一种将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法与流程

本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种将外周血免疫γδt细胞诱导成多能干细胞的方法。

背景技术：

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。t细胞为免疫细胞的一种，根据t细胞表面受体(tcrs)的不同可将t细胞分为αβt细胞和γδt细胞。αβt细胞表面受体为tcr2(t细胞表面受体2)，它在外周血单核细胞(pbmc)中的含量为65-75％，αβt细胞中cd4+的占60％，cd8+占30％，cd4+cd8+不到1％，αβt细胞根据其表面标记cd4+和cd8+分别受mhcⅱ类分子和mhcⅰ类分子限制，需要抗原递呈细胞进行抗原递呈才能发挥免疫效应应答，这类t细胞也是目前免疫治疗中应用最广泛的细胞，例如car-t治疗和细胞毒性t细胞(ctl)治疗等；γδt细胞与αβt细胞不同，其表面受体为tcr1(t细胞表面受体1)，该类型受体不受mhc分子限制，cd4与cd8的表达均为阴性。

γδt细胞优于淋巴因子激活的杀伤细胞，具有广谱杀肿瘤和病毒的作用。但是γδt细胞在外周血pbmc中仅占不到10％，并且γδt细胞在传统方法的体外扩增过程中其扩增能力与杀伤会随之减弱，出现明显的由于因子诱导的扩增细胞效用耗尽的现象。为了克服传统的t细胞在制备生产中的这些问题，人们尝试将t细胞诱导为多能干细胞t-ipsc，其拥有相同的t细胞受体(tcr)基因作为其原始t细胞，这为抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)提供了几乎无限的来源。然而，这些技术主要集中在αβt细胞上，并且需要大量抗原特异性ctl，它们通过hla肽多聚体的细胞分选纯化，作为原始的ips细胞。

目前国内外临床上用于辅助治疗及医疗保健中的免疫t细胞在商品化大规模生产中存在诸多缺陷，如t细胞在传统方法的体外扩增过程中其扩增能力与杀伤会随之减弱，出现明显的由于因子诱导的扩增细胞效用耗尽，传统αβ来源的ctl受mhc限制，而γδt在外周血中含量低，纯化扩增困难的问题，并且在αβt细胞诱导为ipsc技术上存在，需要大量抗原特异性ctl，还要通过hla肽多聚体的细胞分选纯化，作为原始的ips细胞等难题。

技术实现要素：

针对于目前国内外临床上用于辅助治疗及医疗保健中的免疫t细胞在商品化大规模生产中的诸多缺陷，本发明提供了一种高效、方便的产生包含tcrg和tcrd基因区重排而不需要进行细胞分选的ipsc(γδt-ipsc)生产方法。

具体地，本发明提供了一种用于将外周血免疫γδt细胞诱导成多能干细胞的方法，包括以下步骤：

1)用密度梯度离心法分离外周血单核细胞(pbmc)；

2)用唑来膦酸和白细胞介素-2活化培养所述外周血单核细胞，从而获得γδt细胞；

3)用仙台病毒载体将胚胎干细胞相关基因转移到所述γδt细胞中，从而引入可诱导其转变成多能干细胞的重编程因子；

4)用灭活的人皮肤成纤维滋养层细胞共培养所述γδt细胞，促进其转变成诱导性多能干细胞(ipscs)；

5)待所述γδt细胞转变成ipscs后，用胚胎干细胞培养基培养。

进一步，步骤1)的具体操作过程为：

①用淋巴细胞分离液将全血血液离心分离，分别收集其中的血浆层和白膜层；优选地，所述淋巴细胞分离液为ficoll淋巴细胞分离液；优选地，离心的转速为380-420g，离心时间为25-35分钟；进一步优选地，将全血血液缓慢地加入所述淋巴细胞分离液的表面，以保持清楚的界面，可以沿试管壁滴加所述全血血液；

②用生理盐水清洗白膜层，然后离心收集白膜层细胞；所述白膜层细胞中主要为pbmc；优选地，所述离心的转速为1500-1800rpm，离心时间为8-12min；

③用收集的血浆重悬所述白膜层细胞。

进一步，步骤2)的具体操作过程为：将所述白膜层细胞接种至含有唑来膦酸的dmem-f12培养基中，在恒温37℃，co2浓度为5％的条件下培养20-28小时后加入白细胞介素-2，继续培养10天以上，获得γδt细胞。

