t4连接酶进行连接，转化感受态细胞，菌液pcr以及酶切鉴定阳性克隆，命名为tm。

含ndv/hr09株全基因组cdna的转录载体的获取：质粒tm与tvt-v分别经apaⅰ和mluⅰ双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收10kb和9kb左右的条带，t4连接酶连接后，转化感受态细胞。从而构建了含有ndv基因组cdna全长的转录载体pndv/hr09。

ndv/hr09株全基因组cdna转录载体的鉴定：对转录载体通过酶切鉴定。经分析转录载体上的酶切位点分布，利用限制性内切酶hpaⅰ酶切鉴定，电泳检测酶切条带是否与预期条带大小一致。酶切体系为：灭菌超纯水12μl、hpaⅰ1μl、cutsmart2μl、质粒dna5μl(1μg)。

构建好的ndv/hr09全基因组cdna转录载体经酶切鉴定，hpaⅰ酶切后获得2个条带，即4949bp和13348bp，电泳结果和预期一致(图3)。

3.辅助质粒的构建与鉴定

辅助质粒pci-np构建：在基因组103nt-1643nt位设计引物，扩增np基因，该片段5’端添加xbaⅰ酶切位点，连接peasytm-blunt克隆载体。测序结果正确的克隆经xbaⅰ和notⅰ双酶切后，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收1500bp左右的条带，用t4连接酶连接到同样经xbaⅰ和notⅰ双酶切的pci-neo载体中，转化感受态细胞，pcr以及酶切鉴定阳性克隆，命名为pci-np。

辅助质粒pci-p构建：在基因组1874nt-3096nt位设计引物，扩增p基因，该片段5’端添加xbaⅰ酶切位点，连接peasytm-blunt克隆载体。测序结果正确的克隆经xbaⅰ和notⅰ双酶切后，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收1200bp左右的条带，用t4连接酶连接到同样经xbaⅰ和notⅰ双酶切的pci-neo载体中，转化感受态细胞，pcr以及酶切方法鉴定阳性克隆，命名为pci-p。

辅助质粒pci-l构建：质粒t-l2经fspai和notⅰ酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收3500bp左右的条带，用t4连接酶连接到同样经fspai和notⅰ酶切后线性t-l1中，转化感受态细胞后，鉴定到的阳性克隆命名为t-l12。

质粒t-l12与t-l3经mluⅰ和notⅰ双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收8500bp和2000bp左右的片段，t4连接酶进行连接，转化感受态细胞，pcr以及酶切方法鉴定阳性克隆，命名为t-l123。

质粒t-l123经speⅰ和notⅰ双酶切后，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收6600bp左右的条带，连接到同样经xbaⅰ和notⅰ双酶切的pci-neo载体中，t4连接酶进行连接，转化感受态细胞，pcr以及酶切方法鉴定阳性克隆，从而构建成辅助质粒pci-l。

辅助质粒的鉴定：pci-np、pci-p和pci-l三个真核表达质粒与微型基因组tvt-lgt共转染bsr-t7/5细胞48h后，在倒置荧光显微镜下观察是否能看到gfp基因的表达。细胞转染方法参考x-tremegenehpdnatransfectionreagent说明书。

pci-np、pci-p和pci-l三个真核表达质粒与微型基因组tvt-lgt共转染bsr-t7/5细胞48h后，在倒置荧光显微镜下能看到gfp基因的表达(图4)，说明pci-np、pci-p和pci-l在bsr-t7/5细胞中均能得到表达，能与微型基因组形成rnps结构，从而启动微型基因组的复制和转录。

4病毒拯救与反向遗传平台建立

细胞和转染用质粒的准备：转染用的bsr-t7/5细胞用1mg/ml的g418进行预筛选培养，于转染前一天将5×10⁵的细胞接种于35mmdish中，约60％～80％铺满时用于转染。转染时用到的所有质粒(tvt/lgt、pndv/hr09、pci-np、pci-p、pci-l)均用endofreeplasmidmidikit提取，提取完测定其浓度和纯度，浓度在0.1μg/μl以上并且纯度在1.8～2.0(od260/280)，＞2(od260/230)的质粒用于转染，质粒提取方法按照endofreeplasmidmidikit说明书进行。

共转染：将ndv基因组cdna全长的转录载体pndv/hr09和三个辅助质粒(pci-np、pci-p、pci-l)共转染准备好的bsr-t7/5细胞，转染60h后将转染样品用封口膜封好，转移到-70度冰箱反复冻融3次，然后将转染细胞刮下，与细胞上清充分混合后接种9～11日龄spf鸡胚，0.4ml/枚，37℃培养。定时观察鸡胚状态，弃去24h内非正常死亡的鸡胚。96h后将鸡胚置于4℃冰箱，待鸡胚血管收缩后，收集鸡胚尿囊液。