优选地，所述接种的密度为1×10⁶-2×10⁶/ml；所述唑来膦酸的浓度为3-7μm；优选地，所述dmem-f12培养基中还含有knockout血清替代物，其浓度优选为8-12％(v/v)；优选地，加入所示白细胞介素-2的浓度为80-120iu/ml。

进一步，步骤3)的具体操作过程为：将培养获得的γδt细胞用γδt完全培养基继续培养3-5天，然后用γδt完全培养基重悬所述γδt细胞，将细胞浓度调整为2.5×10⁶–5×10⁶/ml，在0.9-1.1ml待诱导的细胞悬液中加入cytotun-ips仙台病毒重编程序试剂盒中的三种yamanaka四因子病毒：klf4&oct4病毒、sox2病毒与c-myc病毒，诱导20-28小时。

其中，所述γδt完全培养基的配方如下：

stempro34无血清培养基为基础培养基，其中含有体积比为2.5％的stempro-34营养补充剂、100ng/ml的重组人干细胞因子scf、100ng/ml的fms相关酪氨酸激酶3配体、20ng/ml的il-3和10ng/ml的il-6。

优选地，加入klf4&oct4病毒的量为moi＝3，加入sox2病毒的量为moi＝5，加入c-myc病毒的量为moi＝5。

优选地，诱导20-28小时后的细胞，离心清洗后去除诱导液，然后用所述γδt完全培养基继续培养1-3天。

进一步，步骤4)的具体操作过程为：用stempro34无血清培养基将所述γδt细胞移入铺了灭活的人皮肤成纤维滋养层细胞的培养瓶中，接种密度为2-8×10⁴/ml，培养2-4天后将细胞悬液移出，离心去除原培养基，更换新的stempro34无血清培养基，并置于新的不含滋养层细胞的培养瓶中继续培养1-2天。

优选地，所述灭活的人皮肤成纤维滋养层细胞是用紫外光照30分钟以上灭活的。

进一步，步骤5)的具体操作过程为：先移去一半的stempro34无血清培养基，换为胚胎干细胞培养基，培养1-2天，将所有培养基替换为胚胎干细胞培养基，继续培养。

优选地，所述胚胎干细胞培养基为essential8培养基。

本发明具有以下有益技术效果：

本发明用唑来膦酸和白细胞介素-2活化人外周血单核细胞(pbmc)来培养γδt细胞；用仙台病毒载体将胚胎干细胞相关基因转移到这些细胞中，在受激pbmc培养中引入重编程因子使我们能够建立ipsc细胞系。从而提供了一种可用于商品规模化生产t细胞种子细胞γδt-ipsc的ppc(programmablepluripotentcells，可编程多能细胞)生产方法。

本发明生产的γδt-ipsc可分化为造血祖细胞。这种新技术将为新型免疫治疗的新途径铺平道路，可以应用于各种类型的癌症。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1为用流式检测技术对培养的γδt细胞进行鉴定的结果，其中cd3+vγ9+双阳性率为81.6％；

图2为用因子刺激pmbc后第0天和第13天时，γδt细胞的状态照片；

图3为诱导第8天胚胎干细胞样克隆与总克隆的比值；

图4为诱导第8天用rt-qpcr检测诱导后ipscs中yamanaka因子的表达与pbmc的比较，其中parental(p5)为父母克隆第5代细胞，sub(p15)为附属克隆第15代细胞，490b2为胚胎干细胞系细胞作为阳性对照，pbmc为外周血单核细胞，dh2o作为阴性对照，循环数为27。

具体实施方式

(1)pbmc的分离：

在预先加入3mlficoll淋巴细胞分离液(以下简称ficoll)的15ml离心管中以10ml注射器组合1ml注射器针头，将5ml血液缓慢加入上述离心管内(沿壁注射，保持分层)；转速400g、升速9、降速0，离心30min；用3ml无菌滴管将离心液的上层血浆取出，转移至50ml离心管中(所有血浆并入同一离心管)；用3ml无菌滴管取白膜层及其上层的残留血浆和少量下层ficoll，转移至50ml离心管中(每4个15ml离心管的白膜层并入一个50ml离心管)；向每个50ml离心管中补加生理盐水至45ml刻度，摇晃、振荡混匀，转速1800rpm、升速9、降速9，离心10min；弃上清，用残留液体振荡后多管并为一个50ml离心管，用少量生理盐水洗原50ml离心管，清洗液体也转移至同一个离心管内，后补加生理盐水至45ml刻度，摇晃、振荡混匀，1800rpm，离心10min；弃上清，以(原血量/10)ml血浆重悬，吹打混匀后取100μl计数。