病毒鉴定：ha的测定：收集接胚尿囊液，用新鲜制备的1％鸡红细胞按照oie标准进行ha测定。将ha检测阳性的鸡胚尿囊液继续在spf鸡胚上连传2代，收集尿囊液提取病毒的rna，配置反转录体系进行反转录并灭活后，以其作为模板，用测序的特异性引物9(nd-9)，扩增ndv部分l基因区域长度约1892bp(12362nt～14253nt)，根据突变出的mlui(13048nt)的碱基变化，以确定是否拯救出病毒。获救病毒的耐热性、生物特性参照前述的方法进行。

转染样品接胚后，第一代鸡胚在80h左右死亡，进行血凝试验有血凝性，获救病毒命名为ndv/rhr09，并在spf鸡胚上继续传2代。收取第3代的鸡胚尿囊液，采用rt-pcr的方法进行检测，根据基因组标志的标记分子，进行最终确定。测序结果表明，基因组第13048位的碱基由g变成了a(图5)，证明病毒的基因组源于转录载体ndv/rhr09。结果也证明基因viii型ndv/hr09株反向遗传平台构建成功。

二、f基因突变致弱病毒的拯救

1.引物设计与合成

通过引物经overlappcr方法，将重组病毒pndv/hr09的f基因裂解位点处的核苷酸进行突变，从而使相应编码的氨基酸由r¹¹²-r-q-k¹¹⁵-r-f¹¹⁷变为弱毒特征的氨基酸序列：g¹¹²-r-q-g¹¹⁵-r-l¹¹⁷，突变后的质粒命名为prndv/hr09，引物均由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。引物序列如下：

rr1-r:5’-aaggcgcccctgtccccccccaccagatgtag-3’(seqidno.24)

rr2-f:5’-gggggacaggggcgccttataggtgccgttattg-3’(seqidno.25)

2.片段rr1和片段rr2的克隆与测序

以上述获得的重组质粒tr-12为模板，以r1-f(见表6)/rr1-r，rr2-f/r2-r(见表6)为引物，扩增获得片段rr1和片段rr2。25μlpcr反应体系为：灭菌超纯水15.75μl，5×q5buffer5μl，dntps(2.5mmol/l)2μl，上游引物(10μmol/μl)0.5μl，下游引物(10μmol/μl)0.5μl，模板1μl，q50.25μl。

pcr反应循环参数为：98℃预变性30s，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸2min。

pcr反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳对所有pcr产物进行检测，紫外线下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，切碎，并参照dna凝胶回收试剂盒说明书，对扩增的目的片段进行回收，按照peasytm-bluntcloningkit说明书将回收产物与peasytm-blunt克隆载体放置于1.5ml的指形管中连接(片段l1的胶回收产物与pcr2.1载体连接)，每管加入30μltrans-t1感受态细胞，轻轻混匀，立即放入冰中，冰浴30min；42℃水浴锅中热激30s，放置冰上冷却5min；加入600μllb培养基，37℃摇床上按照200r/min的转速振荡1h，取出后5000r/min离心5min；剩余约100μl上清，将沉淀重悬后涂布在含氨苄青霉素的lb平板上，37℃温箱倒置培养12～16h；次日挑选5个单菌落分别接种含氨苄青霉素的lb液体培养基培养过夜。按照peasytm-bluntcloningkit说明书方法，用引物m13f和m13r通过pcr方法进行鉴定。pcr鉴定阳性的克隆送公司测序。测序正确的克隆分别命名为t-rr1和t-rr2。

3.致弱病毒全基因组cdna转录载体的构建

以t-rr1和t-rr2扩增片段为模板，分别用r1-f/rr1-r，rr2-f/r2-r为引物，overlappcr扩增rr12片段，预期片段大小为4519bp。反应体系为50μloverlappcr体系：灭菌超纯水36.5μl，10×transtaqhifibuffer5μl，dntps(2.5mmol/l)4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，t-rr1扩增片段1μl，t-rr2扩增片段1μl，transtaqhifidnapolymerase(5u/μl)0.5μl。pcr反应循环参数：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min。

扩增片段连接pcr2.1克隆载体，转化dh5α感受态细胞，挑取载体speⅰ位点位于r12片段下游的克隆测序。正确的克隆命名为t-rr12。

其余构建过程同第一部分，最终构建获得病毒基因组cdna全长转录载体，命名为pndv/rahr09。

4.致弱毒株的拯救和毒力鉴定

将上述获得的转录载体pndv/rahr09和三个辅助质粒(pci-np、pci-p、pci-l)共转染准备好的bsr-t7/5细胞，转染方法同第一部分。

转染12h后，每个dish中加入10％的无菌尿囊液。转染60h后将转染样品用封口膜封好，转移到-70度冰箱反复冻融3次，然后将转染细胞刮下，与细胞上清充分混合后接种9～11日龄spf鸡胚，0.4ml/枚，37℃培养。定时观察鸡胚的状态，弃去24h内非正常死亡的鸡胚。96h后将胚置于4℃冰箱，待鸡胚血管收缩后，检测血凝(ha)效价并收集尿囊液，继续传代。

将ha检测阳性的鸡胚尿囊液继续在spf鸡胚上传2代，收集尿囊液并提取病毒的rna，反转录后，以其作为模板，用测序的特异性引物4(nd-4)，扩增病毒f基因区域部分序列长度约1755bp(4098nt～5872nt)，根据f基因裂解区域碱基的变化，以确定是否拯救出病毒。

获得的致弱毒株命名为ndv/rahr09，进行生物学特性(mdt、icpi)鉴定。将含毒尿囊液滴度稀释至10^-3后，接种cef细胞，48h后在显微镜下观察细胞病变情况，同时设母本毒株作为对照。

获救病毒采用rt-pcr的方法检测f基因裂解位点序列变化情况。经测序表明，f基因裂解区域碱基均发生了与设计方案一致的改变。

获救病毒ndv/rahr09稀释后，分别测定mdt和icpi，结果显示，mdt值>120h；icpi值为0.057。综合判定标准说明获救病毒的毒力符合弱毒株的标准。

将母本病毒hr09与致弱病毒ndv/rahr09同时感染cef细胞48h后观察细胞病变发现，接种致弱病毒的cef细胞未出现细胞病变，而接种母本病毒的细胞则出现拉网和脱落现象，形成明显的空斑。说明拯救出的病毒的f蛋白在cef上不能有效裂解，从而说明其毒力已经明显减弱，病毒致弱成功。

三、替换lasota株hn基因重组病毒的拯救

1.lasota株的hn基因的扩增

根据上述已经建立的反向遗传平台中hn基因的位置(见图1)，将lasota株hn基因分为b和c片两个片段，分别设计2对引物进行扩增，引物序列如下：

r2-b-f引物：ctaatagcagactccagtcatggaccgcgccgttag(seqidno.26)

r2-b-r引物：ctcagtatttaacaatgccaacgg(seqidno.27)

r3-c-f引物：gtgaccttggctatatctgtag(seqidno.28)

r3-c-r引物：ctagccagacctggcttctctaacc(seqidno.29)

50ulpcr扩增反应体系为：buffer10μl；dntp(2.5)4μl；f/r引物(10μm)2μl；cdna1.5μl；q5酶0.5μl；h2o至50μl。反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性8s，52℃退火30s，72℃延伸，进行30个循环；72℃延伸2min。

pcr反应结束后，利用1.2％琼脂糖凝胶电泳对lasota的hn片段pcr产物进行检测，紫外线下切下含有目的片段(分别约0.3kb和1.6kb)的琼脂糖凝胶，切碎，并参照axyprepdnagelextractionkit说明书的方法对扩增的目的片段分别进行回收。

2.质粒r2和r3片段的构建

重新构建上述反向遗传平台中的r2和r3质粒，构建模式见图6。

(1)r2片段的构建

以上述t-r2质粒为模板扩增出a片段,引物序列如下：

r2-a-f:aagctgttggcacctttcttct(seqidno.30)

r2-a-r:gactggagtctgctattagtgatg(seqidno.31)

反应体系与反应条件同上。

pcr反应结束后，利用1.2％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行检测，紫外线下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，切碎，并参照axyprepdnagelextractionkit说明书的方法对扩增的目的片段约1.4kb进行回收。

overlappcr连接r2的a和b片段:分别以a和b片段为模板，上游引物为表1中的r2-f，下游引物为上述r2-b-r，通过pcr连接a和b片段。

反应体系与反应条件同上。

pcr反应结束后，利用1.2％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行检测，紫外线下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，切碎，并参照axyprepdnagelextractionkit说明书的方法对扩增的目的片段约2.6kb进行回收。

pcr产物按照peasy^tmbluntcloningkit说明书方法进行连接反应。连接产物常规方法转化trans-t1感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的lb平板上，37℃温箱倒置培养14h,挑选单克隆菌落分别进行pcr鉴定，将鉴定正确的阳性菌液送测序进一步验证。将验证正确的r2片段菌液接种含氨苄青霉素的lb液体培养基培养过夜。次日提取r2片段的质粒，-20℃保存。

(2)r3片段的构建

以上述已构建的t-r3质粒为模板扩增出d片段,引物序列如下：

r3-d-f引物：gaagccaggtctggctaggaaattagatctggctggc(seqidno.32)

r3-d-r引物：catctttggtgcgcacatctg(seqidno.33)

反应体系和反应条件参考上述。

pcr反应结束后，利用1.2％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行检测，紫外线下切下含有目的片段(大小约1.4kb)的琼脂糖凝胶，切碎，并参照axyprepdnagelextractionkit说明书的方法对扩增的目的片段进行回收。