(2)γδt细胞的激活与培养：

分离出pmbc后，将其接种至含有5μm的唑来膦酸(novartis，basel，switzerland)和10％(v/v)ksr(knockout^tmserumreplacement，gibco)及1/1000双抗的dmem-f12(gibco)中，细胞接种密度为1×10⁶/ml，在恒温37℃，co2浓度为5％的条件下培养，培养24小时后加入100iu/ml的il-2。

(3)γδt细胞鉴定：

通过流式检测技术，取适量培养至第4天的免疫细胞液吹打混匀，以无菌的d-hanks液清洗细胞2-3次，用不含血清的rpmi-1640重悬细胞，调整浓度为1×10⁶-3×10⁶/ml，将细胞重悬液分装至1.5ml离心管(100μl/管)中，加入pe-anti-cd3(bdpharmingen，sandiego，ca，563423)、fitc-anti-tcrvγ9(beckmancoulter，brea，ca，im1463)、apcanti-cd34(biolegend，sandiego，ca，343608)抗体(1μl/test)，冰上孵育1h，用400μl不含血清的rpmi-1640重悬细胞，流式检测结果如图1所示。

(4)γδt细胞诱导为ipscs：

取适量培养至第13天的免疫细胞液，将团块吹打分散后取100μl，显微镜(×100)下观察、拍照，如图2所示，γδt细胞状态良好。将细胞以1800rpm的转速离心10min；弃上清，重悬于γδt完全培养基，所述γδt完全培养基的配方如下：

向stempro34无血清培养基(stempro-34sfm，gibco，cat.no.10639-011)中加入终浓度为2.5％(v/v)的stempro-34营养补充剂(stempro-34nutrientsupplement，gibco，cat.no.a14059)、100ng/ml的重组人干细胞因子scf(c-kitligand，gibco，cat.no.phc2111)、100ng/ml的fms相关酪氨酸激酶3配体(flt-3ligand，gibco，cat.no.phc9414)、20ng/ml的il-3(gibco，cat.no.phc0034)和10ng/ml的il-6(gibco，cat.no.phc0065)。

37℃培养4天后，用cytotun-ips仙台病毒重编程序试剂盒(cytotun-ips2.0sendaireprogrammingkit，gibco，a16517)进行诱导，具体步骤如下：

i.将γδt细胞离心，更换新的完全培养基，调整细胞浓度为2.5×10⁶–5×10⁶/ml；

ii.每份诱导细胞数量控制在1×10⁶个，将含有病毒的cytotune仙台试管(cytotunesendaitubes)从深低温冰箱中取出，37℃水浴10分钟；

iii.在1ml待诱导的细胞悬液中加入试剂盒中的三种yamanaka四因子病毒：klf4&oct4病毒(moi＝3)，sox2(kos)病毒(moi＝5)与c-myc病毒(moi＝5)，将细胞与诱导液混匀后，室温2250rpm离心30分钟，将沉淀重悬于同样的诱导液中，再加入1mlγδt完全培养基，该步骤可以大大提高诱导率；

iv.诱导24小时后，200g离心10分钟，并用pbs清洗2-3遍，重悬于完全培养基，培养2天；

v.第3天将细胞200g离心10分钟，重悬于不含因子的stempro-34无血清培养基中，移入铺了紫外灭活30分钟的人皮肤成纤维滋养层细胞的培养瓶中，接种密度为5×10⁴/ml，培养3天；

vi.第6天将细胞悬液移出置于新的不含滋养层细胞的培养瓶中，200g离心10分钟去上清，换新的不含因子的stempro-34无血清培养基，培养1天；

vii.第7天，移去一半的stempro-34无血清培养基，换为胚胎干细胞培养基(essential8medium，gibco，cat.no.a1517001)；

viii.第8天将所有培养基换为胚胎干细胞培养基，培养7天后检测，检测结果如图3所示，图3显示了两个培养瓶中培养的胚胎干细胞的状态，其中的数值为胚胎干细胞样克隆数与总克隆数的比值，图4为27个循环的rt-qpcr检测诱导后ipscs中yamanaka因子的表达与pbmc的对照，由图中可知，oct3/4、nanog、sox2三种蛋白在pbmc中都不表达，而在诱导后的ipscs中的表达量都与阳性对照490b2中相当。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。