通过overlappcr连接r3的c和d片段

pcr反应条件参考上述。

pcr反应结束后，利用1.2％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行检测，紫外线下切下含有目的片段(约2.8kb)的琼脂糖凝胶，切碎，并参照axyprepdnagelextractionkit说明书的方法对扩增的目的片段进行回收。

pcr产物常规方法进行连接反应。连接产物转化trans-t1感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的lb平板上，37℃温箱倒置培养14h,挑选单克隆菌落分别进行pcr鉴定，将鉴定为正确的阳性菌液送测序进一步验证。将验证正确的r3片段菌液接种含氨苄青霉素的lb液体培养基培养过夜。次日提取r3片段的质粒，-20℃保存。

3.重组病毒全长质粒的构建

重组病毒全长质粒构建模式如图7。

参考前述构建全长质粒的方法，将构建好的r2、r3片段与r1连接形成r123片段，再与l2片段连接形成r123l2(tm)片段(质粒),将质粒tm与前述构建的tvt-v质粒分别经apaⅰ和mluⅰ双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下分别切取大小约10kb和9kb的目的片段并回收，将回收后的产物用t4dna连接酶14℃连接过夜，反应条件参考上述，转化trans5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的lb平板上，37℃温箱倒置培养14h,挑选单克隆菌落分别进行pcr鉴定，将鉴定大小正确的阳性菌液送测序进一步验证，将验证正确的菌液接种含氨苄青霉素的lb液体培养基培养过夜，提取质粒命名为pndv-rhr09-lasota-hn，-20℃保存备用。

4.重组病毒的拯救与鉴定

步骤与方法同前述。

将ha检测为阳性的尿囊液在spf鸡胚上传两代后，收集尿囊液抽提病毒的rna，通过rt-pcr扩增出hn基因，连接t3载体，挑取阳性菌液送去测序鉴定。

经鉴定，获得重组病毒序列正确，命名为ndv-rhr09-lasota-hn，它的全基因组基序列如seqidno.1所示。

四、ndv-rhr09-lasota-hn株毒力鉴定与免疫保护试验

将重组病毒ndv-rhr09-lasota-hn株按标准方法稀释后接种spf鸡胚，分别测定mdt、icpi和ivpi。

mdt的测定：用灭菌的生理盐水连续10倍稀释成10^-6～10^-9，每个稀释度的病毒液经尿囊腔接种5枚9～10日龄的spf鸡胚，0.1ml/枚，37℃培养7d。每间隔12h观察一次，连续观察7d，每次观察都记录鸡胚死亡的时间。按下列公式计算mdt的值。

icpi的测定：取ha效价大于24的新鲜病毒尿囊液使用不含抗生素的灭菌pbs做10稀释后，采用脑内接种10只1日龄spf雏鸡，50μl/只。同时设立阴性对照组，阴性对照组使用pbs进行脑内接种。每天观察鸡群发病和死亡情况，连续观察8d。正常计0分，发病计1分，死亡计2分，按下列公式计算icpi的值。

结果显示，重组病毒ndv-rhr09-lasota-hn株mdt值大于120h，icpi值为0.026。与前述单独f基因致弱获得毒株比较，icpi值降低，说明病毒的毒力减小。

将ndv-rhr09-lasota-hn株与常规疫苗毒株lasota进行免疫对比较试验，与对照组一起共设4个组，每组12只spf鸡，1日龄进行10⁶eid50的剂量肌注免疫接种，免疫3周后以流行的基因vii型zj1毒株按10⁵eid50剂量进行攻毒，每周分别测定各组鸡的hi抗体效价，统计各组攻毒后鸡的病死率，结果证明本发明毒株抗体产生比对照组水平高，并具有完全的免疫保护(保护率100％)。具体的试验分组接种与hi检测情况见表2、表3。

表2免疫试验方案

表3试验组hi抗体效价和攻毒存活率情况

sequencelisting

<110>扬州大学

<120>一种重组基因viii型新城疫病毒弱毒株

<130>

<160>33

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>15210

<212>dna

<213>新城疫病毒ndv-rhr09-lasota-hn

<400>1

accaaacagagaatctgtgaggtacgataaaaggcgaagaagcaatcggaatcgtacggg60

tagaaggtgtgaacctcgagtgcgaggccgaagctcaaactagagggagccttctaccaa120

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taacagtgacgatccagaagatagatggaattttgcggtattctgtcttcggattgctgt300

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tactctggaaagaatcttatctatccaggctcaagtatgggtcacagtagcaaaggctat660

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taatcttgcacttaacgtcactattgatgtggaggtggacccgaagagcccattggtcaa3960

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tcctatagcaaatgcctctccccaggttgctaaaatactctggagtcaaactgcacatct4260

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